原核表達綜述

[Merck推舉]原核表達秘笈之宿主菌株選擇指南3大以獲得最滿足的表達效果。事實上，在尋常的試驗中，最簡潔被無視的就是宿主菌的選擇——多數(shù)人會作為原核表達的宿主，對外源基因的表達會產(chǎn)生確定的影響，是勿庸知其然還要知其所以然。比方，菌株內(nèi)源的蛋白酶過多，可能會造成達菌株?？胺Q經(jīng)典的BL21系列就是lon和ompT蛋白酶缺陷型，也是我們BL21(DE3)T7聚合酶基T7真核細胞偏愛的密碼子和原核系統(tǒng)有不同，因此，在用原核系統(tǒng)表達Rosetta2系列就是更好的選擇——這種攜帶pRARE2質(zhì)粒的BL21衍生AGG,AGA,CUA,CCC,GGACGG)稀有tRNA當(dāng)要表達的蛋白質(zhì)需要形成二硫鍵以形成正確的折疊時，可以選擇K–12衍生菌Origami2系列，thioredoxinreductase 和glutathione(trxB)reductase〔gor〕兩條主要復(fù)原途徑雙突變菌株，顯著提高細胞質(zhì)〔卡那霉素敏感〕Rosetta-gami27種稀有〔卡那霉素敏感〕OrigamiBlacZYBL21菌株，這個突變能依據(jù)IPTG的濃度準確調(diào)整表達產(chǎn)物，使得表達產(chǎn)物量呈現(xiàn)IPTG濃度依靠性?！菜沫h(huán)素敏感〕現(xiàn)象無蛋白表達可能緣由改進方案建議菌株消滅截短蛋白E.coli的密補充稀有密碼子的tRNA現(xiàn)象無蛋白表達可能緣由改進方案建議菌株消滅截短蛋白E.coli的密補充稀有密碼子的tRNARosetta2將稀有密碼子突變?yōu)橐话鉘osetta-gami2降低宿主胞質(zhì)的復(fù)原性；Rosetta-gamiBRosettaBlueOrigami2二硫鍵形成困難利用促進二硫鍵形成的各Rosetta-gami2包涵體表達過快，表達把握優(yōu)化表達水平：降量過高溫，IPTG濃度優(yōu)化降低宿主胞質(zhì)的復(fù)原性；Rosetta-gamiBTunerRosetta-gamiBOrigami2溫，IPTG濃度優(yōu)化更嚴格的本底表達把握Rosetta-gamiB細胞死亡，生長極困難無克隆生長毒性蛋白過高本底表達更嚴格的本底表達把握pLysS菌株pLysS、pLysE菌株Rosetta-gami2蛋白無活性 蛋白錯誤折疊種載體標簽把握優(yōu)化表達水平：降Rosetta-gamiTunerB原核表達個人秘笈：表達前的分析比什么都重要PCR、電鏡切片，這些人為把握等缺點。原核表達從一開頭的設(shè)計就格外重要，所謂好的開頭是成功的一半。前面已經(jīng)介紹過很多公司的商業(yè)化載體、菌株和多系統(tǒng)表達體系，現(xiàn)物src同源的SH2蛋白相互作用域的蛋白都是用pGEX系列載體表達出來的60kD的單體蛋白較簡潔表達。翻譯起始位點現(xiàn)在大局部的表達載體都供給起始位點，所以它已經(jīng)把起始密碼子和終止密碼子GC含量表達序列中的GC含量超過70％的時候可能會降低蛋白在大腸桿菌中的表達水平。GC含量可以利用DNASTA、RVectorNTISuite二級構(gòu)造在起始密碼子四周的mRNA二級構(gòu)造可能會抑制翻譯的起始或者造成翻譯暫停從而產(chǎn)生不完全的蛋白。假設(shè)利用軟件分析DNA或RNA構(gòu)造上有柄〔stem〕構(gòu)造，并且結(jié)合長度超過8個堿基，這種基因或者蛋白的大小一般說來小于5kD或者大于100kD的蛋白都是難以表達的。