ELISA操作技術(shù)培訓(xùn)指南-課件

ELISA操作技術(shù)培訓(xùn)指南報(bào)告內(nèi)容IDEXX試劑盒1操作問(wèn)題分析4

ELISA操作3試劑盒的處理2IDEXX試劑盒——試劑盒的組成

包被板(CoatedPlates)

陽(yáng)性對(duì)照(PositiveControl)

陰性對(duì)照(NegativeControl)

酶標(biāo)抗體(Conjugate)

底物液(TMBSubstrate)

樣品稀釋液(SampleDiluent)

終止液(StopSolution)

濃縮洗滌液(WashConcentrate)Nevermixreagentsfromdifferentkitlots!移液器及吸頭

洗滌系統(tǒng)酶標(biāo)儀蒸餾水或去離子水

其它（加樣槽、量筒等）Maintenance&CalibrateEquipmentsIDEXX試劑盒——自備器材試劑盒的處理——接收試劑盒檢查外包裝是否完好；

記錄接收日期；

檢查批號(hào)及效期；檢查內(nèi)容物；使用記錄；先進(jìn)先出原則（FIFO）；試劑盒的保存。試劑盒組分的回溫；仔細(xì)閱讀操作說(shuō)明書(shū)；記錄實(shí)驗(yàn)室的溫度；

確認(rèn)反應(yīng)溫度；

確定所用儀器的工作狀態(tài)。ELISA操作——操作前的準(zhǔn)備ELISA操作——樣品的處理樣品的類(lèi)型

血清/血漿樣品

肉汁樣品乳汁樣品其他樣品：如蛋清、泄殖腔拭子等ELISA操作——樣品的處理樣品的質(zhì)量

避免使用嚴(yán)重溶血的樣品。

避免使用脂狀的樣品。ELISA操作——樣品的處理樣品的保存血清存儲(chǔ)在4-7度不能超過(guò)3-5天，若更長(zhǎng)時(shí)間的保存則應(yīng)存放于-20度或更低溫度。

避免反復(fù)凍融樣品，且凍融樣品的混勻亦應(yīng)注意避免劇烈震蕩。樣品在保存中如出現(xiàn)污染所致的混濁或絮狀物時(shí)，應(yīng)離心沉淀后再取上清進(jìn)行檢測(cè)。ELISA操作——樣品及其它試劑的配制樣品的制備

1：2稀釋

1:5稀釋

1:10稀釋

1:20稀釋

1:40稀釋

1：100稀釋?zhuān)▋刹竭M(jìn)行）

1：500稀釋?zhuān)▋刹交蛉竭M(jìn)行）洗滌液的配制

對(duì)照的處理（是否需要稀釋?zhuān)?/p>

ELISA操作——移液技術(shù)檢查移液器的滴頭。

取樣量要嚴(yán)格。

要避免加在孔壁上部，不可濺出。要減少第一個(gè)樣品和最后一個(gè)樣品加入到板內(nèi)的時(shí)間差距。應(yīng)記住在取每一個(gè)樣品前必須更換吸頭。ELISA操作——孵育反應(yīng)孵育反應(yīng)是影響測(cè)定結(jié)果的一個(gè)重要因素，這一步也是ELISA實(shí)際操作中容易出現(xiàn)問(wèn)題的地方。過(guò)夜孵育時(shí)應(yīng)保證反應(yīng)板的密封。

室溫孵育時(shí)，應(yīng)保證溫度在20-25℃之間，不應(yīng)超過(guò)25℃。避免把反應(yīng)板放在陽(yáng)光下或空調(diào)風(fēng)口處。

37℃孵育時(shí)應(yīng)保證足夠的反應(yīng)時(shí)間。ELISA操作——控制反應(yīng)時(shí)間

多塊板的操作板之間的適當(dāng)?shù)臅r(shí)間間隔每塊板一個(gè)計(jì)時(shí)器ELISA操作——反應(yīng)板的洗滌手工洗板

洗板之前標(biāo)記每個(gè)板條

徹底甩掉孔中液體，在吸水紙上拍干加入下一試劑前避免孔干燥洗板機(jī)洗板

檢查設(shè)備的性能清洗和保持核對(duì)內(nèi)容物以確定洗滌劑的數(shù)量參照酶標(biāo)儀廠家的說(shuō)明書(shū)。選擇恰當(dāng)?shù)牟ㄩL(zhǎng)，一般為450nm或650nm，使用630nm和620nm會(huì)使對(duì)照和樣品值都下降，但不影響結(jié)果。在加入終止液后要盡可能早地進(jìn)行讀數(shù)（提前打開(kāi)酶標(biāo)儀并設(shè)計(jì)好模板）使用Xchek進(jìn)行讀數(shù)和數(shù)據(jù)管理。ELISA操作——讀板及數(shù)據(jù)管理IDEXX實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)范操作人：

