1細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)課件

細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)2023/6/41...前言細(xì)胞生物學(xué)英文名稱：cellbiology定義：從細(xì)胞整體、顯微、亞顯微和分子等各級(jí)水平上研究細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能及生命活動(dòng)規(guī)律的學(xué)科。發(fā)展：細(xì)胞生物學(xué)由Cytology發(fā)展而來，它是關(guān)于細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能(特別是染色體)的研究?，F(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)從顯微水平，超微水平和分子水平等不同層次研究細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、功能及生命活動(dòng)。2023/6/42...細(xì)胞生物學(xué)發(fā)展簡(jiǎn)史：三個(gè)層次：洋蔥表皮細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)骨骼肌超微結(jié)構(gòu)脫氧核苷酸結(jié)構(gòu)模型2023/6/43...四個(gè)階段：從16世紀(jì)后期到19世紀(jì)30年代，是細(xì)胞發(fā)現(xiàn)和細(xì)胞知識(shí)的積累階段。通過對(duì)大量動(dòng)植物的觀察，人們逐漸意識(shí)到不同的生物都是由形形色色的細(xì)胞構(gòu)成的。第一階段RobertHooke（1636～1702），1665年，他在《顯微圖譜》中第一次使用“細(xì)胞”一詞。2023/6/44Hooke觀察到的軟木結(jié)構(gòu)Hooke使用的顯微鏡...從19世紀(jì)30年代到20世紀(jì)初期，細(xì)胞學(xué)說形成后，開始了在顯微水平研究細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能。形態(tài)學(xué)、胚胎學(xué)和染色體知識(shí)的積累，使人們認(rèn)識(shí)了細(xì)胞在生命活動(dòng)中的重要作用。1893年Hertwig的專著《細(xì)胞與組織》（DieZelleunddieGewebe）出版，標(biāo)志著細(xì)胞學(xué)的誕生。1896年哥倫比亞大學(xué)Wilson編著的《細(xì)胞發(fā)育與遺傳》（TheCellinDevelopmentandHeredity）、1920年墨爾本大學(xué)Agar編著的《細(xì)胞學(xué)》（Cytology）都是這一領(lǐng)域最早的教科書。第二階段2023/6/45...從20世紀(jì)30年代到70年代，電子顯微鏡技術(shù)出現(xiàn)后，把細(xì)胞學(xué)帶入了第三大發(fā)展時(shí)期，這短短40年間不僅發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞的各類超微結(jié)構(gòu)，而且也認(rèn)識(shí)了細(xì)胞膜、線粒體、葉綠體等不同結(jié)構(gòu)的功能，使細(xì)胞學(xué)發(fā)展為細(xì)胞生物學(xué)。DeRobertis等人1924年出版的《普通細(xì)胞學(xué)》（GeneralCytology）在1965年第四版的時(shí)候定名為《細(xì)胞生物學(xué)》（CellBiology），這是最早的細(xì)胞生物學(xué)教材之一。第三階段2023/6/46線粒體結(jié)構(gòu)示意圖線粒體超微結(jié)構(gòu)...從20世紀(jì)70年代基因重組技術(shù)的出現(xiàn)到當(dāng)前，細(xì)胞生物學(xué)與分子生物學(xué)的結(jié)合愈來愈緊密，研究細(xì)胞的分子結(jié)構(gòu)及其在生命活動(dòng)中的作用成為主要任務(wù)，基因調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、腫瘤生物學(xué)、細(xì)胞分化和凋亡是當(dāng)代的研究熱點(diǎn)。第四階段2023/6/47細(xì)胞凋亡示意圖細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑細(xì)胞分化示意圖...細(xì)胞生物學(xué)學(xué)科的發(fā)展，正是基于新的研究技術(shù)方法的建立。技術(shù)方法與科研思路是學(xué)科發(fā)展的雙翼，二者缺一不可。2023/6/48...《細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》學(xué)習(xí)內(nèi)容顯微鏡技術(shù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)與成分的顯示技術(shù)細(xì)胞生理生化研究細(xì)胞培養(yǎng)和分析細(xì)胞膜技術(shù)2023/6/49細(xì)胞周期分析細(xì)胞成分的分離與分析細(xì)胞工程基礎(chǔ)技術(shù)細(xì)胞凋亡的測(cè)定染色體技術(shù)分子細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)...《細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》參考書目2023/6/410章靜波,黃東陽,方瑾主編.《細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》.化學(xué)工業(yè)出版社.2006年出版.李芬主編.《細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》.科學(xué)出版社.2007年出版.印莉萍,祁小廷主編.《細(xì)胞分子生物學(xué)技術(shù)教程》.科學(xué)出版社.2001年出版....第一章顯微鏡技術(shù)2023/6/411普通顯微鏡的構(gòu)造及使用方法相差顯微鏡的構(gòu)造及使用方法熒光顯微鏡的構(gòu)造及使用方法激光掃描共聚焦顯微鏡的構(gòu)造及使用方法透射電子顯微鏡與超薄切片技術(shù)掃描電子顯微鏡與樣品制備...顯微鏡分類：光學(xué)顯微鏡：2023/6/412可把物體放大1500倍，分辨的最小極限為0.2μm。電子顯微鏡：...2023/6/413用高速電子束代替光束，放大倍數(shù)達(dá)80萬倍，分辨率最小極限達(dá)0.1~0.2nm。電子顯微鏡：...第一節(jié)普通顯微鏡

