生物技術(shù)制藥第四章抗體制藥演示文稿

生物技術(shù)制藥——第四章抗體制藥演示文稿當(dāng)前第1頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)（優(yōu)選）生物技術(shù)制藥——第四章抗體制藥當(dāng)前第2頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)

一.抗體工程與抗體藥物

1890年Behring和北里柴三郎發(fā)現(xiàn)白喉抗毒素,建立了血清療法,開創(chuàng)了抗體制藥。這是在血清中發(fā)現(xiàn)的第一種抗體。這種含有抗體的血清稱之為免疫血清。

1937年Tiselius用電泳法將血清蛋白分離為白蛋白、α、β、γ球蛋白，并證明抗體活性主要存在于γ球蛋白組分。

當(dāng)前第3頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)

抗體是指能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合具有免疫功能的球蛋白。

抗體的產(chǎn)生：機(jī)體免疫系統(tǒng)受抗原刺激后，B淋巴細(xì)胞被活化增殖和分化為漿細(xì)胞，由漿細(xì)胞合成和分泌的球蛋白。當(dāng)前第4頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)20世紀(jì)60年代發(fā)現(xiàn)多發(fā)性骨髓瘤是漿細(xì)胞癌變形成的惡性增殖性疾病。病人血清中出現(xiàn)同抗體結(jié)構(gòu)類似的球蛋白，統(tǒng)稱為免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。所以Ig是化學(xué)結(jié)構(gòu)的概念，而抗體是生物學(xué)功能的概念，所有抗體都是Ig，但并非所有Ig都是抗體。。當(dāng)前第5頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)抗體與細(xì)菌、病毒或毒素等抗原結(jié)合，通過下列3中或其中一種方式綜合和除去有害物質(zhì)：1.直接使抗原失去活性2.使免疫效應(yīng)細(xì)胞將其吞噬并加以破壞3.使抗原表面弱化從而易于受補(bǔ)體破壞當(dāng)前第6頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)免疫球蛋白（Immunoglobulin,Ig）破傷風(fēng)毒素當(dāng)前第7頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)免疫球蛋白抗體分子（antibody,Ab）是由漿細(xì)胞合成和分泌的，而每一種漿細(xì)胞克隆可以產(chǎn)生一種特異的抗體分子，所以血清中的抗體是多種抗體分子的混合物，它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)是不均一的，而且含量很少，不易純化，是抗體分子結(jié)構(gòu)分析的困難。多發(fā)性骨髓瘤是由漿細(xì)胞無限增殖形成的細(xì)胞克隆，由于所有瘤細(xì)胞的遺傳特性相同，因此它們合成和分泌的蛋白質(zhì)分子在化學(xué)結(jié)構(gòu)上是均一的。這種蛋白分子存在于血液中的稱為骨髓瘤蛋白（meylomaprotein,M）或M蛋白，亦可在尿液中發(fā)現(xiàn)稱為本周蛋白(BenceJones,BJ)。由于骨髓瘤蛋白（M蛋白）是均一性球蛋白分子，并證明本周蛋白（BJ）是Ig分子的L鏈，很容易從患者血液和尿液中分離純化這種蛋白，并可對來自不同患者的標(biāo)本進(jìn)行比較分析，使得對Ig分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、抗原性、生物學(xué)活性以及其基因結(jié)構(gòu)等方面的研究者有了重大突破。當(dāng)前第8頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)定義免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）即抗體（antibody，Ab）是血液和組織液中一類糖蛋白，由B細(xì)胞接受抗原刺激后增殖分化為漿細(xì)胞所產(chǎn)生，使體液免疫的重要效應(yīng)分子當(dāng)前第9頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)1890年，Behring和北里在德國Koch實(shí)驗(yàn)室從豚鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了第一種抗體：

白喉抗毒素，從而挽救了成千上萬的白喉患兒。從60%死亡率降到26%。獲1901年的第一屆諾貝爾獎Ab的發(fā)現(xiàn)：當(dāng)前第10頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)早在40年代初期Tiselius和Kabat就證實(shí)了抗體活性與血清丙種球蛋白組分相關(guān)。他們用肺炎球菌多糖免疫家兔，可獲得高效價(jià)免疫血清。然后加入相應(yīng)抗原吸收以除去抗體，將去除抗體的血清進(jìn)行電泳圖譜分析，發(fā)現(xiàn)丙種球蛋白（γ-G）組分明顯減少，從而證明了抗體活性是存在于丙種球蛋白內(nèi)。當(dāng)前第11頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)抗體與免疫球蛋白的發(fā)現(xiàn)（1939TiseliusandKabat）ImmuneseraNormalsera

γ球蛋白=丙種球蛋白=抗體分子當(dāng)前第12頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)免疫球蛋白的存在形式分泌型Ig（secretedIg，sIg）主要存在于血液和組織液中，發(fā)揮各種免疫功能膜型Ig（membraneIg，mIg）位于B細(xì)胞膜上，構(gòu)成B細(xì)胞表面的抗原受體當(dāng)前第13頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)Ig分子基本結(jié)構(gòu)是由四條肽鏈組成的，包括二條較小的輕鏈和二條較大的重鏈，輕鏈與重鏈之間是由二硫鍵連接形成Ig分子單體，分為氨基端（N端），羧基端（C端）。免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)N端C端當(dāng)前第14頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)當(dāng)前第15頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)重鏈（heavychain，H鏈）450-550個(gè)氨基酸殘基組成，分子量50-75KD，含糖數(shù)量不同，4-5個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵。根據(jù)H鏈恒定區(qū)抗原性的差異可將其分為5類，μ、γ、α、δ、ε鏈，相應(yīng)的免疫球蛋白分別稱為：IgM，IgG，IgA，IgD和IgE。同一類Iｇ的鉸鏈區(qū)氨基酸組成和重鏈二硫鍵的數(shù)目、位置也不同，據(jù)此可對同類Iｇ分為不同的亞類：IgG1-IgG4；IgA1,IgA2。重鏈和輕鏈當(dāng)前第16頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)當(dāng)前第17頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)輕鏈（lightchain，L鏈）214個(gè)氨基酸殘基組成，通常不含碳水化合物，分子量為25KD，有兩個(gè)由鏈內(nèi)二硫鍵組成的環(huán)肽，L鏈可分為：Kappa（κ）與lambda（λ）2個(gè)亞型。每一輕鏈上的型別只能屬于兩型別中的某一型別,而不能兩者兼而有之,亦即屬于Kappa型或是Lambda型，而不能有Kappa-Lambda型者。λ鏈恒定區(qū)個(gè)別氨基酸的差異可分亞型：λ1－λ4當(dāng)前第18頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)Kappa型和Lambda型的不同主要表現(xiàn)在氨基酸序列和二硫鏈位置的不同。但是，不同種屬的Kappa型或Lambda型之間有較大的相似性，不同種屬的Kappa/Lambda的比值并不相同，一般Kappa和Lambda型與重鏈配對有同樣的可能性，但從某些種屬基因表達(dá)的研究得知，Kappa基因的重排較先發(fā)生于Lambda基因，這可能也是Kappa型出現(xiàn)較多和重鏈配對的另一原因。當(dāng)前第19頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)κ和λ的比例異常可能反映免疫系統(tǒng)的異常。正常人血清中，65%的輕鏈為Kappa型，35%為Lambda型，大約比例為2：1(Kappa/Lambda=1.9±0.36)

Kappa/Lambda的比率對于不同類型的免疫球蛋白略有不同，如IgG的比值為2。這個(gè)比率也隨不同年齡階段的人群而有所改變，同時(shí)有人種和地區(qū)差異。但對于正常人這個(gè)比率基本恒定。在漿細(xì)胞瘤中由于一個(gè)漿細(xì)胞惡性增殖，使Kappa或Lambda含量迅速發(fā)生變化，比率改變，這可以用來鑒別Kappa型或Lambda型骨髓瘤。B細(xì)胞在免疫應(yīng)答中被激活化為漿細(xì)胞，每一種漿細(xì)胞只分泌一種類型的抗體，即一個(gè)型，一個(gè)亞型，一個(gè)基因型的抗體。正常人免疫球蛋白的重鏈和輕鏈所含氨基酸數(shù)量差別很大，合成時(shí)間也不同：合成一條重鏈需十八分鐘，而合成一條輕鏈只需十分鐘。所以正常的免疫球蛋白合成會造成輕鏈過剩，多余的輕鏈運(yùn)輸?shù)侥I臟，10%被分解，80%重吸收，另外的10%從尿中排出。當(dāng)前第20頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)在免疫球蛋白合成異常激活時(shí)，重鏈和輕鏈的合成速度迅速提高，合成一條重鏈約需2.5min;而合成一條輕鏈需1min，從而使得輕鏈的過剩更加嚴(yán)重,尿蛋白排出增加可達(dá)到1mg/ml,且都為一個(gè)輕鏈型,從而使Kappa/Lambda比率遠(yuǎn)大于或小于2。輕鏈的異常表達(dá)和臨床?。憾嗫寺≡鲋澈土夹悦庖咔虻鞍自鲋嘲Y多克隆增殖有兩種含義:

a.五種免疫球蛋白含量的全面上升;

b.雖只有一種免疫球蛋白上升但這種免疫球蛋白的Kappa/Lambda的比例正常,為1/2。

以上兩種增殖都是出現(xiàn)輕鏈的增加，可以達(dá)到200ug/ml.可用常規(guī)方法檢測，但Kappa/Lambda比值不變。當(dāng)前第21頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)當(dāng)前第22頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)可變區(qū)和恒定區(qū)可變區(qū)（Variableregion，V區(qū)）：

