免疫學(xué)檢測技術(shù)的基本原理

一.體外抗原抗體反應(yīng)的特征

1.高度特異性抗原的表位與抗體的抗原結(jié)合點結(jié)構(gòu)互補。

2.可見性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后能肉眼直接觀察。二.抗原抗體反應(yīng)的影響因素

1.溫度：最適溫度為37℃。2.酸堿度：最適pH=6-8。3.電解質(zhì)：可促進抗原與抗體的結(jié)合。常用生理鹽水。當前第1頁\共有26頁\編于星期五\2點抗原抗體比例對反應(yīng)現(xiàn)象的影響當前第2頁\共有26頁\編于星期五\2點三.檢測抗原和抗體的體外試驗（一）凝集反應(yīng)

顆粒性抗原（RBC、細菌等）與相應(yīng)抗體結(jié)合形成肉眼可見凝集物的現(xiàn)象或反應(yīng)。1．直接凝集試驗（1）玻片凝集試驗：用于定性測抗原。如ABO血型鑒定，細菌的鑒定、分型等。（2）試管凝集試驗：用于定量測抗體如肥達氏反應(yīng)。2．間接凝集試驗如類風濕因子的測定等。當前第3頁\共有26頁\編于星期五\2點當前第4頁\共有26頁\編于星期五\2點（二）沉淀反應(yīng)

可溶性抗原（血清蛋白、組織浸液等）與相應(yīng)抗體結(jié)合而形成可見沉淀物的反應(yīng)。因該類反應(yīng)多在半固體瓊脂凝膠中進行，故又稱為瓊脂擴散試驗或免疫擴散。

當前第5頁\共有26頁\編于星期五\2點1．單向免疫擴散用于定量測抗原。如檢測血清免疫球蛋白、C3等含量。

當前第6頁\共有26頁\編于星期五\2點2．雙向免疫擴散主要用于定性檢測抗原或抗體，抗原組成及兩種抗原相關(guān)性分析。當前第7頁\共有26頁\編于星期五\2點3．免疫電泳

其方法是先電泳、后擴散。主要用于抗原成分的分析，亦可用于診斷如骨髓瘤、性聯(lián)低丙種球蛋白血癥等的診斷。

當前第8頁\共有26頁\編于星期五\2點

4．免疫比濁用于定量測抗原。該法快速、簡便。5）免疫比濁法

在一定量的抗體中分別加入遞增量的抗原，經(jīng)一定時間后形成免疫復(fù)合物。用濁度計測量反應(yīng)液體的濁度，復(fù)合物形成越多，濁度越高，繪制標準曲線并根據(jù)反應(yīng)液體的濁度，推算樣品中的抗原含量。當前第9頁\共有26頁\編于星期五\2點（三）免疫標記技術(shù)

用熒光素、同位素或酶等示蹤物質(zhì)標記抗體（或抗原）進行抗原-抗體反應(yīng)。標記物質(zhì)與抗體（或抗原）的化學(xué)連接未改變抗體（或抗原）的免疫學(xué)特性，且極大的提高了反應(yīng)的靈敏度，可以對微量物質(zhì)進行定量、定性或定位檢測。免疫標記技術(shù)主要有三種基本類型：

免疫熒光技術(shù)免疫酶技術(shù)同位素標記技術(shù)

當前第10頁\共有26頁\編于星期五\2點1．免疫熒光技術(shù)(ImmunofluorescenceTechnique)

用熒光素與抗體連接成熒光抗體，再與待測標本的抗原反應(yīng)，，置熒光顯微鏡下觀察，抗原抗體復(fù)合物散發(fā)出熒光，借此對標本中的抗原作鑒定和定位。

（1）常用熒光素異硫氰酸熒光素（FITC），顯黃綠色。藻紅蛋白（PE），顯紅色。（2）方法*直接熒光法：

優(yōu)點--特異性強缺點--每檢測一種抗原必須制備相應(yīng)的熒光抗體。*間接熒光法優(yōu)點--敏感性比直接法高，且制備一種熒光素標記的二抗可用于多種抗原的檢測，缺點--非特異性熒光增加。當前第11頁\共有26頁\編于星期五\2點當前第12頁\共有26頁\編于星期五\2點當前第13頁\共有26頁\編于星期五\2點2．酶免疫測定（EnzymeImmunoassay,

EIA）用酶標記的抗體進行的抗原抗體反應(yīng)。EIA將抗原抗體反應(yīng)的特異性與酶催化作用的高效性相結(jié)合，通過酶作用于底物后顯色來判定結(jié)果。其檢測的敏感度可達pg-ng/ml水平。Ab+EAbE

Ag+AbEAgAbE+底物

呈色反應(yīng)當前第14頁\共有26頁\編于星期五\2點EIA當前第15頁\共有26頁\編于星期五\2點（1）標記的酶：辣根過氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶（AP）。（2）常用方法:A酶聯(lián)免疫吸附試驗

(EnzymeLinkedImmunosorbentAssay,ELISA)將已知的抗原或抗體吸附在固相載體（聚苯乙烯微量反應(yīng)板）表面，使抗原抗體反應(yīng)在固相表面進行。用洗滌法將液相中游離成分洗除.用于可溶性抗原和抗體的檢測。

當前第16頁\共有26頁\編于星期五\2點*間接法：用于檢測抗體當前第17頁\共有26頁\編于星期五\2點*雙抗體夾心法：用于檢測抗原。當前第18頁\共有26頁\編于星期五\2點B免疫組化技術(shù)—檢測組織中或細胞表面的抗原。

對抗原進行定性、定量、定位檢測。

C酶聯(lián)免疫斑點試驗（ELISPOT）

可用于細胞因子的檢測當前第19頁\共有26頁\編于星期五\2點3．放射免疫測定法（RIA）

敏感度可達pg水平，其標記物為125I、131I等。常用于微量物質(zhì)的檢測，如激素、IgE等。

當前第20頁\共有26頁\編于星期五\2點4．化學(xué)發(fā)光免疫分析

該法是將發(fā)光物吖啶酯、或魯米諾標記抗原或抗體進行的結(jié)合反應(yīng)。

發(fā)光物質(zhì)在反應(yīng)劑激發(fā)下生成激發(fā)態(tài)中間體，當激發(fā)態(tài)中間體回到穩(wěn)定的基態(tài)時發(fā)射出光子，用自動發(fā)光分析儀能接收光信號，測定光子的產(chǎn)量，以反映待檢樣品中抗體或抗原的含量。其靈敏度高于RIA，常用于超微量物質(zhì)的測定，如甲狀腺素等。當前第21頁\共有26頁\編于星期五\2點5．免疫印跡法（Westernblotting）該法是將凝膠電泳與固相免疫相接合的檢測技術(shù)，即將電泳分區(qū)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體，再用酶免疫、放射免疫技術(shù)測定。常用于檢測多