的構(gòu)造及使用方法2023/6/414...顯微鏡的主要部分是物鏡和目鏡，為兩組焦距較短的凸透鏡。一、原理與應(yīng)用2023/6/415物鏡的焦距（F1）短，目鏡的焦距（F2）略長(zhǎng)。物體AB位于物鏡的2倍焦距和1倍焦距之間，所以在物鏡的像方形成一個(gè)倒立的放大的實(shí)像A’B’；A’B’位于目鏡的1倍焦距以內(nèi)，經(jīng)目鏡放大為虛像A’’B’’，A’’B’’位于人眼的明視距離內(nèi)。A’’B’’的視角比眼睛直接看AB時(shí)視角大得多，所以用顯微鏡可以看清微小的東西，但人眼通過目鏡所看到的是被放大了2次的倒立的像。ABA’B’A’’B’’F2F1...機(jī)械部分照明部分光學(xué)部分2023/6/416二、儀器構(gòu)造鏡座鏡柱鏡臂鏡筒物鏡轉(zhuǎn)換器鏡臺(tái)調(diào)節(jié)器粗準(zhǔn)焦螺旋細(xì)準(zhǔn)焦螺旋機(jī)械部分...2023/6/4照明部分反光鏡聚光器光圈光學(xué)部分目鏡物鏡17...（1）目鏡通常備有2~3個(gè)，上面刻有5×、10×或15×符號(hào)，表示放大倍數(shù)，一般用10×目鏡。2023/6/418一般有3~4個(gè)，上面標(biāo)有放大倍數(shù)和數(shù)值孔徑（鏡口率），如10/0.25、40/0.65和100/1.3；鏡筒長(zhǎng)度和所要求的蓋玻片厚度，如160（mm）/0.17（mm）。（2）物鏡...表1-1不同倍數(shù)物鏡的比較2023/6/419鏡頭放大倍數(shù)鏡身數(shù)值孔徑工作距離/mm低倍鏡10×短0.37高倍鏡40×較長(zhǎng)0.50.5油鏡100×長(zhǎng)1.30.2不同放大倍數(shù)物鏡的工作距離...（1）材料：“a”字片、紅綠羊毛交叉片人血涂片雙層油鏡瓶擦鏡紙（2）設(shè)備：普通光學(xué)顯微鏡2023/6/420三、實(shí)驗(yàn)用品...1、低倍鏡子的使用方法：取鏡和放置對(duì)光放置標(biāo)本片調(diào)節(jié)焦距2023/6/421四、實(shí)驗(yàn)操作看不到物象的可能原因：物鏡未對(duì)正通光孔，對(duì)正后再觀察；標(biāo)本未放到視野內(nèi)，移動(dòng)標(biāo)本至通光孔中央；調(diào)節(jié)器轉(zhuǎn)動(dòng)太快，超過焦點(diǎn)，應(yīng)重新調(diào)焦；視野內(nèi)光線太強(qiáng)，不易觀察到未染色的標(biāo)本片，將光線調(diào)暗再觀察。...2、高倍鏡的使用方法：選好目標(biāo)轉(zhuǎn)換高倍物鏡調(diào)節(jié)焦距2023/6/4223、油鏡的使用方法：選好目標(biāo)轉(zhuǎn)換油鏡調(diào)節(jié)光亮調(diào)焦擦凈油鏡頭和標(biāo)本片...2023/6/423五、注意事項(xiàng)1、輕拿輕放，一手握鏡臂一手托鏡座；2、顯微鏡放穩(wěn)，鏡筒傾斜角度不超過45°；3、升鏡臺(tái)、降鏡筒、轉(zhuǎn)換物鏡時(shí)，切勿邊操作邊觀察；4、更換標(biāo)本片時(shí)，使鏡臺(tái)與鏡頭遠(yuǎn)離，方可取下標(biāo)本片；5、觀察部位要對(duì)準(zhǔn)通光孔中央，不能放反；6、轉(zhuǎn)換物鏡時(shí)應(yīng)轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)換器，勿手持物鏡移動(dòng)；7、用完后使鏡頭離開通光孔，下降載物臺(tái)，豎立反光鏡，下降聚光器，關(guān)閉光圈，玻片移動(dòng)器回位，放回鏡柜內(nèi)；8、保持清潔，勿口吹、手抹或用布擦光學(xué)和照明部分。...2023/6/424六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析1、低倍鏡觀察“a”字片呈倒立的物像，且玻片的移動(dòng)方向與視野內(nèi)物像移動(dòng)的方向相反。2、高倍鏡觀察紅綠羊毛交叉片，先在低倍鏡下找到羊毛，并將紅綠羊毛的交叉點(diǎn)移到視野的中心，然后換高倍鏡觀察。轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)調(diào)節(jié)器下降鏡臺(tái)時(shí)紅色羊毛清晰，表明紅色羊毛位于交叉點(diǎn)上方；上升鏡臺(tái)時(shí)，綠色羊毛清晰，表明綠色羊毛在交叉點(diǎn)的下方。3、低倍鏡、高倍鏡、油鏡觀察人血細(xì)胞涂片時(shí)，觀察范圍依次變小，放大倍數(shù)、分辨率依次提高。血細(xì)胞包括紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板。其中白細(xì)胞主要包括淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞。紅細(xì)胞為雙凹扁盤狀,無細(xì)胞核，橘紅色。白細(xì)胞形態(tài)不一，細(xì)胞核紫色；其中淋巴細(xì)胞細(xì)胞核大而圓，周圍邊緣為淺藍(lán)色細(xì)胞質(zhì)；單核細(xì)胞，核為馬蹄形或腎形，細(xì)胞質(zhì)比例較大淺藍(lán)色；粒細(xì)胞核成為葉狀，細(xì)胞質(zhì)中具有大小不等的顆粒。血小板為紫紅小片狀，常多個(gè)聚在一起。...第二節(jié)相差顯微鏡