免疫球蛋白輕鏈和重鏈中靠近N端約 110氨基酸序列變化較大的區(qū)域稱為

可變區(qū)。VH和VL可變區(qū)（V區(qū)）位于Ig分子的N端，約占輕鏈的l/2（VL）和重鏈（VH）的1/4或l/5；它決定了抗體與抗原結(jié)合的特異性；在VL和VH中某些局部區(qū)域的氨基酸組成與排列具有更高的變化程度，此為高變區(qū)（hypervariableregion,HVR）；高變區(qū)即是抗體與抗原（決定簇）特異性結(jié)合的位置，又稱為互補(bǔ)決定區(qū)（complementarity-determiningregion,CDR）；在V區(qū)中非HVR部位的氨基酸組成和排列相對比較保守，稱為骨架區(qū)（frameworkregion）。

當(dāng)前第23頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)VH和VL各有3個(gè)區(qū)域的氨基酸組成和排列順序高度可變，稱為高變區(qū)（HVR）或互補(bǔ)決定區(qū)（complementarity-determiningregion,CDR）高變區(qū)為抗體與抗原的結(jié)合位置，VL和VH的HVR1，HVR2，HVR3又分別稱為CDR1，CDR2，CDR3，其中CDR3具有更高的高變程度，H鏈在與抗原結(jié)合中起重要的作用。在V區(qū)中，CDR之外區(qū)域的氨基酸組成和排列順序相對不易變化，稱為骨架區(qū)（frameworkregion,FR）。當(dāng)前第24頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)醫(yī)學(xué)免疫學(xué)上海第二醫(yī)科大學(xué)免疫教研室當(dāng)前第25頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)當(dāng)前第26頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)恒定區(qū)（constantregion，C區(qū)）：靠近C端氨基酸序列相對穩(wěn)定的區(qū)域，L鏈C端1/2處，105個(gè)氨基酸，H鏈C端3/4處，331-431個(gè)氨基酸。CH和CL在同一種屬動物中是比較恒定的，是制備第二抗體進(jìn)行標(biāo)記的重要基礎(chǔ)。不同類IｇCH的長度不一同一種屬的個(gè)體，所產(chǎn)生針對不同抗原的同一類別Iｇ，其C區(qū)氨基酸組成和排列順序比較恒定，其免疫原性相同，但V區(qū)不同。當(dāng)前第27頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)鉸鏈區(qū)（hingeregion）:

位于CH1和CH2之間，包括重鏈鏈間二硫鍵，含有豐富的脯氨酸（構(gòu)成膠原纖維的重要成分）。具有柔曲性，不形成螺旋，可以伸展、彎曲和轉(zhuǎn)動。有利于與不同距離的抗原表位結(jié)合，又有利于暴露抗體分子的補(bǔ)體結(jié)合點(diǎn)，同時(shí)對蛋白酶敏感，Ig被水解易在此區(qū)發(fā)生裂解。易被木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等酶水解IｇM和IｇE無鉸鏈區(qū)當(dāng)前第28頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)Flexibilityofimmunoglobulins當(dāng)前第29頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)當(dāng)前第30頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)鏈內(nèi)二硫鍵折疊成球形區(qū)稱為結(jié)構(gòu)域或功能區(qū)（domain），約由110個(gè)氨基酸組成。L鏈功能區(qū)：2個(gè)，（VL，CL各一個(gè)）H鏈功能區(qū)：IgG，IgA，IgD，4個(gè)（V區(qū)1個(gè)，C區(qū)3個(gè)）,IgM，IgE，5個(gè)（V區(qū)1個(gè)，C區(qū)4個(gè)）免疫球蛋白超家族（IｇSF）結(jié)構(gòu)域當(dāng)前第31頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)免疫球蛋白的功能區(qū)構(gòu)成:Ig分子每一肽鏈內(nèi)部由大約110個(gè)氨基酸形成一個(gè)亞單位，氨基酸的序列具有相似性或同源性，其內(nèi)由鏈內(nèi)二硫鍵構(gòu)成肽環(huán)，稱為功能區(qū)。功能：（1）VL和VH是與抗原結(jié)合的部位；

（2）CH和CL具有某些同種異型（allotype）的遺傳標(biāo)記；

（3）IgG的CH2和IgM的CH3具有補(bǔ)體結(jié)合位點(diǎn)→啟動補(bǔ)體經(jīng)典激活途徑；（4）IgG可通過胎盤；（5）IgG的CH3和IgE的CH4可與多種細(xì)胞膜表面的FcR結(jié)合，介導(dǎo)不同生物學(xué)效應(yīng)。當(dāng)前第32頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)當(dāng)前第33頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)免疫球蛋白的基本結(jié)構(gòu)當(dāng)前第34頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)J鏈與分泌片

J鏈（joiningchain）：是一富含半胱氨酸的多肽鏈，由漿細(xì)胞合成，存在于IgA，IgM中，在其組成和體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)中具有一定作用，穩(wěn)定多聚體。

分泌成分（secretorycomponent，SC）：分泌成分是IgA上的一個(gè)輔助成分，由粘膜上皮細(xì)胞合成，并在IgA二聚體形成后通過二硫鍵連接到免疫球蛋白分子上，分泌至粘膜表面。穩(wěn)定分泌型IgA的結(jié)構(gòu)，對抵抗外分泌液中的蛋白水解酶的降解具有重要作用，使之避免蛋白酶的消化水解。當(dāng)前第35頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)當(dāng)前第36頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)免疫球蛋白的水解片段鉸鏈區(qū)有蛋白水解酶的酶切位點(diǎn)。木瓜蛋白酶在重鏈間二硫鍵的N端將其裂解成分子量基本相等的三個(gè)片段：2個(gè)Fab和1個(gè)Fc片段。Fab能夠與抗原結(jié)合，稱為抗原結(jié)合片段（Fab），F(xiàn)c能夠與細(xì)胞表面的Fc受體結(jié)合。Fc具有免疫原性和抗原性。因它容易形成結(jié)晶，故稱為可結(jié)晶片段（Fc）。當(dāng)前第37頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)胃蛋白酶在重鏈間二硫鍵的羧基端將其裂解成分子量兩個(gè)不同的片段：一個(gè)由兩個(gè)V區(qū)連在一起的大片段F（abˊ）2和一些Fc裂解的小碎片pFcˊ。pFcˊ分子量小，喪失免疫原性。F（abˊ）2片段為雙價(jià)，可同時(shí)結(jié)合兩個(gè)抗原表位，發(fā)生凝集和沉淀反應(yīng)。F（abˊ）2片段廣泛應(yīng)用于生物制品當(dāng)前第38頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)當(dāng)前第39頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)重鏈C區(qū)分類輕鏈C區(qū)分型鉸鏈區(qū)氨基酸組成和重鏈二硫鍵分亞類免疫球蛋白的類型：類、亞類、型、亞型CCVV輕鏈C區(qū)N端氨基酸的差異分亞型當(dāng)前第40頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)免疫球蛋白的血清型用Ig免疫異種動物、同種異體或在自身體內(nèi)可激發(fā)機(jī)體的特異性免疫應(yīng)答，產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，用血清學(xué)的方法可以測定和分析Ig的抗原性，稱此為Ig的血清型當(dāng)前第41頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)免疫球蛋白的血清型同種型（isotype）同一種屬每個(gè)個(gè)體都具有的免疫球蛋白的抗原特異性，其抗原決定簇主要存在于Ig的C區(qū)。為種屬型標(biāo)志。同種異型（allotype）同一種屬不同個(gè)體之間免疫球蛋白也具有的差異性，主要反映在C區(qū)和V區(qū)上的一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸的差異。為個(gè)體型標(biāo)志。當(dāng)前第42頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)獨(dú)特型（idiotype,Id)：同一種屬、同一個(gè)體來源的抗體分子，主要由于其CDR區(qū)的氨基酸序列的不同，可顯示不同的免疫原性，稱為獨(dú)特型，是每個(gè)免疫球蛋白分子所特有的抗原特異性標(biāo)志。當(dāng)前第43頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)當(dāng)前第44頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)免疫球蛋白的生物學(xué)活性V區(qū)的功能抗體與抗原的特異性結(jié)合：刺激抗體產(chǎn)生的物質(zhì)為抗原，抗體分子只與其相應(yīng)的抗原發(fā)生結(jié)合稱為特異性結(jié)合。例如，白喉抗毒素只能中和白喉?xiàng)U菌外毒素，而不能中和破傷風(fēng)外毒素，反之亦然。當(dāng)前第45頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)中和病毒、外毒素、介導(dǎo)抗原清除當(dāng)前第46頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)C區(qū)的功能激活補(bǔ)體 IgM、IgG1~3

