動物分子生物學(xué)課件：第九章 核酸的序列測定技術(shù)

第九章核酸的序列測定技術(shù)

DNASequencing什么是測序(sequencing)？為什么要測序？怎么測序？確定一條染色體或者某一片斷上的堿基順序了解堿基的排列順序;闡明基因堿基排列的規(guī)律傳統(tǒng)測序技術(shù)及基于此原理發(fā)展而來的高通量測序新技術(shù)

SangerC.“＋,—”法MaxamGilbert.

化學(xué)測序法

SangerC.ddNTP法(雙脫氧法)第一節(jié)傳統(tǒng)的DNA測序技術(shù)熒光標(biāo)記測序（商業(yè)化測序）1998.Ronagi.焦磷酸法大多數(shù)測序方法是基于PCR的基礎(chǔ)上PCR（polymeraseChainReaction）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。反應(yīng)所需物質(zhì)：DNA模板，引物，DNA聚合酶，dNTP,緩沖液。每個循環(huán)包括：變性（94℃），退火（50-65℃）和延伸（72℃）。

體內(nèi)DNA的復(fù)制DNA聚合酶

dNTP解旋酶類引物5’

3’加熱變性復(fù)性復(fù)溫DNA的變性和復(fù)性加熱或強(qiáng)酸、堿性作用可以使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂,雙鏈解離,形成單鏈DNA,這稱為DNA的變性。解除變性的條件后,變性的單鏈可以重新結(jié)合起來,形成雙鏈,其原有的特性和活性可以恢復(fù),這稱DNA復(fù)性,也叫退火。

PCR擴(kuò)增原理延伸變性、退火5’3’5’3’3’5’變性退火3’5’延伸溫度（℃）時間（min）94726094℃變性（1min）60℃退火（1min）72℃延伸（1.5min）循環(huán)1循環(huán)2循環(huán)3PCR反應(yīng)的溫度循環(huán)周期PCR反應(yīng)的每一個溫度循環(huán)周期都是由DNA變性、引物退火和反應(yīng)延伸三個步驟完成的。如此周而復(fù)始，重復(fù)進(jìn)行，直至擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量滿足實(shí)驗需求為止。PCR的產(chǎn)量每一次循環(huán)后模板比前一次循環(huán)增加一倍。DNA產(chǎn)量以指數(shù)上升，n個循環(huán)后，達(dá)到2n拷貝。PCR反應(yīng)的基本過程1.加減法測序在做“加法體系”和“減法體系”以前的工作：

待測DNA的單鏈作為模板，引物，四種dNTP（用同位素標(biāo)記）。DNA聚合酶從引物開始合成新鏈，產(chǎn)生各種長度的合成產(chǎn)物。隨后將合成產(chǎn)物分成兩部分。一部分用于加法系統(tǒng)，一部分用于減法系統(tǒng)。加法系統(tǒng)：將產(chǎn)物再分成四小份，每一小份中僅加入一種dNTP，比如僅加入dATP。由于DNA聚合酶具有3′-5′的外切酶活性，而反應(yīng)體系中缺少另外三種必要的dNTP，合成產(chǎn)物就從3′-5′方向降解。然而由于存在dATP，顯然遇到dA的位置降解反應(yīng)就停止了。因而所有的片段都是以A結(jié)尾的。同理，可以分別制備以C、G或T結(jié)尾的另外三組片段。四組片段在同一塊凝膠板的不同樣品槽中同時電泳，從放射自顯影圖上就可以推斷出堿基序列。

【加法系統(tǒng)實(shí)際就是以降解為條件，以DNA聚合酶的3′-5′外切酶活性為基礎(chǔ)，當(dāng)降解過程遇到試劑中所富含的dNTP時，反應(yīng)就停止】減法系統(tǒng)：也是將產(chǎn)物分成四小份，每一小份中只加入三種dNTP，比如缺少dATP。在這個反應(yīng)體系中，DNA聚合酶能夠把片段繼續(xù)合成下去，但是在遇到應(yīng)該是dATP參入的位置時，合成反應(yīng)就停下來了。這就可以得到一個都是以A前一個位置為結(jié)尾的片段組，電泳后同樣可以定出A的位置。