〔即單體蛋白〕假設(shè)蛋白較小，那么參與融合標簽GST、Trx、MBP或者其它較大的促進融合的蛋白標簽就較有可能使蛋白正確折疊，并以融合形式表達。對于另一個極端，大于60kD的蛋白建議使用較小的標簽，如6VectorNITSuite較遠的話還是不妨一試的。親疏水性這也是一種閱歷之談，信任常常做表達的人都覺察表達親水區(qū)VectorNITSuite，除此之外還可以利用在線跨膜區(qū)推想軟件“://cbs.dtu.dk/services/TMHMM/“://cbs.dtu.dk/services/TMHMM/對跨膜區(qū)進展推想。對于自己表達的蛋白有所了解后就可以開頭對載體進展選擇了，目前商業(yè)化的載體根本上包含以下幾個元件：除了上面標出的元件外還需要有復(fù)制起點，它對于把握質(zhì)粒的拷貝數(shù)lacZ，各種抗生素標啟動子啟動子LacUV5TrpTac來源乳糖操縱元-35調(diào)控手段〔濃度〕lacI/IPTG(0.1-1mM)trpR3-β吲哚丙烯酸lacI/IPTG(0.1-1mM)強度強強強-10序列PLT5pBADT7*噬菌體T5噬菌體阿拉伯糖操縱元T7RNA聚合酶λcI阻遏物/溫度lacI/IPTG(0.1-1mM)AraBAD/阿拉伯糖(1μm-10mM)lacI/IPTG(0.1-1mM)強格外強IPTG這種化學(xué)誘導(dǎo)方式pDH2。它利PL42℃后進展誘導(dǎo)表達。T7啟動子最強，它可以將大腸桿菌的資pETT7Novagen可以說是的pET系統(tǒng)是最王牌的T7啟動子表達系統(tǒng)，可T7啟動子的強啟動效應(yīng)不受歡送的時候怎么辦呢？在這里給讀者留個小小的疑問，看看大家有沒有認真看筆者寫的Novagen篇。提示一下，雖然它轉(zhuǎn)錄速度快，但是可以把握它的拷貝數(shù)，又或者是利用這些原理Novagen載體也可以毒性高的外源蛋白。載體上除了啟動子這個需要留意之外，另外一個就是標簽了。很多標6×組氨酸標簽，筆者曾經(jīng)以為加什么標簽都無所謂〔前提是不需要融合表達〕，結(jié)果加了個Novagen的T7·Tag，等到鑒定的時候覺察單抗那么貴。的功課之一哦。好了，假設(shè)你選好了載體，那么下一步就是設(shè)計引物的。信任大多數(shù)人都是利用PCR把目的基因調(diào)出來的吧。設(shè)計引物可以使用一下兩個軟PrimerPremierOligo。假設(shè)要表達全長，其實也就沒那么多要8個匹配序列在加上與載體匹配的序列就可以了。不過，我還是有以下幾點提示一下各位：T載原理的克隆方法也可以應(yīng)用到原核表達中了，假設(shè)T載克隆方法要定向很多時候要多45”端不SalⅠ不需要保護堿基，EcoRⅤ需要1個，Not2個，HindⅢ最好有3個。2個。留意啟始密碼子和終止密碼子的讀碼框。假設(shè)載體上有ATG可以不另外加了，但是通常ATG后不是緊跟外源片段的，假設(shè)中間含有載體序列，務(wù)必確定中間這段序列不會造成你外源序列的移碼。按狀況需要，12樣萬無一失。還有就是設(shè)計一對引物需要留意的地方：一對引物之間Tm值相差不宜過大，能一樣最好；一對引物不宜形成發(fā)夾構(gòu)造、相互配對，假設(shè)配對時最好不要是G-C的結(jié)合〔可以用軟件分析〕；3”端以G、C結(jié)尾為宜等等。