激活補(bǔ)體經(jīng)典途徑

凝聚的IgA或IgG4

激活補(bǔ)體替代途徑細(xì)胞親嗜性（IｇG和IｇE）調(diào)理作用（opsonization）：抗體IgG的Fc段與中性粒細(xì)胞上的IgGFc受體結(jié)合，從而增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的吞噬作用ADCC(抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用):具有殺傷活性的細(xì)胞如NK細(xì)胞通過其表面表達(dá)的Fc受體識別結(jié)合于靶抗原上的抗體Fc段，直接殺傷靶抗原；介導(dǎo)I型超敏反應(yīng)穿過胎盤和粘膜當(dāng)前第47頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)當(dāng)前第48頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)當(dāng)前第49頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)IgG類抗體與靶細(xì)胞表面抗原特異性結(jié)合，效應(yīng)細(xì)胞（NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞）借助所表達(dá)的IgGFcR與靶細(xì)胞表面IgG的Fc段結(jié)合，從而直接殺傷靶細(xì)胞。當(dāng)前第50頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)五類免疫球蛋白的特性與功能當(dāng)前第51頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)五類免疫球蛋白的特性與功能IgG血清中含量最高，約占血清Ig總量的80%4個(gè)亞類（IgG1，IgG2，IgG3和IgG4）出生后3個(gè)月開始合成，3~5歲接近成人水平半衰期最長（20－23天），親和力高，是再次免疫應(yīng)答的效應(yīng)分子，是最重要的抗感染性抗體通過胎盤（是唯一能夠通過胎盤的抗體：新生兒抗感染中發(fā)揮重要作用）當(dāng)前第52頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)生物學(xué)活性：通過胎盤（新生兒抗感染）；激活補(bǔ)體（裂解細(xì)胞）；

調(diào)理作用（促進(jìn)吞噬）；介導(dǎo)ADCC（細(xì)胞毒作用）。實(shí)際意義：

a.抗感染；

b.自身抗體自身免疫??；

c.介導(dǎo)變態(tài)反應(yīng)(II、III型)；

d.封閉抗體腫瘤細(xì)胞逃逸；

e.親合層析法IgG純化；

f.免疫學(xué)檢測。

當(dāng)前第53頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)五類免疫球蛋白的特性與功能IgM分子量最大（五聚體結(jié)構(gòu)），又稱巨球蛋白，有10個(gè)抗原結(jié)合點(diǎn)。占血清Ig含量的5～10%膜性IgM（serfaceIgM，sIgM）是單體結(jié)構(gòu)，它是B細(xì)胞抗原受體（BCR）是在個(gè)體發(fā)育過程和免疫應(yīng)答過程中出現(xiàn)最早的抗體（可用于感染的早期診斷），臍帶血或新生兒血清中IgM水平升高表明胎兒有宮內(nèi)感染是天然血型抗體。半衰期:5天

血清中特異性IgM水平增高提示有近期感染初次免疫應(yīng)答的主要效應(yīng)分子。當(dāng)前第54頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)當(dāng)前第55頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)五類免疫球蛋白的特性與功能IgA有兩型：血清IgA（單體）和分泌型IgA（二聚體）分泌型IgA是人體外分泌液中的主要抗體。由黏膜相關(guān)淋巴組織（MALT）產(chǎn)生，對防御病原微生物入侵起重要作用，是局部反應(yīng)性抗體。新生兒sIgA合成不足嬰兒可從母乳中獲得半衰期:6天；占血清Ig含量的5～15%；聚合IgA激活補(bǔ)體替代途徑。當(dāng)前第56頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)五類免疫球蛋白的特性與功能IgD

血清IgD含量極低。膜性IgD存在于成熟B細(xì)胞表面，因此，它是成熟B細(xì)胞的主要標(biāo)志。它也是B細(xì)胞抗原受體（BCR）；占血清Ig含量的1%；半衰期:3天。IgE血清中含量最低的抗體(占Ig的0.002%)，半衰期:3天；呼吸道和胃腸道漿細(xì)胞產(chǎn)生。能與肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞表面的IgE-Fc受體結(jié)合，介導(dǎo)Ⅰ型超敏反應(yīng)。與抗寄生蟲感染有關(guān)，過敏性疾病和某些寄生蟲感染患者血清中特異性IgE水平增高。當(dāng)前第57頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)人工制備抗體多克隆抗體（polyclonalantibodies,pAb）：第一代抗體，是指由多克隆B細(xì)胞群產(chǎn)生的、針對多種抗原決定簇的混合抗體。單克隆抗體（monoclonalantibodies,mAb）：第二代抗體，是指由一個(gè)B雜交瘤細(xì)胞活化、增殖、分化產(chǎn)生的子代細(xì)胞克隆分泌的、針對一個(gè)抗原決定簇的抗體。基因工程抗體（geneticallyengineeringantibodies）：第三代抗體當(dāng)前第58頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)

多克隆抗體：病原微生物含有多種抗原決定簇的抗原物質(zhì)，因此這些抗體制劑也是多種抗體的混合物，故稱多克隆抗體。早期采用的抗體藥物主要為多克隆抗體，雖然其在治療多種急性中毒中仍發(fā)揮重要的作用，但是多克隆抗體存在非均一性、異質(zhì)性、不穩(wěn)定性等缺點(diǎn)。當(dāng)前第59頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)當(dāng)前第60頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)1975年Kohler和Milstein首先利用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備出單克隆抗體（monoclonalantibodyMcAb）。單克隆抗體具有高度特異性、均一性、來源穩(wěn)定、可大量生產(chǎn)等特點(diǎn)，為抗體制備和應(yīng)用提供了全新的手段，還促進(jìn)了基礎(chǔ)和臨床醫(yī)學(xué)的發(fā)展。當(dāng)前第61頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)

單克隆抗體作為抗體制劑，在臨床上主要用與疾病的診斷和治療。單克隆抗體檢測與某些疾病有關(guān)的抗原，輔助臨床診斷。用放射性核素標(biāo)記單克隆抗體進(jìn)行腫瘤顯像，做免疫定位診斷。當(dāng)前第62頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)

單克隆抗體用于臨床治療，CD3單克隆抗體作為免疫抑制劑對器官移植免疫排斥有抑制作用。以單克隆抗體作為載體的藥物對腫瘤進(jìn)行定向治療。當(dāng)前第63頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)McAb在免疫導(dǎo)向療法中存在的問題(障礙):

A,McAb均是鼠源性抗體,應(yīng)用于人體內(nèi)可產(chǎn)生人抗鼠抗體(HAMA),加速了排斥反應(yīng),在人體內(nèi)的半衰期只有5~6h,維持有效藥物作用靶組織時(shí)間;

B,完整的抗體分子的相對分子質(zhì)量過大,難以穿透實(shí)體腫瘤組織,達(dá)不到有效的治療濃度.

需要解決的問題:

A,降低McAb的免疫源性;

B,降低McAb的相對分子質(zhì)量.

解決問題的方法或途徑—基因工程技術(shù)

1984年報(bào)道了人—鼠嵌合抗體,之后制備出了改型抗體,單鏈抗體,單域抗體,最小識別單位等多種類型,基本上消除了抗體的鼠源性(免疫源性),相對分子質(zhì)量只有完整抗體分子的1/80~1/3.

當(dāng)前第64頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)二、抗體藥物的特異性單克隆抗體針對特定的單一抗原表位，具有高度的特異性，這是抗體藥物發(fā)揮治療作用的重要基礎(chǔ)。對于抗腫瘤抗體藥物的研究表明，其特異性主要表現(xiàn)在1.與相關(guān)抗原的特異性結(jié)合2.對腫瘤靶細(xì)胞的選擇性殺傷3.在動物體內(nèi)呈靶向性分布4.對相關(guān)的腫瘤顯示更強(qiáng)的療效當(dāng)前第65頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)三、抗體藥物的主要研究方向1.研究新的分子靶點(diǎn)2.免疫檢測技術(shù)的研發(fā)3.抗體的人源化4.抗體藥物分子的小型化5.具有抗體功能的融合蛋白當(dāng)前第66頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)生物制藥：迎接抗體藥物的黃金時(shí)代

抗體藥物具有靶向性，直接與目標(biāo)特異結(jié)合，這一特點(diǎn)在其他藥物很難實(shí)現(xiàn)；同時(shí)藥物副作用小，在臨床上具有廣闊的應(yīng)用前景，目前主要用于腫瘤、自身免疫等疾病的治療。近十一年來，全球抗體藥物市場經(jīng)歷了一個(gè)快速發(fā)展的階段，總銷售額從1997年的3.1億美元增長到2008年的400億美元，復(fù)合增長率高達(dá)55%，而且增長勢頭還在持續(xù)，市場遠(yuǎn)未飽和。很大一部分抗體藥物都已邁入重磅炸彈行列，在2008年全球15大藥品中，抗體藥物占據(jù)了1/3，且排名仍在上升。（2010資料）當(dāng)前第67頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)第二節(jié)單克隆抗體及其制備