【減法系統(tǒng)實(shí)際就是以合成為條件，當(dāng)合成過程缺少需要的dNTP時，反應(yīng)就停止】2.四組切割的方法

（1）G+A反應(yīng)：“甲酸”使A和G嘌呤環(huán)上的N原子質(zhì)子化，糖苷鍵變得不穩(wěn)定，再用“哌啶”將其斷裂，得到一系列A+G末端的DNA片段。

（2）G反應(yīng)：“硫酸二甲酯”使鳥嘌呤G的N7原子甲基化，糖苷鍵變得不穩(wěn)定，在中性環(huán)境中受熱斷裂，得到一系列G末端的DNA片段。（3）T+C反應(yīng)：“肼”使T和C的嘧啶環(huán)斷裂，DNA鏈發(fā)生斷裂，得到一系列T+C末端的DNA片段。（4）C反應(yīng)：在NaCl存在時，只有C與“肼”發(fā)生反應(yīng)，得到一系列C末端的DNA片段。3.雙脫氧末端終止法“雙脫氧末端終止法”的原理核酸模板在聚合酶、引物、四種單脫氧核苷酸存在條件下合成子鏈時，如果在四管反應(yīng)系統(tǒng)中分別按比例引入四種雙脫氧核苷酸，只要雙脫氧核苷酸摻入鏈端，該鏈就停止延長，而鏈端摻入單脫氧堿基的片段則可繼續(xù)延長。如此，每管反應(yīng)體系中便合成以共同引物為5’端，以雙脫氧堿基為3’端的一系列長度不等的核酸片段。反應(yīng)終止后，分四個泳道進(jìn)行電泳,以分離長短不一的核酸片段(長度相鄰者僅差一個堿基)，根據(jù)片段3’端的雙脫氧堿基，便可依次閱讀合成片段的堿基排列順序。

引物標(biāo)記：32P-引物5’端OH雙脫氧法改進(jìn)（熒光標(biāo)記法）：在PCR時加入熒光標(biāo)記的復(fù)制終止劑ddATP,ddTTP,ddCTP,ddGTP（相應(yīng)于4種核苷酸）ddX的兩個作用：可以當(dāng)作正常核苷酸參與復(fù)制;一旦嵌入DNA中，其后就不能再繼續(xù)連接堿基。電泳：誰終止，堿基就是誰獲1974年Nobel獎用于商業(yè)化測序（一代測序）Step1：加入復(fù)制終止劑熒光檢測探頭熒光檢測探頭熒光檢測探頭primerATCGStep2：熒光檢測DNA自動測序儀的發(fā)展自動熒光毛細(xì)管凝膠電泳測序儀代表：安瑪西亞公司MegaBACE1000

96個電泳讀長高達(dá)500-600bp

日分析能力達(dá)1000個樣品自動熒光垂直板凝膠電泳測序儀

代表：ABI公司377型垂直板自動測序儀

96個泳道讀長高達(dá)700-800bp日分析能力達(dá)300個樣品

4.焦磷酸測序(Pyrosequencing)焦磷酸測序技術(shù)是在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶(ATPsulfurytase)、熒光素酶(Luciferase)和雙磷酸酶(Apyrase)的作用下，將每一個dNTP的聚合與一次化學(xué)發(fā)光信號的釋放偶聯(lián)起來，通過檢測化學(xué)發(fā)光信號的有無以及強(qiáng)度，達(dá)到實(shí)時檢測DNA序列的目的。焦磷酸測序的原理在每一輪測序反應(yīng)中，反應(yīng)體系中只加入一種dNTP。如果它剛好能和DNA模板的下一個堿基配對，則會在DNA聚合酶的作用下，添加到子代鏈的3’末端，同時釋放出一分子的焦磷酸(PPi)。在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和5’-磷酰硫酸(adenosine-5’-phosphosulfat，APS)