的構(gòu)造及使用方法2023/6/425...一、原理與應(yīng)用2023/6/4光波有振幅(亮度)、波長(zhǎng)(顏色)及相位(指在某一時(shí)間上光的波動(dòng)所能達(dá)到的位置的不同。光波通過物體時(shí)波長(zhǎng)和振幅發(fā)生變化，人們的眼睛才能觀察到，這就是普通顯微鏡下能夠觀察到染色標(biāo)本的道理。

活細(xì)胞和未經(jīng)染色的生物標(biāo)本，波長(zhǎng)和振幅并不發(fā)生變化，因細(xì)胞各部分細(xì)微結(jié)構(gòu)的折射率和厚度略有不同，光線透過標(biāo)本后發(fā)生折射，偏離了原來的光路，光波的相位發(fā)生變化(相應(yīng)發(fā)生的差異即相差)，而這種微小的變化，人眼無法鑒別，故在普通顯微鏡下難以觀察到。

相差顯微鏡就是將經(jīng)過透明物體的直射光延遲或提前1/4波長(zhǎng)，并和繞射光產(chǎn)生干涉，相位差變?yōu)檎穹睢Ｈ绻a(chǎn)生的干涉為相長(zhǎng)干涉，則振幅的同相量相加而變大，即可看到較亮的部分；如果產(chǎn)生的干涉為相消干涉，則振幅異相量相消而變小，這部分就變得較暗。變相位差為振幅差的結(jié)果，使原來透明的物體表現(xiàn)出明顯的明暗差異，對(duì)比度增加，可清晰觀察活細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)。26...

在普通顯微鏡上增加下列四種附件就成為相差顯微鏡：環(huán)狀光闌相差物鏡綠色濾光片合軸調(diào)整望遠(yuǎn)鏡2023/6/427二、儀器構(gòu)造123456相差顯微鏡光路圖示1-目鏡；2-物鏡；3-標(biāo)本片4-聚光器；5-相板；6-環(huán)狀光闌...2023/6/4環(huán)狀光闌

環(huán)狀光闌位于光源與聚光器之間，是環(huán)狀孔形成的光闌，它們的直徑和孔寬與不同物鏡相匹配。大小不同的環(huán)狀光闌成一轉(zhuǎn)盤。更換放大率不同的物鏡時(shí)，要同時(shí)更換相應(yīng)的環(huán)狀光闌。其作用是使照明光線從環(huán)狀的透明區(qū)進(jìn)入聚光鏡，再斜射到標(biāo)本上。相差物鏡(鏡頭上標(biāo)有PC或PH字樣)

物鏡的后焦平面上裝有相板，相板上和環(huán)狀光闌相對(duì)應(yīng)的環(huán)狀部分大多數(shù)涂有吸收膜和推遲相位膜，其他部分完全透明。從標(biāo)本上射過來的光線，繞射光部分穿過透明區(qū)；直射光則穿過相板的環(huán)狀部分，一般所用的相板推遲相位1/4波長(zhǎng)，吸收80%的直射光，使直射光和繞射光的強(qiáng)度接近，明暗反差增大。由于透明標(biāo)本內(nèi)部構(gòu)造的折射率不同，產(chǎn)生繞射光的相位有不同程度的推遲，繞射光和直射光的干涉作用將相位差變成振幅差。28...2023/6/4綠色濾光片

在環(huán)狀光闌下面置綠色濾光片于光路中，它可吸收紅色和藍(lán)色光，使波長(zhǎng)范圍小的單色光線進(jìn)行照明，并有吸熱作用，能使相差觀察獲得良好的效果。一般選用中心波長(zhǎng)546nm的綠色濾光鏡，濾光鏡插入后對(duì)比度就提高。合軸調(diào)整望遠(yuǎn)鏡為使環(huán)狀光闌的中心與物鏡的光軸完全在一直線上，必須拔出目鏡，裝上特別的低倍望遠(yuǎn)鏡，使相板的暗環(huán)與環(huán)狀光闌的明環(huán)重合對(duì)齊，才能發(fā)揮相差顯微鏡的效能。

倒置顯微鏡組成和普通顯微鏡一樣，只不過物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，物鏡安裝在載物臺(tái)的下方，光源及聚光器安裝在載物臺(tái)的上方。倒置相差顯微鏡用于觀察培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中的活細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)，由于工作距離的限制，最大放大率為60×，一般研究用倒置相差顯微鏡配置有4×、10×、20×及40×相差物鏡。。29...（1）材料：體外培養(yǎng)細(xì)胞；（2）設(shè)備：相差顯微鏡。2023/6/430三、實(shí)驗(yàn)用品1、倒置相差顯微鏡的使用方法：(1)打開開關(guān)，將標(biāo)本置于載物臺(tái)上；(2)轉(zhuǎn)動(dòng)環(huán)狀光闌轉(zhuǎn)盤，使普通光闌進(jìn)入光路，并將光圈開到最大。旋轉(zhuǎn)物鏡轉(zhuǎn)換器，使低倍相差物鏡進(jìn)入光路，對(duì)光和調(diào)焦，看見標(biāo)本。四、實(shí)驗(yàn)操作...2023/6/431(3)轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)換器，使相差物鏡(20×)對(duì)準(zhǔn)標(biāo)本，同時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)環(huán)狀光闌轉(zhuǎn)盤選用20×標(biāo)示孔的光闌，以使環(huán)狀光闌的直徑和孔寬與所使用的相差物鏡相適應(yīng)，用細(xì)調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)焦距，使物像清楚。(4)合軸調(diào)節(jié)。將合軸望遠(yuǎn)鏡換入目鏡筒內(nèi)，一邊向望遠(yuǎn)鏡內(nèi)觀察，一邊用右手轉(zhuǎn)動(dòng)望遠(yuǎn)鏡內(nèi)筒使其下降，當(dāng)對(duì)準(zhǔn)焦點(diǎn)就能看到環(huán)狀光闌的亮環(huán)和相板的黑環(huán)，將望遠(yuǎn)鏡固定，升降聚光器并調(diào)節(jié)其下的螺旋使亮環(huán)的大小與黑環(huán)一致，然后前后左右調(diào)節(jié)環(huán)狀光闌聚光器上的調(diào)節(jié)鈕，使兩環(huán)完全重合。...2023/6/432五、注意事項(xiàng)1、載玻片或培養(yǎng)瓶必須平整、均勻，標(biāo)本不能太厚，否則相差顯微鏡成像效果不好；2、標(biāo)本要在有水的環(huán)境中（如培養(yǎng)液或用水封片）成像效果才明顯。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析在倒置相差顯微鏡下觀察活細(xì)胞，可清楚地分辨細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，細(xì)胞邊界、細(xì)胞核、核仁以及胞質(zhì)中存在的顆粒狀結(jié)構(gòu)清晰可見，分裂期細(xì)胞可見期染色體。...第三節(jié)熒光顯微鏡