單克隆抗體是將抗體產(chǎn)生細(xì)胞與具有無限增殖能力的骨髓瘤細(xì)胞相融合，通過有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細(xì)胞成為純一的單克隆細(xì)胞系而產(chǎn)生的。由于這種抗體是針對一個(gè)抗原決定簇的抗體，又是由單一的B淋巴細(xì)胞克隆產(chǎn)生的，所以稱為單克隆抗體。當(dāng)前第68頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)免疫學(xué)基礎(chǔ)人體和動物都有免疫系統(tǒng)，包括特異性免疫和非特異性免疫，其中特異性免疫又分為體液免疫和細(xì)胞免疫。非特異性免疫主要是由宿主的屏障結(jié)構(gòu)（皮膚、黏膜、血腦屏障、血胎屏障），吞噬細(xì)胞（白細(xì)胞的一種）的吞噬功能，正常組織和體液中的抗菌物質(zhì)（不直接殺死病原體，但能配合免疫細(xì)胞、抗體或其他防御因子使它們發(fā)揮較強(qiáng)的免疫功能，如補(bǔ)體、干擾素。）以及炎癥反應(yīng)（存在于紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板等細(xì)胞和組織重點(diǎn)組胺和5-羥色胺在機(jī)體感染病原體而引起炎癥反應(yīng)時(shí)，可使炎癥部位的毛細(xì)血管迅速擴(kuò)張，血流量增加，毛細(xì)血管通透性增強(qiáng)，大量淋巴細(xì)胞從毛細(xì)血管穿越進(jìn)入炎癥區(qū)）等所組成。當(dāng)前第69頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)當(dāng)機(jī)體受到抗原刺激時(shí)，體內(nèi)的抗原特異性淋巴細(xì)胞識別抗原，然后被活化，發(fā)生一系列的增殖和分化等變化，最終表現(xiàn)出一定的體液免疫或細(xì)胞免疫。細(xì)胞免疫主要是指機(jī)體受到異己物質(zhì)抗原的刺激后，一類小淋巴細(xì)胞—依賴胸腺的T細(xì)胞發(fā)生增生，分化，直接攻擊靶細(xì)胞或間接地釋放一些淋巴因子從而使機(jī)體達(dá)到免疫的過程。而體液免疫是當(dāng)機(jī)體受到抗原刺激后，來源于骨髓的小淋巴細(xì)胞—B淋巴細(xì)胞進(jìn)行增生和分化為漿細(xì)胞，進(jìn)而合成各種免疫球蛋白（抗體），然后在體液中發(fā)揮免疫作用的過程。當(dāng)前第70頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)淋巴系統(tǒng)是循環(huán)系統(tǒng)的一部分，由淋巴管和產(chǎn)生淋巴細(xì)胞和生成抗體的淋巴器官（淋巴結(jié)、扁桃體、脾、胸腺和消化管內(nèi)的各種淋巴組織）組成。要制備單克隆抗體首先要獲得相應(yīng)的抗原，再用抗原免疫動物。雜交瘤技術(shù)是動物細(xì)胞的一種融合技術(shù)。B淋巴細(xì)胞雖然可以被外來的抗原所激活并產(chǎn)生相應(yīng)單一、均勻的特異性抗體，但卻無法在體外進(jìn)行繁殖和傳代；骨髓瘤癌變細(xì)胞在體外具有很強(qiáng)的繁殖能力，將二者進(jìn)行融合，制成雜交瘤細(xì)胞，就可以在體外持續(xù)分泌出成分單一的特異抗體，即單克隆抗體。當(dāng)前第71頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)當(dāng)前第72頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)

一、抗原與動物免疫制備特定抗原的單克隆抗體，首先要制備用于免疫的適當(dāng)抗原，再用抗原進(jìn)行動物免疫。有的抗原可以用化學(xué)合成：地高辛多數(shù)抗原物為混合物須經(jīng)免疫、篩選、克隆化。當(dāng)前第73頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)

為使雜交瘤細(xì)胞穩(wěn)定，采用與骨髓瘤細(xì)胞供體同一品系的動物進(jìn)行免疫。目前常用的骨髓瘤細(xì)胞系多來自BALB/c小鼠和LOU大鼠，因此免疫動物也采用相應(yīng)的品系，BALB/c小鼠最為常用。 在選擇動物時(shí)應(yīng)考慮動物品系的免疫應(yīng)該基因?qū)乖庖邞?yīng)答的影響，比如BALB/c小鼠對抗原不能產(chǎn)生很好地免疫應(yīng)答時(shí)，應(yīng)該用其他品系小鼠或大鼠。當(dāng)前第74頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)

免疫的方法采用體內(nèi)免疫法和體外免疫法。 體內(nèi)免疫法適用于免疫原性強(qiáng)、抗原量較多的情況下，一般用8～12周齡雌性鼠，由靜脈直接注入抗原，可追加免疫，在B淋巴細(xì)胞受到可靠的最大限度的刺激后，迅速增殖、分裂，當(dāng)增殖率最高時(shí)收集B淋巴細(xì)胞。

顆粒性抗原（如細(xì)菌細(xì)胞抗原）的免疫原性強(qiáng)，可不加佐劑，直接注入腹腔107個(gè)細(xì)胞進(jìn)行初次免疫，間隔1～3周，再追加免疫1～2次。當(dāng)前第75頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)

可溶性抗原按每只小鼠10～100μg抗原與弗氏完全佐劑等量混合后注入腹腔內(nèi)，進(jìn)行初次免疫，間隔2～4周，再用不加佐劑原抗原追加免疫1～2次。

一般在采脾細(xì)胞前3日由靜脈注射最后一次抗原（刺激B淋巴細(xì)胞迅速分裂）。當(dāng)前第76頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)

脾內(nèi)免疫法即在麻醉下直接將0.1～0.2ml抗原注入脾臟進(jìn)行免疫。 該法可提高小鼠對抗原的免疫反應(yīng)性，節(jié)省抗原用量（細(xì)胞抗原只需105個(gè)，可溶性抗原只需10μg）。 然而，該法產(chǎn)生IgM類抗體居多，最好用作在常規(guī)免疫基礎(chǔ)上的追加免疫。當(dāng)前第77頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)

體外免疫法用于不能采用體內(nèi)免疫的情況下，如制備人源性單克隆抗體；或在抗原的免疫原性極弱，能引起免疫抑制時(shí)使用。 優(yōu)點(diǎn)：所需抗原少、免疫期短，干擾因素少，但融合后產(chǎn)生的雜交瘤不夠穩(wěn)定。

當(dāng)前第78頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)

體外免疫法基本方法：用4～8周齡BALB/c小鼠的脾臟制成單細(xì)胞懸液，再加入適當(dāng)抗原使其濃度達(dá)0.5～5μg/ml,在5%CO

37°C下培養(yǎng)4～5天,再分離脾細(xì)胞,進(jìn)行細(xì)胞融合。o2當(dāng)前第79頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)二、細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)1.骨髓瘤細(xì)胞的選擇 應(yīng)盡可能選擇自身不合成或至少不分泌任何免疫球蛋白分子或片段的骨髓瘤細(xì)胞作為親本細(xì)胞。細(xì)胞必須處于良好的生長狀態(tài)，對數(shù)生長期最好。還必須具備融合率高、所產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的能力強(qiáng)且長期穩(wěn)定等特點(diǎn)。

2.免疫脾細(xì)胞懸液的制備 取經(jīng)免疫的小鼠，摘除眼球放血，將小鼠處死，無菌摘取脾臟，研磨制取脾淋巴細(xì)胞懸液，洗滌調(diào)整細(xì)胞濃度。當(dāng)前第80頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)3.細(xì)胞融合的方法：