結(jié)合形成ATP，ATP在熒光素酶的催化下，又可以和熒光素結(jié)合形成氧化熒光素，同時產(chǎn)生可見光。通過光檢測裝置及處理軟件可獲得一個特異的檢測峰，峰值的高低則和相匹配的堿基數(shù)成正比。如果加入的dNTP不能和DNA模板的下一個堿基配對，則上述反應(yīng)不會發(fā)生，也就沒有檢測峰。反應(yīng)體系中剩余的dNTP和殘留的少量ATP在雙磷酸酶Apyrase的作用下發(fā)生降解。待上一輪反應(yīng)完成后，加入另一種dNTP，使上述反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行，根據(jù)獲得的峰值圖即可讀取準(zhǔn)確的DNA序列信息。ATP硫酸化酶熒光素酶雙磷酸酶焦磷酸第二節(jié)短片段高通量測序新技術(shù)1.二代測序技術(shù)指高通量的測序技術(shù)，一次對幾十萬、幾百萬條DNA序列進(jìn)行測序。

二代測序技術(shù)的主要原理合成法測序：通過把大量待測定的模板DNA進(jìn)行固定，然后與通用引物進(jìn)行雜交，分別控制4種堿基在DNA引物上的延伸，通過檢測延伸堿基，實(shí)現(xiàn)高通量并行的DNA序列信息的檢測。連接法測序：通過將模板DNA兩端添加接頭后再測序。

商用代表：Illumina公司Solexa測序，Roche(羅氏)公司454測序（利用焦磷酸測序的原理，讀長超過400bp）

商用代表：ABI公司SOLiD測序（高通量）羅氏454測序的特點(diǎn)DNA樣品制備錨定橋接橋式預(yù)擴(kuò)增雙鏈DNA變性單堿基延伸測序與數(shù)據(jù)分析二代測序技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：采用高通量測序技術(shù)，使測序通量大大提高，一次可讀取幾百萬條序列，大大提高測序的效率。缺點(diǎn)：測序前大多對待測片段進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，因此增加了測序的錯誤率。另外，測序讀長比較短，不適合基因組從頭測序（denovosequencing），更適合重測序（re-sequencing）。2.三代測序技術(shù)單分子測序，直接測序，無需PCR擴(kuò)增，主要有兩大主流技術(shù)：單分子熒光測序

納米孔測序

DNA單分子熒光測序：

dNTP用熒光標(biāo)記，高分辨率的相機(jī)可以實(shí)時記錄熒光的強(qiáng)度變化。當(dāng)熒光標(biāo)記的dNTP被摻入DNA鏈的時候，它的熒光就同時能在DNA鏈上探測到。當(dāng)它與DNA鏈形成化學(xué)鍵以后，它的熒光基團(tuán)就被DNA聚合酶切除，熒光消失。納米孔測序:

使用外切酶從單鏈DNA末端逐個切割，形成單堿基，被切割的單堿基會落入納米孔，并和納米孔內(nèi)的環(huán)胡精相互作用，短暫的影響流過納米孔的電流強(qiáng)度。由于納米孔的直徑非常細(xì)小，僅允許單個核酸聚合物通過，而4種堿基的帶電性質(zhì)不一樣，通過電信號的差異就能檢測出通過的堿基類別，從而實(shí)現(xiàn)測序。

三代測序技術(shù)的商業(yè)代表1.

HelicosBioSciences公司開發(fā)的HeliScope測序儀。DNA單分子熒光測序無需對測序模板進(jìn)行擴(kuò)增，使用高靈敏度的熒光探測儀直接對單鏈DNA模板進(jìn)行合成法測序。2.英國牛津納米孔公司開發(fā)的