如果要具體爭論可以看一下PCR技術(shù)的相關(guān)書籍，很厚。還有由于純化愛上你:原核表達GE〔原安瑪西亞〕篇〔GEHealthcare〕或許生物方面的爭論人員會比較業(yè)〔固然也不要盲目崇拜把通用汽車也歸到旗下，GM會生氣的〕，可是講起蛋白純化等領(lǐng)域首屈一指的安瑪西亞，特別是ECL系列和當(dāng)年的法瑪西亞的Sepharose、Sephadex等大名鼎鼎的純化填料，那么很多做蛋白的人都很生疏。美國通用電氣公司2023年10月以總計高達95億美金獲得安瑪西100%選擇GE的表達載體緣由很簡潔，愛屋及烏，使用他們的載體可以便利常常用于標記的蛋白包括有硫氧還蛋白、6×組氨酸、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶〔GST〕等，6×組氨酸可以說是被應(yīng)用的最為廣泛的了，次之就是GE醫(yī)療有特地設(shè)計的一系列載體的GST了。GST本身是一個在解毒過程中起到重要作用的轉(zhuǎn)移酶，它的自然大小26KD6xHistag由于分子〔嚴格的試驗還是必需切割下來的〕但是GST相比6xHistag分子量要大得多，必需要用蛋白酶將融合蛋白中的GST切下來。對于表達分子量小的目標蛋白來說選擇GST就比6xHistag蛋白里可能存在5個連續(xù)的組氨酸〔或者格外靠近的6個His〕因而也會6xHisGST純化填料的專一性則格外高。順帶提一句，GST融合表達得到的包含體經(jīng)過純化后在復(fù)性的過〔不影響二硫鍵的條件下〕。選擇GST載體的同志不行不知。GST系列可是說是GE醫(yī)療在原核表達這塊的王牌產(chǎn)品，總共有13個載體。這13個載體中有9個的多克隆位點是擴展過的，有6個限制性酶切位點。擴展后的多克隆位點便利我們從λ噬菌體載體構(gòu)建的文庫中將所需的GST切割下來的蛋白酶識別位點，不同載體攜帶的蛋白酶不同，可以分成T系列、X系列和P系列，分別代表承受凝血酶Thrombin、Xa因子蛋白酶以及GE醫(yī)療產(chǎn)的PreScission?蛋白酶作為蛋白酶切割位點。前面兩個都是格外經(jīng)典的融合表達載體的蛋白酶切割位點，但是由于這兩種蛋白酶切割需時較長而且要求在室溫條件下切割 GST，容易導(dǎo)致目標蛋白降解，另外蛋白酶的去除也是比較煩人的問題，所以GE公司就PreScission。PPreScission酶進展切割，它的消化溫度只要5°C基因操作也加上了一個GST標記，所以它可以和被切下來的GST剩余局部一GlutathioneSepharose?)純化去除。這樣就可以極大程度上簡化了純化的步驟，從這里可以再次看出GE醫(yī)療產(chǎn)品在設(shè)計上很多時候總是考慮到下一步的純化步驟的。pGEX-6P有三種載體，以便利你從另外值得一提的是pGEX-2TK是特地為了體外標記融合產(chǎn)物以檢測表達狀況而設(shè)計的。它含有來自心肌的cAMP依靠性蛋白激酶催化亞單位的識別位點，這個位點位于GST和多克隆位點之間。表達的蛋白可以直接用蛋白激酶和[g-32P]ATP進展標記，產(chǎn)物可以用放射自顯影技術(shù)穩(wěn)定地檢測。它的GST可以用凝血酶切除?？偟恼f來，pGEX全部載體都供給了三種不同的翻譯讀碼框選擇；都Ptac。Ptac是由trp啟動子的-35序列和lacUV5的Pribnow序列拼接而成，調(diào)控和lac一樣，但是mRNA轉(zhuǎn)錄水平更高，表達也更高，也都利用IPTG進展誘導(dǎo)表達。