脾細(xì)胞（1×108）

骨髓瘤細(xì)胞（2×107）混合聚乙二醇（PEG）誘導(dǎo)下融合，2分鐘，然后用培養(yǎng)液將融合液緩慢稀釋。

PEG相對分子量4000，濃度為50%，二甲基亞砜增加融合率。當(dāng)前第81頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)關(guān)于PEG相對分子量和濃度越大，其促融率越高，但其黏度和對細(xì)胞的毒性也越大，常用范圍濃度10%-60%，分子量400-6000，最佳范圍濃度40%-50%，分子量4000。為提高融合率可加入二甲基亞砜，以提高細(xì)胞接觸的緊密性。但由于二者都對細(xì)胞有毒性，要嚴(yán)格控制作用時(shí)間和用量。當(dāng)前第82頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)4、融合結(jié)果： 細(xì)胞融合后可產(chǎn)生多種融合，產(chǎn)生脾-脾、脾-瘤、瘤-瘤融合細(xì)胞。 為獲得目的細(xì)胞將融合后的細(xì)胞立即（未融合細(xì)胞壁雜交細(xì)胞繁殖更快，能將融合細(xì)胞淘汰）轉(zhuǎn)入選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)。 常用HAT培養(yǎng)基（用次黃嘌呤H、氨基喋呤A、胸腺嘧啶T配成）。氨基喋呤能阻斷DNA合成的主要途徑，瘤-瘤融合細(xì)胞和瘤細(xì)胞因不能合成DNA而死亡。脾-脾融合細(xì)胞和未融合的瘤細(xì)胞在培養(yǎng)幾天后也迅速死亡，而雜交瘤細(xì)胞則可以存活（利用HGPRT，用H和T合成DNA）。當(dāng)前第83頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)脾細(xì)胞在一般情況下不能連續(xù)培養(yǎng)。骨髓瘤細(xì)胞都是次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）缺乏株，不能利用H和T合成DNA,而脾細(xì)胞中有這種酶，所以只有脾-瘤細(xì)胞才能在HAT選擇培養(yǎng)基上生長。當(dāng)前第84頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)5、培養(yǎng)方法： 將融合的細(xì)胞懸浮于HAT培養(yǎng)基中，加入到96孔板內(nèi)，根據(jù)情況2-3天換液一次，每次吸去二分之一到三分之二培養(yǎng)液，再加入等量新鮮培養(yǎng)液。7-14天改用HT培養(yǎng)液，14天以后用普通的RPMI1640完全培養(yǎng)液，從融合后8~9天就可篩選出產(chǎn)生抗體的陽性克隆。 因?yàn)殡s交瘤數(shù)量很少，多半不易存活，所以通常要加入飼養(yǎng)細(xì)胞才能使其繁殖，常用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、脾細(xì)胞和胸腺細(xì)胞。（作用：能釋放某些生長刺激因子，并能滿足雜交瘤細(xì)胞對細(xì)胞密度的依賴性。）當(dāng)前第85頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)

三、篩選陽性克隆與克隆化

對于最后存活的細(xì)胞要進(jìn)行篩選，看其是否是想要得到的能產(chǎn)生單克隆抗體的融合細(xì)胞，篩選方法應(yīng)微量、快速、特異、敏感、簡便并能一次檢測大批標(biāo)本。

當(dāng)前第86頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)

篩選陽性克隆常用檢測方法有免疫酶技術(shù)、免疫熒光技術(shù)、放射免疫技術(shù)等。 應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室條件及抗原的情況選擇合適的方法。

免疫酶技術(shù)因?yàn)椴恍枰M(jìn)行放射性標(biāo)記，操作簡便，又適用于大批標(biāo)本的檢測，廣泛采用，通過引入生物素-親和素等放大系統(tǒng)可進(jìn)一步提高靈敏度。

免疫酶技術(shù)、放射免疫技術(shù)均可適用于可溶性抗原和顆粒性抗原的抗體檢測。 免疫熒光技術(shù)適用于細(xì)胞抗原的抗體檢測，特別是制備以檢測患者活檢組織標(biāo)本為目的抗體時(shí)，不僅能篩選抗體，還能對所識別的抗原進(jìn)行定位判定。

當(dāng)前第87頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)ELISA用于破傷風(fēng)抗體的篩選當(dāng)前第88頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)AboutELISAELISA是酶聯(lián)接免疫吸附劑測定(Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay)的簡稱。它是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來的一種免疫酶技術(shù)。此項(xiàng)技術(shù)自70年代初問世以來，發(fā)展十分迅速，目前已被廣泛用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)科學(xué)的許多領(lǐng)域。ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對底物的高效催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的試驗(yàn)技術(shù)。由于抗原、抗體的反應(yīng)在一種固相載體——聚苯乙烯微量滴定板的孔中進(jìn)行，每加入一種試劑孵育后，可通過洗滌除去多余的游離反應(yīng)物，從而保證試驗(yàn)結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性。當(dāng)前第89頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測定時(shí)，受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測定方法達(dá)到很高的敏感度。當(dāng)前第90頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)About克隆化克隆化是指單個(gè)細(xì)胞通過無性繁殖而獲得細(xì)胞集團(tuán)的整個(gè)培養(yǎng)過程。這種群體細(xì)胞的生物學(xué)特性和功能完全相同。常用方法：有限稀釋法和軟瓊脂培養(yǎng)法當(dāng)前第91頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)有限稀釋法把雜交瘤細(xì)胞懸液稀釋后，加入到96孔板中，理論上每孔一個(gè)細(xì)胞，第一次克隆化時(shí)用HT培養(yǎng)液，以后的克隆化可以用不含HT的RPMI1640培養(yǎng)液。由于單個(gè)細(xì)胞難以存活，克隆化時(shí)需要加入飼養(yǎng)細(xì)胞輔助其生長。當(dāng)前第92頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)軟瓊脂培養(yǎng)法在培養(yǎng)液中加入0.5%左右的瓊脂糖凝膠，細(xì)胞分裂后形成小球樣團(tuán)塊，由于培養(yǎng)基是半固體狀態(tài)，可用毛細(xì)管將小球吸出，團(tuán)塊經(jīng)打碎后，移入96孔板繼續(xù)培養(yǎng)。該方法可以吸出大量克隆細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，克隆化很容易成功。當(dāng)前第93頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)篩選出來的陽性克隆可能含有不分泌抗體的細(xì)胞或有多株分泌抗體的細(xì)胞，同時(shí)，剛?cè)诤系募?xì)胞不穩(wěn)定，染色體易丟失，因此應(yīng)盡早進(jìn)行克隆化。融合后的雜交瘤細(xì)胞要經(jīng)過三次克隆化才能達(dá)到100%的陽性克隆。當(dāng)前第94頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)四、雜交瘤細(xì)胞與抗體性狀的鑒定雜交瘤細(xì)胞鑒定：染色體分析、抗體穩(wěn)定性分析、外源因子檢查。染色體分析可作為雜交瘤細(xì)胞鑒定的客觀指標(biāo)，并有助于了解雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的能力。染色體數(shù)目較多又比較集中的雜交瘤細(xì)胞能分泌高效價(jià)的抗體。當(dāng)前第95頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)單抗：進(jìn)行Ig類和亞類鑒定（生物特性差異大）用羊或兔抗Ig不同類或亞類抗體，進(jìn)行免疫擴(kuò)散或ELISA鑒定。單抗：進(jìn)行親和力測定（為正確選擇單抗提供依據(jù)）相對親和力測定和親和常數(shù)測定根據(jù)需要不同，應(yīng)該進(jìn)行單抗的特異性、純度和識別抗原的相對分子質(zhì)量等測定。當(dāng)前第96頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)對抗體根據(jù)需要不同，進(jìn)行下面測定純度含量測定一般用SDS或?qū)游龇ɑ钚詼y定測效價(jià)識別抗原位點(diǎn)測定特異性、交叉反應(yīng)性測定當(dāng)前第97頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)五、單克隆抗體的大量制備方法主要有兩種：動物體內(nèi)誘生法和體外培養(yǎng)法。1、體內(nèi)誘生法，可獲的5～20mg/ml抗體在接種前1-2周，先給小鼠腹腔注射0.5毫升的降植烷（或液體石蠟）（破壞腹腔內(nèi)膜，建立雜交瘤細(xì)胞良好的增殖環(huán)境），然后接種1×106個(gè)雜交瘤細(xì)胞，待生成腹水后再抽取，離心去細(xì)胞沉淀，取上清夜凍存。

操作簡便，所得單抗量多且效價(jià)高，可有效保存雜交瘤細(xì)胞株和分離污染了雜菌的雜交瘤細(xì)胞，目前多采用該法生產(chǎn)制備單抗。缺點(diǎn)在于，小鼠腹水中混有多種雜蛋白，增加了純化難度。當(dāng)前第98頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)2、體外培養(yǎng)法，體外培養(yǎng)法可獲的10μg/ml抗體采用RPMI1640培養(yǎng)液+10%~20%小牛血清。由于含有血清，總蛋白可達(dá)100mg/ml以上，難以分離純化小牛血清容易發(fā)生支原體感染，并且批次質(zhì)量差異大近年來發(fā)展了無血清培養(yǎng)法，利用白蛋白、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、乙醇胺等混合物代替小牛血清，減少污染，并有利于單抗的純化，但產(chǎn)量不高。目前常用培養(yǎng)方式有兩種，懸浮培養(yǎng)和細(xì)胞固定化培養(yǎng)利用懸浮培養(yǎng)代替靜止培養(yǎng)，增加了細(xì)胞生長空間，提高了單抗產(chǎn)量，單抗可達(dá)400μg/ml。當(dāng)前第99頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)六、單克隆抗體的純化先明確單克隆抗體的免疫球蛋白的類和亞類，并根據(jù)用途綜合選定純化方法。用于體外診斷試劑，IgG采用沉淀處理結(jié)合親和層析，IgM沉淀處理結(jié)合凝膠過濾。體內(nèi)診斷試劑或治療用藥，應(yīng)去除內(nèi)毒素、核酸、病毒等微量的污染，必須經(jīng)親和層析和陰離子交換層析。