Nanopore：納米孔測序

高通量測序技術(shù)的應(yīng)用Denovo測序（基因組從頭測序）全基因組重測序（genomere-sequencing）轉(zhuǎn)錄組重測序（transcriptomere-sequencing）小分子RNA測序DNA甲基化分析：重亞硫酸氫鹽測序法（bisulfitesequencing）ChIP-seq（染色質(zhì)免疫共沉淀測序）ChIP-Seq染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（ChromatinImmunoprecipitation，ChIP）也稱結(jié)合位點(diǎn)分析法，是研究體內(nèi)蛋白質(zhì)與DNA相互作用的有力工具，通常用于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)或組蛋白特異性修飾位點(diǎn)的研究。將ChIP與第二代測序技術(shù)相結(jié)合的ChIP-Seq技術(shù)，能夠高效地在全基因組范圍內(nèi)檢測與組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等互作的DNA區(qū)段。ChIP-Seq的原理及應(yīng)用首先通過染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（ChIP）特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，并對其進(jìn)行純化與文庫構(gòu)建；然后對富集得到的DNA片段進(jìn)行高通量測序。通過將獲得的數(shù)百萬條序列標(biāo)簽精確定位到基因組上，從而獲得全基因組范圍內(nèi)與組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等互作的DNA區(qū)段信息。第三節(jié)基因組測序策略與人類基因組

計劃(HumanGenomeProject,HGP)于1990年10月1日正式啟動，原計劃2005年完成，但2003年4月，第一張序列草圖提前繪制成功。主要目標(biāo)有：識別人類DNA中所有基因（3萬～4萬個）；測定組成人類DNA的30億堿基對的序列；將這些信息儲存到數(shù)據(jù)庫中；開發(fā)出有關(guān)數(shù)據(jù)分析工具。主要意義有：破譯有關(guān)人類生存和繁衍的全部遺傳信息，理解人類如何作為健康人發(fā)揮正常生理功能，揭示嚴(yán)重危害人類健康的疾病機(jī)理，并最終開發(fā)基因藥物治療人類疾病。CostofHGP1stsequencingoftheHumanGenome:$3billion（30億美元）13yearstocompleteSincethen,thehumangenomewasre-sequenced50times$100million（1億美元）1.5years（1）HGP基本內(nèi)容遺傳圖譜

物理圖譜序列圖譜轉(zhuǎn)錄圖譜人類基因組4張圖譜之間的關(guān)系人類基因組物理圖譜的構(gòu)建人類基因組的物理圖譜是指以已知核苷酸序列的DNA片段(序列標(biāo)簽位點(diǎn)，sequence-taggedsite,STS)為“路標(biāo)”，以堿基對(bp，kb，Mb)作為基本測量單位(圖距)的基因組圖。STS是隨機(jī)從基因組中選擇出來的長度在100～500bp之間的單拷貝DNA序列，這些序列與核酸內(nèi)切酶識別序列相關(guān)聯(lián)。兩個STS標(biāo)簽在基因組上靠得近，它們就會一直同時出現(xiàn)在DNA大片段上；兩個STS標(biāo)簽在基因組上相距較遠(yuǎn)，它們同時出現(xiàn)在一個DNA大片段上的幾率就會小得多；物理圖的主要內(nèi)容是建立相互重疊連接的“相連DNA片段群”（contig）；只要有一定數(shù)量的STS標(biāo)簽，所有DNA大片段在該染色體或基因組中的位置都能被確定。物理圖譜構(gòu)建原理（2）大規(guī)?；蚪M測序的兩種策略逐步克隆法（clonebyclone）全基因組鳥槍法(wholegenomeshot-gun)或霰彈法基因組測序的逐步克隆法1）用全部染色體分別建立酵母人工染色體（yeastartificialchromosome,YAC）克隆群，人工染色體的插入片段平均長度為500-1000kb；2）利用易于檢測的DNA標(biāo)志(STS)建立克隆之間的聯(lián)系，組成有序排列的YAC連續(xù)克隆系；3）根據(jù)DNA的標(biāo)志或已知基因，將YAC克隆分別定位于染色體的不同區(qū)域，構(gòu)成了全基因組的物理圖譜；4）對單個的YAC克隆分別進(jìn)行細(xì)致的物理圖譜分析，并逐組切割成易于操作的小片段，分別進(jìn)行亞克隆，直到能夠用于DNA的測序樣本；5）解讀序列分析圖，根據(jù)序列的重疊，將其依次排列，最終得到全長DNA的序列?；蚪M測序的鳥槍法鳥槍法是利用超聲處理、核酸酶