IPTG本身有毒而似乎不適合表達醫(yī)藥用途的蛋白。這系列載體都是利用氨芐青霉素進展篩選。其中 pGEX-1lT，pGEX-6P-1pGEX-4T-1和pGEX-5X-1lgt11文庫的cDNA片斷并進展表達。在表達后的檢測和純化方面，GE醫(yī)療的產(chǎn)品堪稱經(jīng)典。無論是WesternBlot 檢測表達，還是五花八門的純化親和層析柱，還有分別凝血酶等絲氨酸蛋白酶的苯甲脒凝膠柱，即使GE醫(yī)療沒有6×組氨酸標記的載體，但是6×組氨酸親和純化相關(guān)產(chǎn)品卻確定精彩。極速濃縮、1分鐘洗脫，不同10具體狀況可參考生物通首頁頭條廣告。這里就不具體一一介紹了。大家做原核表達的目的是各式各樣的，有用來做抗原；也有需要表達量到開場白“因為純化愛上你”，就是選擇pGEX 的最好理由吧！優(yōu)化基因表達的關(guān)鍵因素之：基因的重設(shè)計和合成在基因表達爭論中，爭論者比較留意選擇適宜的表達載體和宿主系統(tǒng)，而往往無視基因本身是否與載體和宿主系統(tǒng)為最正確匹配這樣一個實質(zhì)性問題?；虻淖钫_化表達可以通過對基因的重設(shè)計和合成來實現(xiàn)，如消退稀有密碼子而利用最正確化密碼子，二級構(gòu)造最小化，調(diào)整 GC含量等。以下就密碼子最正確化、翻譯終止效率和真核細胞中異源蛋白表達的問題加以說明。codonoptimization)64種，但是絕大多數(shù)生物傾向于利用這些密碼子中的一(optimalcodons)，那些不被(rareorlow-usagecodons)Pichia8[1]6個同樣碼子可能不是你正在利用的蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)進展高水平表達所偏愛的密碼子，(preferredcodons)并避開利用率在同源表達系統(tǒng)中，同較低水平表達的基因相比，較高表達的基因可在基因表達爭論中，爭論者比較留意選擇適宜的表達載體和宿主系統(tǒng)，而往往無視基因本身是否推想任何基因在酵母中的表達水平[2]。在諸如Zeamays的其他生物中，大量高表達基因猛烈偏愛以G或C結(jié)尾的密碼子[3]。而且，在Dictyostelium中，同[4]。在大腸桿菌中表達哺乳動物基因是不行推想和具有挑戰(zhàn)的。例如直到最近才實現(xiàn)了人血紅蛋白的過表達[5]。為了到達血紅蛋白的好的表達水平，Alpha-球蛋白cDNA不得不用大腸桿菌偏愛的密碼子進展重合成。在異源宿主中實現(xiàn)象血紅蛋白這樣簡潔的蛋白質(zhì)的過表達可能需要最正確化密碼子，這些爭論者為此供給了令人信服的資料。成簇的低利用率的密碼子抑制了核糖體的運動，這是基因不能以適宜水平表達的一個明顯機制。核糖體翻譯由九個密碼子組成的信使〔含幾個低利用率密碼子或全部為低利用率密碼子〕時的運動速度要比翻譯不含低利用率密碼子的同樣長的信使的速度慢。即使低利用率密碼子簇位于 3”端，信使最終也會被核糖體”擁擠”而損害，核糖體又回到5”端。3”端低利用率密碼子簇的抑制效應(yīng)可以和全部信使都由低利用率密碼子組成的抑制效應(yīng)一樣大。假設(shè)低利用率密碼子簇位于5”端，其效應(yīng)是起始核糖體數(shù)目的全面減[6]。其他因素也可以影響蛋白表達，包括使mRNA去穩(wěn)定的序列。重設(shè)翻譯終止效率蛋白