當(dāng)前第100頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)體內(nèi)誘生法單克隆抗體的純化方法1、澄清和沉淀處理：先1000克離心力離心5min，去除沉淀，再20000克高速離心30min，去除殘留的小顆粒物質(zhì)，再用0.2微米的微孔濾膜過濾，除去污染的細(xì)菌、支原體和脂質(zhì)，最后用飽和硫酸銨沉淀抗體。2、分離：主要分離方法有凝膠過濾、陰離子交換層析、親和層析等。凝膠過濾用于IgG、IgM類單抗的分離純化，能去除污染的微量雜蛋白，抗體純度達(dá)95%以上陰離子交換層析用于IgG類的分離純化。親和層析適用于IgM類的純化，多用蛋白A親和層析，收獲的抗體純度很高，但也有極微量的雜蛋白。當(dāng)前第101頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)第三節(jié)基因工程抗體及其制備當(dāng)前第102頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)Ig分子是由三個(gè)不連鎖的Igκ、Igλ和IgH基因所編碼。Igκ、Igλ和IgH基因定位于不同的染色體上：編碼多肽鏈 基因符號（人）基因染色體定位 人小鼠κ輕鏈 Igκ 2 6λ輕鏈 Igλ 22 16重鏈 IgH 14 12

當(dāng)前第103頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)編碼一條Ig多肽鏈的基因是由在胚系中多個(gè)分隔的DNA片段（基因片段）經(jīng)重排而形成的。1965年Dreyer和Bennet首先提出假說，認(rèn)為Ig的V區(qū)和C區(qū)是由分隔存在的基因所編碼，在淋巴細(xì)胞發(fā)育過程中這兩個(gè)基因發(fā)生易位而重排在一起。1976年日本學(xué)者利根川進(jìn)應(yīng)用DNA重組技術(shù)證實(shí)了這一假說。利根川進(jìn)由此獲得1987年醫(yī)學(xué)和生理學(xué)諾貝爾獎。當(dāng)前第104頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)基因工程抗體研究目的雜交瘤單抗為鼠源性，應(yīng)用于人體產(chǎn)生人抗鼠抗體及毒副作用。對鼠源性的單抗進(jìn)行基因加工和改造。目的一是降低鼠源單克隆抗體分子的免疫原性。通過置換C區(qū)，保留CDR區(qū)，先后研制了多種人源化的單抗，如人-鼠嵌合抗體、改形抗體等。二是降低抗體的相對分子質(zhì)量，增加組織的透過性。由于抗體的主要功能是特異性地結(jié)合抗原，那么只克隆出V區(qū)基因，并使其表達(dá)，就可以實(shí)現(xiàn)抗體主要功能，則編碼的抗體分子的相對分子質(zhì)量會很小。已研制出多種類型的小分子基因工程抗體，如單鏈抗體、單域抗體等。當(dāng)前第105頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)當(dāng)前第106頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)基因工程抗體的優(yōu)點(diǎn)：1.最大成度降低抗體的鼠源性，降低甚至消除人體對抗體的排斥反應(yīng)2.分子較小，穿透力強(qiáng)，更易到達(dá)病灶的核心部位3.可以根據(jù)治療的需要，制備多種用途的新型抗體4.可以采用原核細(xì)胞、真核細(xì)胞或動植物等多種表達(dá)系統(tǒng)大量生產(chǎn)，大大降低成本。當(dāng)前第107頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)一、人鼠嵌合抗體

抗原抗體結(jié)合功能<—抗體可變區(qū)（V）同種性免疫源性<—抗體穩(wěn)定區(qū)（C）在基因水平上將鼠源單抗的H和L鏈可變區(qū)基因分離出來，分別與人Ig的H和L鏈的穩(wěn)定區(qū)（C）基因連接成人-鼠嵌合抗體的H和L鏈基因，再共轉(zhuǎn)染骨髓瘤細(xì)胞，就能表達(dá)完整人-鼠嵌合抗體。當(dāng)前第108頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)嵌合抗體(Chimericantibodies)

鼠IgV區(qū)基因+人IgC區(qū)基因→拼接成重組Ig基因→鼠-人嵌合抗體，降低單抗中的鼠源蛋白的免疫原性，MouseIgGHumanIgGMouse-humanchimericIgG當(dāng)前第109頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)Pr鼠VH人CHPr鼠VL人CL免疫球蛋白基因載體的構(gòu)建H鏈嵌合載體L鏈嵌合載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞啟動子人-鼠嵌合抗體基因工程改造策略當(dāng)前第110頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)鼠VH鼠VL人CL人CH抗體分泌細(xì)胞人-鼠嵌合基因工程抗體保持了鼠源性單抗的抗原結(jié)合特異性，但對人體的免疫原性大幅度下降當(dāng)前第111頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)二、改形抗體（CDR移植抗體） Ig分子中參與構(gòu)成抗原結(jié)合部位的區(qū)域是H和L鏈V區(qū)中的互補(bǔ)決定區(qū)（CDR區(qū)），而不是整個(gè)可變區(qū)。H和L鏈各有三個(gè)CDR，其它部分稱框架區(qū)。

用鼠源單抗的CDR序列替換人Ig分子中CDR序列，則可使人的Ig分子具有鼠源單抗的抗原結(jié)合特異性。而由于抗體分子中鼠源部分所占比例很小，可消除對人的免疫原性。這種改形體又稱為CDR移植抗體。當(dāng)前第112頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)CDR序列CDR序列鼠單克隆抗體人抗體人源化抗體（改型抗體）圖4鼠單克隆V區(qū)人源化（CDR移植）最大問題是抗體的親和力下降，甚至喪失活性原因：人Ig分子的框架區(qū)中一些氨基酸與鼠Ig的CDR區(qū)不協(xié)調(diào)。方法：突變或同源性。當(dāng)前第113頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)

基因工程小分子抗體僅表達(dá)鼠源單抗的V區(qū)片段，相對分子量為原抗體的1/80～1/3。即保留CDR區(qū)，而Ig分子中的C區(qū)不表達(dá)。小分子抗體類型有：①Fab片段抗體；②Fv抗體；③單鏈抗體；④單域抗體；⑤最小識別單位三、小分子抗體當(dāng)前第114頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)FvScFv單域抗體最小識別單位Fab當(dāng)前第115頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)

由完整的輕鏈和Fd組成，大小為完整分子的1/3。

把Fab與細(xì)菌的前導(dǎo)肽相連，在前導(dǎo)肽的作用下Fab進(jìn)入質(zhì)周腔，裝配折疊后，它具有結(jié)合抗原的活性。(1)Fab當(dāng)前第116頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)

水解酶如胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等將IgG的重鏈在鉸鏈區(qū)的C端裂解，獲得兩個(gè)完全相同的抗原結(jié)合片段，即Fab。Fab之間保留有鉸鏈區(qū)和二硫鍵，具有完整的雙價(jià)抗體活性，相對分子量減少了1/3，在人體內(nèi)產(chǎn)生的抗鼠蛋白的排斥反應(yīng)相應(yīng)地降低到30%，由于仍然保持抗體分子的立體構(gòu)型，在人體仍然很穩(wěn)定，成為小分子抗體的雛形，成為Fab抗體。

當(dāng)前第117頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)免疫球蛋白基因載體的構(gòu)建H鏈表達(dá)載體L鏈表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞PrVHCH1PrVLCLFab抗體分子的制備Fabantibodymolecule當(dāng)前第118頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)抗體分泌細(xì)胞VHVLCL-S-S-CH1Fab抗體分子的制備當(dāng)前第119頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)

Fv、ScFv的大小約為全分子的1/6。(2)Fv或ScFv

FvScFv連接肽Fv抗體是含有抗體重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)并具有全部抗原結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。當(dāng)前第120頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)分別構(gòu)建載體L鏈表達(dá)載體H鏈表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞PrVHPrVLFv[二硫鍵穩(wěn)定的Fv(disulfide-stabilizedFv,ds-Fv)]小分子抗體的制備a.ds-Fv當(dāng)前第121頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)抗體分泌細(xì)胞VHVL-S-S-Fv小分子抗體的制備disulfide-stabilizedFv,ds-Fv當(dāng)前第122頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)8mol/L的尿素可將Fv分離為VH和VL，并且二者又可快速重新結(jié)合成高親和力的Fv。該事實(shí)證明：Ig分子結(jié)構(gòu)中的可變區(qū)是作為完整區(qū)域存在的，不依賴于抗體的其他肽段能正確折疊。X-ray表明，F(xiàn)v的VH和VL的C端位于分子表面并遠(yuǎn)離抗原結(jié)合位點(diǎn)，而其N端掩蔽在分子內(nèi)部并靠近抗原結(jié)合位點(diǎn)，VH和VL的CDR區(qū)共同構(gòu)成了抗原結(jié)合位點(diǎn)，決定了抗體的特異性。Fv的發(fā)現(xiàn)推動了抗體的體外重組技術(shù)的發(fā)展。體外表達(dá)的高產(chǎn)量、天然活性的Fv為蛋白均一的小分子。重組技術(shù)制備的Fv抗體又推動了對抗體結(jié)構(gòu)和功能的分析及抗體的改建，為Fv抗體的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。Fv由VH與VL構(gòu)成，由于其結(jié)合是非共價(jià)結(jié)合，故Fv不穩(wěn)定。當(dāng)前第123頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)

在VH與VL之間加上一段連接肽，把VH與VL連成一條單鏈，得到ScFv，即單鏈抗體，是具有親代抗體全部抗原結(jié)合特異性的最小功能結(jié)構(gòu)單元。