的構(gòu)造及使用方法2023/6/433...一、原理與應(yīng)用2023/6/41、熒光的產(chǎn)生一些化學(xué)物質(zhì)經(jīng)短波高能光激發(fā)后能吸收并儲(chǔ)存能量而進(jìn)入激發(fā)態(tài)，當(dāng)其從激發(fā)態(tài)再回復(fù)到基態(tài)時(shí)，過剩的能量以熒光的形式發(fā)射。熒光發(fā)射的特點(diǎn)是在接受能量后即刻引起發(fā)光，而一旦停止供能熒光現(xiàn)象隨之瞬間消失。各種熒光分子有其特定的吸收光譜；光譜(熒光光譜)，即在某一特定波長(zhǎng)處有最大吸收峰和最大發(fā)射峰，因此要觀察不同的熒光應(yīng)選用不同波長(zhǎng)的激發(fā)光，得到的熒光強(qiáng)度才能最大。

34...2023/6/4有些物質(zhì)能夠自發(fā)熒光，如維生素A的紅色熒光、膠原纖維的藍(lán)綠色熒光、綠色熒光蛋白(GFP)的綠色熒光；有些物質(zhì)不能夠自發(fā)熒光，用熒光染料染色后，結(jié)合物可發(fā)出熒光。熒光染料激發(fā)光熒光顏色應(yīng)用范圍溴化乙錠（EB）藍(lán)紫紅DNAHO33258紫外藍(lán)白DNA吖（?。┼こ龋ˋO）藍(lán)光綠(DNA)、紅(RNA)DNA、RNA派洛寧Y綠光紅RNA異硫氰酸熒光素（FITC）藍(lán)光黃綠蛋白質(zhì)、抗體標(biāo)記四乙基羅丹明綠光橘紅抗體標(biāo)記四甲基異硫氰酸羅丹明綠光橘紅抗體標(biāo)記二乙酸酯熒光素（FDA）藍(lán)光綠細(xì)胞脂酶、細(xì)胞活力芥子阿的平（QM）紫外藍(lán)白染色體分帶表1-2常用的熒光染料35...2023/6/42、熒光顯微鏡原理熒光顯微鏡采用高壓汞燈作光源。汞燈是用石英玻璃制作，中間呈球形，內(nèi)充一定數(shù)量的汞。工作時(shí)由兩個(gè)電極間放電，引起汞蒸發(fā)，球內(nèi)氣壓迅速升高，當(dāng)汞完全蒸發(fā)時(shí)，可達(dá)5~7MPa，這一過程一般約需5~15min。超高壓汞燈的發(fā)光是電極間放電使汞分子不斷解離和還原過程中發(fā)射光量子的結(jié)果，它發(fā)射紫外到紅色各色光，其中強(qiáng)紫外和藍(lán)紫光等短波光足以激發(fā)各類熒光物質(zhì)。光源發(fā)出的光經(jīng)過激發(fā)濾片后，選擇性地透過可使標(biāo)本產(chǎn)生熒光的特定波長(zhǎng)的短波激發(fā)光，同時(shí)阻擋對(duì)激發(fā)熒光沒有用的光，短波激發(fā)光激發(fā)標(biāo)本內(nèi)的熒光物質(zhì)發(fā)射出熒光，通過物鏡和目鏡放大，同時(shí)目鏡前的阻斷濾片阻擋掉沒有被標(biāo)本吸收的激發(fā)光，有選擇的透過熒光，從而使觀察者通過目鏡可觀察到清晰的熒光。36...2023/6/4目前常用的落射式熒光顯微鏡的光路如右圖。高壓汞燈發(fā)出的光經(jīng)激發(fā)濾片選擇后，激發(fā)光一個(gè)與光軸呈45°角的雙色束分離器從物鏡向下落射到標(biāo)本表面，樣品被激發(fā)產(chǎn)生的熒光以及蓋玻片反射的激發(fā)光同時(shí)進(jìn)入物鏡，熒光可通過雙色束分離器進(jìn)入目鏡，反射的激發(fā)光被雙色束分離器阻擋，少量通過雙色束分離器的激發(fā)光再被阻斷濾片吸收。如換用不同的激發(fā)濾片/雙色束分離器/阻斷濾片的組臺(tái)插塊，可滿足不同熒光物質(zhì)的需要。123456781-高壓汞燈；2-激發(fā)光片；3-目鏡；4-阻斷濾片；5-雙色束分離器；6-物鏡；7-標(biāo)本；8-載物臺(tái)37...2023/6/43、熒光猝滅熒光分子的輻射能力在受到激發(fā)光較長(zhǎng)時(shí)間的照射后會(huì)減弱甚至猝滅，這是由于激發(fā)態(tài)分子的電子不能回復(fù)到基態(tài)，所吸收的能量無法以熒光的形式發(fā)射。因此熒光物質(zhì)的保存應(yīng)注意避免光（特別是紫外光）的直接照射和與其他化合物的接觸。38...熒光顯微鏡比普通光學(xué)顯微鏡多一些附件，如熒光光源、激發(fā)濾片、雙色束分離器和阻斷濾片等。光源普遍采用100~200W的超高壓汞燈，它能發(fā)射很強(qiáng)的光，如紫外、藍(lán)光、綠光等，足以激發(fā)各類熒光物質(zhì)。此外熒光顯微鏡一般同時(shí)也配有普通光源，以方便標(biāo)本上觀察目標(biāo)的尋找。2023/6/439二、儀器構(gòu)造...濾色系統(tǒng)