操作時(shí)間：試劑盒種類(lèi)：批號(hào)：效期：待檢樣品說(shuō)明（或檢驗(yàn)?zāi)康模杭訕禹樞颍?23456789101112A

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IDEXX實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)范操作過(guò)程記錄：I操作前準(zhǔn)備：

1）所有試劑盒組分是否回溫充分（是/否）；

2）記錄實(shí)驗(yàn)室溫度（___℃）；

3）確認(rèn)孵育反應(yīng)溫度（___℃和/或___℃）；如為37℃，請(qǐng)?zhí)崆按蜷_(kāi)溫箱；

4）儀器（酶標(biāo)儀、溫箱、洗板機(jī)等）的工作狀態(tài)。II試劑準(zhǔn)備：

1）洗滌液的配制:

毫升濃縮液+

毫升純凈水;2）樣品的稀釋?zhuān)旱谝徊剑?/p>

微升血清+

微升樣品稀釋液;

第二步：

微升血清+

微升樣品稀釋液（或不需要）;

第三步：

微升血清+

微升樣品稀釋液（或不需要）;3）對(duì)照是否需要稀釋?zhuān)ㄊ?否），如需稀釋?zhuān)♂尡壤秊椋ǎ?/p>

III操作步驟：加入對(duì)照及樣品（對(duì)照:____微升；樣品:____微升）；第一次孵育（時(shí)間:____:____—____:____）；第一次洗滌（次數(shù):___次；體積:____微升）；加入酶標(biāo)抗體（____微升）；第二次孵育（時(shí)間:____:____—____:____）；第二次洗滌（次數(shù):___次；體積:____微升）；加入底物（____微升）；顯色（時(shí)間:____:____—____:____）；加入終止液終止反應(yīng)（____微升）。正確的操作良好的儀器優(yōu)質(zhì)的試劑充分準(zhǔn)備ELISA操作——必要條件?。?！報(bào)告內(nèi)容血清學(xué)檢測(cè)1操作問(wèn)題分析4

ELISA操作3試劑盒的處理2O.D.值偏高：實(shí)驗(yàn)室溫度水質(zhì)洗滌酶標(biāo)儀讀數(shù)孔內(nèi)氣泡底物溶液……

常見(jiàn)問(wèn)題分析O.D.值偏低：溫度孵育時(shí)間洗滌試劑盒對(duì)照品稀釋試劑……

操作常見(jiàn)問(wèn)題分析

操作常見(jiàn)問(wèn)題分析

孵育洗滌對(duì)照與樣品不同批次無(wú)顏色產(chǎn)生板內(nèi)重復(fù)性低板間重復(fù)性低試劑添加樣品是否加入酶標(biāo)記物操作時(shí)間過(guò)長(zhǎng)洗滌不穩(wěn)定抗體分布不均多道移液器操作常見(jiàn)問(wèn)題分析

導(dǎo)致不正常實(shí)驗(yàn)結(jié)果的常見(jiàn)因素：溫度（試劑、孵育以及實(shí)驗(yàn)室）不同批次的試劑混用水質(zhì)好壞酶標(biāo)儀問(wèn)題試劑污染用錯(cuò)了試劑瓶終止液有結(jié)晶讀數(shù)時(shí)樣品板孔有氣泡不明原因……孔內(nèi)有氣泡存在會(huì)嚴(yán)重的影響結(jié)果?。?！0.0770.0570.0580.080.058

0.0680.0510.0550.0720.054NCNeg

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0.0590.1110.1560.0490.074

0.0570.0950.1410.0450.058NCNeg

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1.2580.0750.1210.0570.054

1.2230.0620.1080.0530.047PCNeg

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PCNeg

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1.2470.1180.1370.0650.073

1.2060.0940.120.0610.062PCNeg

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PCNeg

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0.1420.2650.0970.1150.075

0.130.2040.0870.0930.068Neg

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0.1270.4870.0590.0670.073

0.1150.2280.0540.0620.067Neg

Pos!Neg

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0.0780.1880.060.0771.283

0.0710.1590.0440.071.157Neg

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Pos!0.1650.1490.3630.0631.279

0.1370.1160.0780.0621.223Neg

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Pos!ELISA原理