連接肽的長度在10-15個(gè)氨基酸左右，不宜太長或太短，它應(yīng)具有柔軟性，側(cè)鏈少，抗原性弱等特點(diǎn)。常用的連接肽是(GGGGS)3。既連接VH與VL，又保持一定的靈活性，使VH與VL的功能區(qū)間在折疊后仍可配對。

當(dāng)前第124頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)

單鏈抗體大多在大腸桿菌中表達(dá)，有三種形式：①直接在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)；②與其它菌體融合表達(dá)融合蛋白；③分泌表達(dá)具有功能的單鏈抗體。當(dāng)前第125頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)單鏈抗體的優(yōu)點(diǎn)：1.可去除非特異性反應(yīng)的競爭性表面蛋白，腫瘤顯象背景更加清晰性。2.分子小，僅為完整單體Ig的1/6，易滲透腫瘤組織中增加藥物治療濃度，可用于腫瘤的診斷和治療。3.免疫源性小，可消除人抗鼠的排異反應(yīng)。4.在體內(nèi)循環(huán)的半衰期短，易清除，利于解毒排出;5.為單鏈，易于分子改造，與毒素或酶基因拼接成免疫毒素或酶標(biāo)抗體等，便于直接殺傷靶細(xì)胞。6.可在原核系統(tǒng)表達(dá)，易于基因工程操作；可由大腸桿菌發(fā)酵，進(jìn)行批量生產(chǎn)。當(dāng)前第126頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)單鏈抗體的缺點(diǎn)：1.穩(wěn)定性低。scFv分子內(nèi)VH和VL間相互作用力較弱，不足以完全抵消分子間作用力，故易凝聚成scFv二聚體和多聚體。2.功能單一，僅能與一種抗原特異性結(jié)合3.親和力低，穩(wěn)定性差，體內(nèi)清除過快。單鏈抗體的不足限制了它在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)及疾病的診治方面的廣泛應(yīng)用，近年來，發(fā)展了結(jié)合性能良好的scFv多聚體，并取得了突破性進(jìn)展。當(dāng)前第127頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)

單域抗體即為VH，約為完整分子的1/12。它只由一個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，故稱單域抗體（singledomainantibody，sdAb），又稱納米抗體（nanobody）或重鏈抗體（heavychainantibody，hcAb），是從駱駝科動物和鯊魚的血清中分離出的一種抗體。單域抗體盡管親和力有所降低，但仍保持著原單抗的特異性。

(3)單域抗體VH為抗體的分子構(gòu)建提供了一個(gè)新方法?；趩斡蚩贵w的一系列優(yōu)點(diǎn)，在免疫實(shí)驗(yàn)、診斷與治療中，它將發(fā)揮超乎想象的巨大功能。當(dāng)前第128頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)

約為完整分子的1/80-1/70大小，一般由一個(gè)CDR構(gòu)成，它也保持著抗體的特異性。(4)分子識別單位CDRCDR區(qū)基因編碼蛋白能模擬抗體結(jié)合活性，稱其為分子識別單位（MRU），CDR片段為抗體結(jié)合抗原的最小片段?？乖禺愋越Y(jié)合能力主要由CDR3決定，所構(gòu)建的CDR3小肽段在體內(nèi)、體外仍具有抗原結(jié)合能力和一定親和力。然而，這些小抗體片段不能取代完整可變區(qū)的作用，并且親和力極低，在實(shí)際應(yīng)用中有很大的局限。當(dāng)前第129頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)第四節(jié)多功能抗體及其制備一、雙功能抗體二、多功能抗體三、抗體融合蛋白當(dāng)前第130頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)

雙鏈抗體（Diabody）一詞最早由Hollinger等于1993年創(chuàng)造。乃是一種小分子的雙價(jià)雙特異性抗體片段。

一、雙功能抗體當(dāng)前第131頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)將A抗原抗體重鏈的可變區(qū)與B抗原抗體輕鏈的可變區(qū)通過短肽鏈接構(gòu)建成雙鏈抗體的表達(dá)質(zhì)粒，表達(dá)后形成雙特異性抗體。連接肽長度5~10個(gè)aa為宜當(dāng)前第132頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)

雙功能抗體就是雙特性單鏈抗體

雙特異性單鏈抗體(bispecificsingle-chainFvs,bisFvs)是一種非天然性抗體，將不同來源的兩條高特異性、高親和力的scFv組合成的具有兩種不同抗原結(jié)合特征的新型抗體。bisFvs由于具有獨(dú)特的與兩個(gè)抗原位點(diǎn)結(jié)合的能力，具有廣闊的應(yīng)用前景，如導(dǎo)向藥物載體，效應(yīng)細(xì)胞識別、連接，免疫阻斷抗體，免疫診斷試劑等，特別是用于腫瘤的診斷和治療。當(dāng)前第133頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)雙功能抗體構(gòu)建方法：⒈化學(xué)交聯(lián)法 共價(jià)連接.關(guān)鍵是選擇具有一定的柔韌性，但不影響兩端scFv復(fù)性、結(jié)合特征的適當(dāng)連接肽。⒉生物學(xué)方法 非共價(jià)二聚體。也可通過分泌性原核表達(dá)系統(tǒng)，可直接獲得有功能的bisFvs分子。⒊基因工程法 獲得二聚化bisFvs分子。當(dāng)前第134頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)雙功能抗體的優(yōu)點(diǎn)：一個(gè)臂識別腫瘤細(xì)胞表面抗原，包括腫瘤相關(guān)抗原、癌基因產(chǎn)物、特殊的白細(xì)胞分化抗原、病毒蛋白抗原、特異性受體等，并有效結(jié)合；另一個(gè)臂可識別免疫效應(yīng)細(xì)胞及分子。當(dāng)前第135頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)即scFv的多聚體，二聚體、三聚體、三聚體等。多聚體之間的轉(zhuǎn)換只依賴連接肽長度的變化，形成了多價(jià)、多效能、高親和力的新型小分子抗體。多功能抗體克服了scFv在體內(nèi)清除過快的不足。二、多功能抗體當(dāng)前第136頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)多功能抗體具有高親和力性能，可同時(shí)與細(xì)胞膜上相鄰的多個(gè)靶抗原結(jié)合。影響結(jié)合有兩個(gè)因素：Fv分子的排列方向（VH-VL是VL-VH結(jié)合性能的10~20倍）細(xì)胞表面靶抗原結(jié)合位點(diǎn)方向的一致性（保證了多價(jià)Fv分子可同時(shí)與之進(jìn)行高親和性結(jié)合）與腫瘤細(xì)胞表面抗原的多價(jià)結(jié)合有利于腫瘤的影像分析及治療。當(dāng)前第137頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)有應(yīng)用價(jià)值的scFv多聚體特征：能高選擇性、高親和性地同靶抗原或腫瘤相關(guān)抗原結(jié)合在血循環(huán)中，與效應(yīng)細(xì)胞或細(xì)胞毒觸發(fā)分子有較低親和力應(yīng)為人源化抗體，最大限度地減少人抗鼠蛋白的排斥反應(yīng)，使重復(fù)給藥不受限制分子應(yīng)大小適中，既能滲透到腫瘤組織內(nèi)部，又能保證適當(dāng)?shù)臏魰r(shí)間。當(dāng)前第138頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)三、抗體融合蛋白

抗體融合蛋白廣義屬雙功能抗體。類型：①配基-配基型融合蛋白；②配基-Ig型嵌合蛋白；③配基-Fv型融合蛋白；④受體-Fv型融合蛋白；⑤酶-抗體型融合蛋白； 酶-抗體型融合蛋白，在藥物治療中有廣闊的前景，它可在靶向位置上將前體藥物轉(zhuǎn)化成有效的藥物，從而避免了對正常組織的損害，稱抗體介導(dǎo)的酶前體藥物治療（ADEPT）。