濾色系統(tǒng)由激發(fā)濾片和阻斷濾片組成。(1)激發(fā)濾片透過能使標(biāo)本產(chǎn)生熒光的特定波長(zhǎng)的光，同時(shí)阻擋對(duì)激發(fā)熒光無用的光。一般有紫外、紫色、藍(lán)色和綠色激發(fā)濾片，各自提供一定波長(zhǎng)范圍的激發(fā)光。U組：紫外激發(fā)濾片，激發(fā)波長(zhǎng)330~400nm。V組：紫藍(lán)激發(fā)濾片，激發(fā)波長(zhǎng)395~415nm。B組：藍(lán)光激發(fā)濾片，激發(fā)波長(zhǎng)400~490nm。G組：綠光激發(fā)濾片，激發(fā)波長(zhǎng)510~550nm。2023/6/440...(2)阻斷濾片熒光具有專一性，一般都比激發(fā)光弱，為能觀察到專一的熒光，在物鏡后面需加阻斷濾片。它的作用：一是吸收和阻擋激發(fā)光進(jìn)入目鏡，以免干擾熒光和損傷眼睛；二是選擇并透過特異的熒光，表現(xiàn)出專一的熒光色彩。阻斷濾片常與激發(fā)濾片相對(duì)應(yīng)，組合使用。聚光鏡

專為熒光顯微鏡設(shè)計(jì)制作的聚光器是用石英玻璃或其他透紫外光的玻璃制成的。主要有明視野聚光器和暗視野聚光器2種。2023/6/441(1)明視野聚光器在一般熒光顯微鏡上多用明視野聚光器，它具有聚光力強(qiáng)，使用方便，特別適于低、中倍放大的標(biāo)本觀察。(2)暗視野聚光器產(chǎn)生黑暗的背景，從而增強(qiáng)熒光圖像的亮度和反襯度，提高了圖像的質(zhì)量，觀察舒適，可發(fā)現(xiàn)亮視野難以分辨的細(xì)微熒光顆粒。...雙色束分離器

與光軸成45°角，可使激發(fā)光向下落射到標(biāo)本表面，樣品被激發(fā)后產(chǎn)生熒光，熒光能通過雙色束分離器到達(dá)目鏡，而未被標(biāo)本吸收的激發(fā)光返回后被雙色束分離器阻擋。阻光擋板將此擋板推進(jìn)光路，可遮擋激發(fā)光通過光路進(jìn)入物鏡，便于操作者用普通光學(xué)顯微鏡通路尋找到待觀察部位，拉出該擋板，熒光光路接通，可用于熒光的觀察。物鏡目鏡2023/6/442...（1）材料：人口腔黏膜上皮細(xì)胞臨時(shí)制片、潔凈載玻片、蓋玻片、眼科鑷、吸水紙；（2）試劑：95%乙醇、0.01%吖啶橙染液；（3）設(shè)備：熒光顯微鏡。2023/6/443三、實(shí)驗(yàn)用品（1）啟動(dòng)高壓汞燈；（2）調(diào)中光源，使燈影光斑和反射影光斑在載物臺(tái)的投射平面上居中且重合。四、實(shí)驗(yàn)操作...2023/6/444（3）放置標(biāo)本片載玻片厚度應(yīng)在0.8~1.2mm之間，蓋玻片厚度在0.17mm左右；（4）先關(guān)閉阻光擋板，用普通顯微鏡光路找到待觀察的細(xì)胞部位，調(diào)節(jié)焦距使物像清晰；（5）關(guān)閉普通光源，選擇針對(duì)所觀察的熒光的合適激發(fā)濾片及阻斷濾片，拉開阻光擋板，觀察標(biāo)本，調(diào)節(jié)細(xì)螺旋可得到清晰圖像。用油鏡觀察標(biāo)本時(shí)，必須用無熒光的特殊鏡油或無熒光甘油。...2023/6/445五、注意事項(xiàng)1、點(diǎn)燃汞燈后不可立即關(guān)閉，以免燈內(nèi)汞蒸發(fā)不完全而損壞電極，一般需要等15min后方可關(guān)閉；2、高壓汞燈關(guān)閉后不能立即重新打開，需經(jīng)15min后汞燈冷卻后才能再啟動(dòng)，否則會(huì)影響汞燈壽命；3、熒光幾乎都較弱，應(yīng)在較暗的室內(nèi)進(jìn)行；4、高壓汞燈散發(fā)大量熱能。燈室必須有良好的散熱條件，工作環(huán)境溫度不宜太高；5、防止紫外線對(duì)眼睛的損害，觀察過程應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡；...2023/6/4466、由于熒光衰減或猝滅，避免長(zhǎng)時(shí)間在熒光下觀察同一部位，暫時(shí)不觀察時(shí)，應(yīng)用阻光擋板阻擋激發(fā)光；7、用油鏡觀察時(shí)，應(yīng)用“無熒光油”；8、熒光顯微鏡光源壽命有限，超過90min，超高壓汞燈發(fā)光強(qiáng)度逐漸下降，熒光減弱，所以每次使用1~2h，最多不超過2~3h；9、電源最好裝穩(wěn)壓器，電壓不穩(wěn)不僅會(huì)降低汞燈的壽命，也會(huì)影響鏡檢的效果。...第四節(jié)激光掃描共聚焦顯微鏡