當(dāng)前第139頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)構(gòu)建抗體融合蛋白的基本原則構(gòu)建抗體融合蛋白的基本原則：刪除第一個(gè)蛋白的終止密碼子，接上帶終止密碼子的第二個(gè)蛋白基因，實(shí)現(xiàn)兩個(gè)基因共表達(dá)。構(gòu)建抗體融合蛋白的關(guān)鍵問題：兩個(gè)蛋白間的接頭序列連接肽。3~5個(gè)aa可滿足大部分融合蛋白的正確折疊要求，而加入一段有疏水性和伸展性的較長肽鏈可緩解兩種蛋白相互干擾。當(dāng)前第140頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)融合蛋白基因的表達(dá)真核細(xì)胞中表達(dá)：能夠?qū)⒖贵w多肽正確折疊復(fù)性和糖基化，省去了繁瑣的體外復(fù)性和純化步驟，但產(chǎn)量低。原核細(xì)胞中表達(dá)（分兩種形式）：分泌到菌體外，成為有活性的可溶性融合蛋白以胞內(nèi)包含體形式存在，需溶解包含體重新折疊成為有活性的蛋白質(zhì)當(dāng)前第141頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)CTLA4-IgCTLA4Ig是通過基因重組產(chǎn)生的CTLA4（細(xì)胞溶解性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原cDN，又名CD152）分子胞外功能區(qū)與免疫球蛋白IgG恒定區(qū)相結(jié)合的融合蛋白,與B7分子具有高度的親合力（其親和力約為CD28的20倍），可以和CD28競爭結(jié)合APC（抗原提呈細(xì)胞）上的B7家族分子CD80(B71)和CD86(B72)，阻斷CD28與B7的信號傳導(dǎo)通路，抑制T細(xì)胞對抗原識別第二信號的產(chǎn)生，導(dǎo)致T細(xì)胞的免疫失能，誘導(dǎo)對特異性抗原的免疫耐受，從而發(fā)揮免疫抑制效應(yīng).當(dāng)前第142頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)CTLA4Ig是目前所發(fā)現(xiàn)的一種高效、無毒并兼有免疫抑制和誘導(dǎo)免疫耐受的生物免疫抑制劑，對移植排斥的防治和一些難治性自身免疫性疾病的治療具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。應(yīng)用于胰腺移植，心臟移植。自身免疫性糖尿病治療當(dāng)前第143頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)自身免疫性糖尿病治療自身免疫性糖尿病的發(fā)病被認(rèn)為是由于遺傳易感性和環(huán)境因素（如微生物、化學(xué)物質(zhì)、機(jī)體營養(yǎng)狀況）等共同作用，使機(jī)體免疫自穩(wěn)機(jī)制失衡，引起自身免疫損傷。而導(dǎo)致“自相殘殺”的“罪魁禍?zhǔn)住本褪荰細(xì)胞的異常活化以及由此產(chǎn)生的自身反應(yīng)性T細(xì)胞，從而產(chǎn)生一系列“六親不認(rèn)”的自身抗體（如抗胰島細(xì)胞自身抗體、胰島素自身抗體、熱休克蛋白－60自身抗體），導(dǎo)致胰島素分泌減少及血糖升高，并最終出現(xiàn)臨床糖尿病癥狀。由此看來，自身免疫性糖尿病作為一種T細(xì)胞依賴的自身免疫病，遏制住其發(fā)病環(huán)節(jié)中的“始作俑者”—T細(xì)胞活化，就相當(dāng)于扼住了自身免疫性糖尿病的咽喉。北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部免疫學(xué)系謝蜀生教授一直在從事這方面的研究。他認(rèn)為，T細(xì)胞活化除了需要有第一活化信號（由T細(xì)胞表面的抗原識別受體與抗原提呈細(xì)胞表面的抗原肽結(jié)合產(chǎn)生）外，還必須有第二活化信號（由抗原提呈細(xì)胞表面的共刺激分子與T細(xì)胞表面相應(yīng)的配體結(jié)合產(chǎn)生）的存在，只要阻斷第二活化信號的產(chǎn)生就可以有效地防止T細(xì)胞的活化。當(dāng)前第144頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)自身免疫性糖尿病治療研究發(fā)現(xiàn)，T細(xì)胞表面還有一種CTLA4分子，它與它的“鄰居”CD28分子的結(jié)構(gòu)很類似，也能夠與“鑰匙”B7分子結(jié)合，但CTLA4分子和B7分子結(jié)合后卻無法開啟T細(xì)胞活化的閘門。顯而易見，這種競爭性結(jié)合的后果將阻斷CD28的共刺激效應(yīng)，抑制T細(xì)胞的活化。科學(xué)家們根據(jù)這一原理構(gòu)建了一種CTLA4－Ig融合蛋白，利用它與B7分子高親和力（其親和力是CD28分子的20多倍）的特性，專門用來保護(hù)“第二把鎖”CD28分子不被“鑰匙”B7分子開啟，從而使T細(xì)胞無法活化，進(jìn)入無能狀態(tài)。CTLA4－Ig融合蛋白就是針對自身免疫性糖尿病的靈丹妙藥？當(dāng)前第145頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)自身免疫性糖尿病治療進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，CTLA4－Ig融合蛋白單獨(dú)阻斷CD28－B7共刺激途徑誘導(dǎo)產(chǎn)生的T細(xì)胞無能狀態(tài)在一定條件下可以逆轉(zhuǎn)。更重要的是T細(xì)胞還存在一些非CD28分子依賴的活化途徑，也就是說仍將有少量T細(xì)胞依然能夠得以活化，并進(jìn)一步分化為效應(yīng)T細(xì)胞來“作祟”。（怎么辦？）研究發(fā)現(xiàn)，在T細(xì)胞表面存在一種Fas分子，如果把它也看作一把鎖的話，那么它也有與其對應(yīng)的一把鑰匙，科學(xué)家把這把“鑰匙”稱為FasL。當(dāng)“鑰匙”插入“鎖孔”后，F(xiàn)as就會與FasL相互作用，啟動一系列分子水平的變化，不過其結(jié)果并非使T細(xì)胞活化，而是誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡，有效抑制T細(xì)胞的應(yīng)答。如果人為地提供外源性的FasL，促進(jìn)已活化的T細(xì)胞凋亡，就可以使在CTLA4－Ig融合蛋白作用后仍然能夠活化的T細(xì)胞無處可逃。當(dāng)前第146頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)自身免疫性糖尿病治療謝蜀生教授正是看到了這一點(diǎn)，提出把阻斷T細(xì)胞活化的共刺激效應(yīng)與誘導(dǎo)已活化T細(xì)胞凋亡這兩種方法結(jié)合起來的設(shè)想，希望能夠更徹底地阻斷T細(xì)胞的異常活化。為此，他們構(gòu)建了一種功能獨(dú)特的雙功能分子——新型的CTLA4－FasL融合分子，在兩個(gè)不同層次上，設(shè)置了阻止T細(xì)胞活化和應(yīng)答的屏障，有效防止T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病的發(fā)生。在實(shí)踐中，研究人員還發(fā)現(xiàn)，CTLA4與FasL的共同作用并非1＋1＝2那么簡單，兩者還具有明顯的累加協(xié)同效應(yīng)，也就是說1＋1＞2，比如阻斷CD28提供的共刺激效應(yīng)可以使T細(xì)胞對凋亡作用更為敏感。應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)在實(shí)驗(yàn)小鼠體內(nèi)表達(dá)出CTLA4－FasL融合分子后，發(fā)現(xiàn)自身免疫性糖尿病的發(fā)病率由80％驟然降為13％，血糖和胰島素水平也基本維持正常。當(dāng)前第147頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)第五節(jié)抗體工程

抗體的研制經(jīng)歷了從多克隆抗體、單克隆抗體到基因工程抗體的三個(gè)階段。：①以1890年發(fā)現(xiàn)的白喉抗毒素為代表，用抗原免疫動物獲得多克隆抗體；②以1975年雜交瘤技術(shù)獲得單克隆抗體為代表；③以1994年基因工程抗體為代表；當(dāng)前第148頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)基因工程抗體完全用基因工程技術(shù)制備人源性抗體，利用基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)技術(shù)，通過細(xì)菌發(fā)酵或轉(zhuǎn)基因動物、植物大規(guī)模生產(chǎn)抗體，進(jìn)而發(fā)展成抗體工程?；蚬こ炭贵w技術(shù)主要包括2部分；①對已有的單克隆抗體進(jìn)行改造，包括單克隆抗體的人源化（嵌合抗體、人源化抗體）、小分子抗體（Fab，ScFv，dsFv，diabody，minibody等）以及抗體融合蛋白的制備；②通過抗體庫的構(gòu)建，使得抗體不需抗原免疫即可篩選并克隆新的單克隆抗體。當(dāng)前第149頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)抗體庫技術(shù)噬菌體抗體庫技術(shù)是近10年來發(fā)展起來的一項(xiàng)新技術(shù),可不經(jīng)免疫制備抗體，又可實(shí)現(xiàn)完全人源化，在理論上可以研制任何一種具有高特異性的抗體，使抗體工程的設(shè)想成為現(xiàn)實(shí)。該技術(shù)的建立是基因工程抗體研究領(lǐng)域的一次質(zhì)的飛躍，是繼多克隆抗體、單克隆抗體之后的第3代抗體，它為重組抗體的設(shè)計(jì)、篩選及生產(chǎn)方面的不斷革新及改進(jìn)提供了高效可靠的方法，極大地推動了重組抗體在科研、檢測、臨床診斷及治療等方面的應(yīng)用。當(dāng)前第150頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)抗體庫技術(shù)產(chǎn)生的三項(xiàng)技術(shù)基礎(chǔ)

抗體庫技術(shù)是用基因工程方法把人或其他動物的全部抗體的輕、重鏈可變區(qū)基因克隆出來，在原核載體上表達(dá)，然后篩選出所需的特異基因和抗體。該技術(shù)的發(fā)展主要依賴于以下3項(xiàng)技術(shù)的突破：PCR技術(shù)，使人們可以用一組引物克隆出全套免疫球蛋白的可變區(qū)基因免疫球蛋白Fab片段在大腸桿菌中的成功表達(dá)噬菌體表面展示技術(shù)（PhageDisplay）當(dāng)前第151頁\共有194頁\編于星期四\19點(diǎn)

初期的抗體庫技術(shù)是從淋巴細(xì)胞中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA或直接用總DNA為