的構(gòu)造及使用方法2023/6/447...2023/6/4激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的，是當(dāng)今世界上最先進(jìn)的分子生物學(xué)分析儀器之一。它是在傳統(tǒng)熒光顯微鏡成像的基礎(chǔ)上加裝激光掃描裝置，使用紫外線或可見光激發(fā)熒光探針，利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像處理，從而得到細(xì)胞或組織內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)的熒光圖像，以及在亞細(xì)胞水平上觀察諸如Ca2+、pH值、膜電位等生理信號(hào)及細(xì)胞形態(tài)的變化。LSCM具有快速、實(shí)時(shí)、定性、定量、定位的進(jìn)行分析測(cè)量的功能，尤其是可進(jìn)行活細(xì)胞的無損傷測(cè)定，利用強(qiáng)大的計(jì)算機(jī)圖像處理技術(shù)將一定厚度范圍內(nèi)的細(xì)胞或結(jié)構(gòu)的虛擬光學(xué)切片進(jìn)行三維重塑工作，再現(xiàn)細(xì)胞或組織的微細(xì)三維結(jié)構(gòu)。48...2023/6/4

LSCM已廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、生理學(xué)、病理學(xué)、解剖學(xué)、胚胎學(xué)、免疫學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)等領(lǐng)域。目前，LSCM主要生產(chǎn)廠家，如：德國(guó)的蔡司公司(ZeissCo.)，萊卡公司(LeicaCo.)，美國(guó)的伯樂公司(Bio-RadCo.)，子午線公司(Meridianco.)，日本的尼康公司(NikonCo.)等，

已經(jīng)從激光器、去卷積技術(shù)、多光子激發(fā)技術(shù)到各種圖像處理軟件等，不斷地推出新產(chǎn)品和相關(guān)附屬設(shè)備。49...一、原理與應(yīng)用2023/6/41、基本原理激光掃描共聚焦顯微鏡利用激光束經(jīng)照明針孔形成點(diǎn)光源對(duì)標(biāo)本內(nèi)焦平面上的每一點(diǎn)掃描，標(biāo)本上的被照射點(diǎn)在探測(cè)針孔處成像，由探測(cè)針孔后的光電倍增管(PMT)或冷電偶器件(cCCD)逐點(diǎn)或逐線接收，迅速在計(jì)算機(jī)監(jiān)視器屏幕上形成熒光圖像。照明針孔與探測(cè)針孔相對(duì)于物鏡焦平面是共軛的，焦平面上的點(diǎn)同時(shí)聚焦于照明針孔和發(fā)射針孔，焦平面以外的點(diǎn)不會(huì)在探測(cè)針孔處成像，這樣得到的共聚焦圖像是標(biāo)本的光學(xué)橫斷面，克服了普通顯微鏡圖像模糊的缺點(diǎn)，因而得到的是組織或細(xì)胞微細(xì)結(jié)構(gòu)的圖像。50...2023/6/42、應(yīng)用（1）原位鑒定組織或細(xì)胞內(nèi)生物大分子，觀察細(xì)胞及亞細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)原位檢測(cè)細(xì)胞的核酸。激光掃描共聚焦顯微術(shù)通過成像顯示出細(xì)胞內(nèi)核酸的分布特征及含量，常用于細(xì)胞核定位及形態(tài)學(xué)觀察、檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制及斷裂、染色體的定位觀察等。

用于激光掃描共聚焦顯微鏡的核酸探針主要有：吖啶橙(AO)、碘化丙錠(PI)、Hoechst33342和Hoechst33258、4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)等。51...2023/6/4AO和PI既可標(biāo)記DNA又可標(biāo)記RNA，如需獲得單獨(dú)的DNA或RNA分布，染色前可用RNA酶或DNA酶處理細(xì)胞。PI不能進(jìn)入完整的細(xì)胞膜，不能用來標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)的DNA和RNA。Hoechst33342和Hoechst33258是DNA特異性熒光探針，可對(duì)活細(xì)胞DNA進(jìn)行熒光染色。DAPI也是DNA特異探針，但對(duì)活細(xì)胞是半通透性的，可用于固定細(xì)胞的染色。在熒光原位雜交中，常選用異硫氰酸熒光素(FITC)、羅丹明、四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)。52...2023/6/4原位檢測(cè)蛋白質(zhì)、抗體及其他分子。利用免疫熒光技術(shù)可以在組織切片(細(xì)胞、染色體或亞細(xì)胞水平)原位檢測(cè)出抗原分子，包括蛋白質(zhì)、多肽、酶、激素、磷脂、多糖等。應(yīng)用激光掃描共聚焦顯微鏡是目前對(duì)免疫熒光樣品定位及形態(tài)觀察的最佳方法。常見的利用熒光定位的方法主要是單熒光定位和多重?zé)晒鈽?biāo)記定位，將激光掃描共聚焦顯微鏡定位的精確性與抗原抗體反應(yīng)的高度靈敏性結(jié)合起來，從而獲得檢測(cè)物質(zhì)的定性、定位及定量結(jié)果。綠色熒光蛋白(GFP)已成為跟蹤活組織或細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)及蛋白質(zhì)定位的標(biāo)記物，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察GFP不僅可以分析目的基因的生物學(xué)功能和特性，還能蛋白質(zhì)定位、細(xì)胞骨架研究。53...2023/6/4檢測(cè)細(xì)胞凋亡。通過觀察細(xì)胞膜、核的形態(tài)、凋亡小體，TUNEL(原位末端標(biāo)記法)及Annexin-V檢測(cè)法，了解標(biāo)記熒光的細(xì)胞的形態(tài)、檢測(cè)凋亡的進(jìn)程及測(cè)定細(xì)胞凋亡過程中鈣的變化等，從而使細(xì)胞凋亡的結(jié)果更具說服力。細(xì)胞器觀察與測(cè)定。實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌?，?biāo)記細(xì)胞器的方法不同。直接標(biāo)記法可以直接觀察細(xì)胞器形態(tài)、數(shù)量的變化。常見的探針有：DAMP、中性紅標(biāo)記溶酶體，二乙基草酸碳花青碘化物標(biāo)記內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，5,5’,6,6’-四乙基苯并咪唑基碳花青碘化物標(biāo)記線粒體。根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，選擇不同的熒光探針，還可以檢測(cè)細(xì)胞的融合，觀察細(xì)胞骨架。54...2023/6/4（2）活細(xì)胞或組織功能的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子、pH值和其他離子的動(dòng)態(tài)分析。通過一些專用熒光探針，可對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子、鈉離子及pH值等作熒光標(biāo)記，并對(duì)它們進(jìn)行比率值和濃度梯度變化測(cè)定。由于細(xì)胞內(nèi)鈣離子為傳遞信息的第二信使，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)分化起著重要作用，通過單標(biāo)記或雙標(biāo)記對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子和其他離子的熒光強(qiáng)度和分布精確測(cè)定，測(cè)定樣品達(dá)到毫秒級(jí)的快速變化。借助光學(xué)切片功能可以測(cè)量樣品深層的熒光分布以及細(xì)胞光學(xué)切片的生物化學(xué)特性的變化。通過不同時(shí)間段的檢測(cè)可測(cè)定細(xì)胞內(nèi)離子的擴(kuò)散速率，了解它對(duì)腫瘤啟動(dòng)因子、生長(zhǎng)因子等刺激的反應(yīng)。55...2023/6/4細(xì)胞間通信和膜的流動(dòng)性。動(dòng)物和植物細(xì)胞中縫隙連接介導(dǎo)的細(xì)胞間通信在細(xì)胞增殖和分化中起著重要作用。通過測(cè)量細(xì)胞縫隙連接分子的轉(zhuǎn)移，可以研究腫瘤啟動(dòng)因子和生長(zhǎng)因子對(duì)縫隙連接介導(dǎo)的胞間通信的抑制作用及細(xì)胞內(nèi)鈣離子、pH值等對(duì)縫隙連接作用的影響，并監(jiān)測(cè)環(huán)境毒素和藥物在細(xì)胞增殖和分化中所起到的作用。選定經(jīng)熒光染色后的細(xì)胞，借助于光漂白作用或光損傷作用使細(xì)胞部分或整體不發(fā)熒光，實(shí)時(shí)觀察檢測(cè)熒光的恢復(fù)過程，可直接反映細(xì)胞間通信結(jié)果。細(xì)胞膜的流動(dòng)性在進(jìn)行膜的磷脂酸組成分析、藥物作用點(diǎn)和藥物作用效應(yīng)、測(cè)定溫度反應(yīng)和物種比較方面有重要作用。細(xì)胞膜熒光探針受到極化光線激發(fā)后，發(fā)射光極性依賴于熒光分子的旋轉(zhuǎn)，這種有序的運(yùn)動(dòng)自由度取決于熒光分子周圍的膜流動(dòng)性，所以極性測(cè)量能間接反映細(xì)胞膜的流動(dòng)性。56...2023/6/4熒光光漂白恢復(fù)(FRAP)是用來測(cè)定活細(xì)胞的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，借助于高強(qiáng)度脈沖激光來照射細(xì)胞某一區(qū)域，造成該區(qū)域熒光分子的光猝滅，該區(qū)域周圍的非猝滅熒光分子會(huì)以一定的速率向受照射區(qū)域擴(kuò)散，該擴(kuò)散速率可通過低強(qiáng)度激光掃描探測(cè)，因而可得到活細(xì)胞的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。激光掃描共聚焦顯微鏡可以控制光猝滅作用，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)分子擴(kuò)散率和恢復(fù)速率，反映細(xì)胞結(jié)構(gòu)和活動(dòng)機(jī)制。廣泛用于研究細(xì)胞骨架構(gòu)成、核膜結(jié)構(gòu)、跨膜大分子遷移率、細(xì)胞間通訊等方面的研究?；\鎖-解籠鎖測(cè)定，這是一種光活化測(cè)定功能。生物活性產(chǎn)物或其他化合物處于籠鎖狀態(tài)時(shí)，其功能封閉，一旦被特異波長(zhǎng)的瞬間光照射后，產(chǎn)生光活化解籠鎖，恢復(fù)原有的活性和功能，在細(xì)胞增殖分化等生物代謝過程中發(fā)揮功能。激光掃描共聚焦顯微鏡可以控制探針的瞬間光分，選取特定的照射時(shí)間和波長(zhǎng)，從而達(dá)到人為控制的多種活性產(chǎn)物和其他化合物在生物代謝中發(fā)揮功能的時(shí)間和空間作用。57...2023/6/4黏附細(xì)胞分選和顯微手術(shù)。采用臺(tái)掃描方式的激光掃描共聚焦顯微鏡，其激光束固定在顯微鏡的光軸上，可對(duì)載物臺(tái)上的樣品作精確的定位掃描，從而對(duì)所要選擇的細(xì)胞進(jìn)行分選。分選方法有二：一是光刀切割法，將細(xì)胞貼壁培養(yǎng)在特制培養(yǎng)皿上，利用高能激光在所選細(xì)胞周圍作八角形切割，只在其間保留所選細(xì)胞，選擇條件取決于特定熒光和細(xì)胞形態(tài)學(xué)參數(shù)，這種分選方法特別適于選擇數(shù)量較少的細(xì)胞，如突變細(xì)胞、轉(zhuǎn)移細(xì)胞和雜交瘤細(xì)胞等；另一種是激光消除法，用高能激光自動(dòng)殺滅不需要的細(xì)胞，留下完整的活細(xì)胞亞群繼續(xù)培養(yǎng)，這種方式取決于細(xì)胞熒光特性，適于對(duì)數(shù)量較多的細(xì)胞選擇。58...2023/6/4激光光陷阱技術(shù)，又稱為光攝技術(shù)，是利用光學(xué)梯度力形成的光陷阱，產(chǎn)生具有傳統(tǒng)機(jī)械鑷子挾持和操縱微小物體的功能。當(dāng)微米級(jí)范圍的顆粒落入一個(gè)非均勻光場(chǎng)中，它將趨于特定的平衡位置，如果沒有外界強(qiáng)有力的干擾，物體不會(huì)偏離光學(xué)中心。由于外界作用和粒子自身運(yùn)動(dòng)等原因產(chǎn)生的中心偏離也會(huì)很快恢復(fù)原位，光造成一個(gè)勢(shì)能較低的陷阱區(qū)域，當(dāng)物體的動(dòng)能不能克服周圍勢(shì)壘時(shí)，它將留在陷阱內(nèi)。這種固定是光子動(dòng)量的結(jié)果，與照明強(qiáng)度和波長(zhǎng)直接有關(guān)。較大物體比較小的結(jié)構(gòu)需要更多的陷阱能量。這項(xiàng)新技術(shù)廣泛應(yīng)用于染色體移動(dòng)、細(xì)胞器移動(dòng)、細(xì)胞骨架彈性測(cè)量、細(xì)胞周期和調(diào)控研究及分子動(dòng)力原研究等方面，尤其是在探測(cè)植物細(xì)胞骨架時(shí)，光陷阱是目前能探測(cè)其彈性和流變性的唯一技術(shù)。59...顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)

顯微鏡是激光共聚焦顯微鏡的主要組件，它決定了系統(tǒng)的成像質(zhì)量。通常有倒置和正置兩種形式，前者在活細(xì)胞檢測(cè)等生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中使用更廣泛。顯微鏡光路以無限遠(yuǎn)光學(xué)系統(tǒng)為佳，可方便地在其中插入光學(xué)選件而不影響成像質(zhì)量和測(cè)量精度。物鏡應(yīng)選取大數(shù)值孔徑和平場(chǎng)復(fù)消色差物鏡，有利于熒光的采集和成像的清晰。物鏡組的轉(zhuǎn)換、濾色片組的選取、載物臺(tái)的移動(dòng)調(diào)節(jié)、焦平面的記憶鎖定都應(yīng)由計(jì)算機(jī)自動(dòng)控制。2023/6/460二、儀器構(gòu)造...掃描裝置激光掃描共聚焦顯微鏡使用的掃描裝置有兩類：臺(tái)掃描系統(tǒng)和鏡掃描系統(tǒng)。臺(tái)掃描通過步進(jìn)馬達(dá)驅(qū)動(dòng)載物臺(tái)，位移精度可達(dá)0.1μm，能有效消除成像點(diǎn)橫向像差，使樣品信號(hào)強(qiáng)度不受探測(cè)位置的影響，可準(zhǔn)確定位、定量地掃描檢測(cè)視野中每一物點(diǎn)的光強(qiáng)度。鏡掃描有雙鏡掃描和單鏡掃描兩種，通過轉(zhuǎn)鏡完成對(duì)樣品的掃描。由于轉(zhuǎn)鏡只需偏轉(zhuǎn)很小角度就能涉及很大的掃描范圍，圖像采集速度大大提高，512×512像素幅面每秒可達(dá)4幀以上，有利于壽命短的離子作熒光測(cè)定。掃描系統(tǒng)的工作程序由計(jì)算機(jī)自動(dòng)控制。2023/6/461...激光光源系統(tǒng)激光掃描共聚焦顯微鏡使用的激光光源有單激光和多激光系統(tǒng)。氪氬離子激光器是可見光范圍內(nèi)使用的多光譜激光，發(fā)射波長(zhǎng)488nm、568nm和647nm分別為藍(lán)光、綠光和紅光。大功率氬離子激光器是紫外線和可見光混合激光器，發(fā)射波長(zhǎng)為351~364nm、488nm和514nm分別為紫外線、藍(lán)光和綠光。多激光器系統(tǒng)在可見光范圍使用氬離子激光器，發(fā)射波長(zhǎng)488nm和514nm的藍(lán)綠光；氦氖激光器發(fā)射波長(zhǎng)為633nm的紅光；紫外線選用氬離子激光器，波長(zhǎng)為351~364nm。照射到樣品上激光能量的大小，可以由激光電流調(diào)節(jié)激光器或聲光控制器進(jìn)行調(diào)節(jié)。激光光源系統(tǒng)以激光器為核心，還包括冷卻系統(tǒng)和穩(wěn)壓電源。。2023/6/462...檢測(cè)系統(tǒng)激光掃描共聚焦顯微鏡為多通道熒光采集系統(tǒng)，光路上要求至少有3個(gè)熒光通道和1個(gè)透射光通道，樣品發(fā)射熒光的探測(cè)器為感光靈敏度高的光電倍增管PMT，配有高速12位A/D轉(zhuǎn)換器，