鴨新型呼腸孤病毒病診斷技術(shù)規(guī)范

鴨新型呼腸孤病毒病診斷技術(shù)規(guī)范范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了鴨新型呼腸孤病毒病的臨床診斷、實(shí)驗(yàn)室診斷和綜合判定技術(shù)規(guī)范。本標(biāo)準(zhǔn)適用于鴨新型呼腸孤病毒病的診斷和流行病學(xué)調(diào)查。規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。鴨新型呼腸孤病毒病又稱“肉鴨脾壞死癥”、“番鴨出血性壞死性肝炎”，是由鴨新型呼腸孤病毒引起的多品種雛鴨脾臟出血和壞死為主要特征的疾病。該病毒在血清學(xué)和基因序列上與原有的番鴨呼腸孤病毒有明顯差異。臨床診斷流行病學(xué)該病一年四季均可發(fā)生，不同品種的鴨均可發(fā)病，如櫻桃谷鴨、麻鴨、番鴨、半番鴨等；發(fā)病日齡一般為5～25日齡，其中以5～10日齡居多，病程5～7天。臨床癥狀病鴨精神沉郁，發(fā)育不良，部分拉白色稀糞，一般不會(huì)出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，容易繼發(fā)鴨疫里默氏桿菌、大腸桿菌等細(xì)菌感染。發(fā)病率5%～35%，死亡率20%以下。病理變化脾臟表面出血或壞死是其主要病變特征。結(jié)果判定符合4.1流行病學(xué)特征，病鴨出現(xiàn)4.2臨床癥狀和4.3病理變化，可判為鴨新型呼腸孤病毒病疑似病例，應(yīng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室確診。實(shí)驗(yàn)室診斷除非另有規(guī)定，實(shí)驗(yàn)室診斷所用化學(xué)試劑均為分析純；試驗(yàn)用水符合GB/T6682二級(jí)水的規(guī)定；實(shí)驗(yàn)室生物安全要求按照GB19489執(zhí)行。病原分離鑒定儀器和設(shè)備高速冷凍離心機(jī)。恒溫培養(yǎng)箱。試劑或材料青鏈霉素（青霉素10000IU/mL，鏈霉素10000μg/mL）。0.22μm微孔濾器。8日齡～9日齡鴨新型呼腸孤病毒抗體陰性鴨胚。病料處理按NY/T541要求無菌采集發(fā)病鴨的脾臟1g～2g，加入10倍體積生理鹽水和終濃度2000IU/mL的青鏈霉素，剪碎后充分研磨，反復(fù)凍融2次～3次，8000×g離心20min，取上清液用0.22μm微孔濾器過濾，經(jīng)菌檢無菌后用于病原分離。操作步驟取5.1.3中處理好的上清液經(jīng)尿囊腔接種8日齡～9日齡鴨新型呼腸孤病毒抗體陰性鴨胚，0.1mL/枚，共5枚。封口后置于37℃恒溫箱繼續(xù)孵化，每XX胚兩次，記錄鴨胚死亡情況，觀察到第6天。棄掉接種后24h內(nèi)死亡的鴨胚，若接種6天內(nèi)鴨胚出現(xiàn)死亡，則收集死亡鴨胚的尿囊液，用5.2、5.3、5.4中的任意一種方法進(jìn)行鑒定；若接種6天內(nèi)鴨胚不出現(xiàn)死亡，則收集6天活胚的尿囊液，用5.2、5.3、5.4中的任意一種方法進(jìn)行鑒定。結(jié)果判定陽(yáng)性：接種后死亡鴨胚或接種后6天活胚的尿囊液用5.2、5.3、5.4中的任意一種方法檢測(cè)為陽(yáng)性。陰性：接種后死亡鴨胚或接種后6天活胚的尿囊液用5.2、5.3、5.4中的任意一種方法檢測(cè)為陰性。RT-PCR方法儀器和設(shè)備高速冷凍離心機(jī)。PCR擴(kuò)增儀。電泳儀。紫外分析儀。試劑或材料TRIZol。無RNA酶水。反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV。RNA酶抑制劑。Taq酶。X脂糖。GoldviewDNA染料。陽(yáng)性參照物（鴨新型呼腸孤病毒）。陰性參照物（陰性尿囊液）。操作步驟樣品處理按NY/T541要求無菌采集發(fā)病鴨的脾臟1g～2g，加入10倍體積生理鹽水，用剪刀剪碎后，置于研磨器中充分研磨，反復(fù)凍融2次～3次，8000×g離心10min，取上清液100μL用于RNA提取。RNA提取在100μL病料上清液中加入1mLTRIZol，劇烈顛倒50次～100次，室溫靜置10min后，加入200μL氯仿，上下顛倒50次～100次，室溫靜置5min～10min，12000×g離心10min。吸取上清加入等體積氯仿，上下顛倒50次～100次，12000×g離心10min。吸取上清加入等體積的異丙醇，輕輕混勻后，-20℃靜置至少30min，然后12000×g離心15min～20min。棄上清液，加入1mL75%酒精，12000×g離心5min～10min。棄上清液，倒置自然晾干，或12000×g再離心5min，吸掉管底部的液體。沉淀用20μL無RNA酶水溶解，備用。陽(yáng)性和陰性參照物RNA的提取同上。樣品RNA提取也可使用同等效果的商品化試劑盒。引物上游引物P1：5'TCATTCATTTGGGCAGCGG3'下游引物P2：5'AGTAGTGTGTAAAGCATGGACT3'RT-PCR擴(kuò)增反轉(zhuǎn)錄（RT）反應(yīng)反應(yīng)體系為10μL。在PCR管中加入dNTP（10mmol/L）0.8μL，引物P1（20μmol/L）0.5μL，引物P2（20μmol/L）0.5μL，RNA5.0μL，放PCR儀中70℃作用5min，然后取出冰浴1min～2min，再加入RNA酶抑制劑（40U/μL）0.5μL，反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV（200U/μL）0.7μL，5×M-MLVbuffer2μL，繼續(xù)放PCR儀中42℃30min，95℃2min。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系反應(yīng)體系為50μL，配制見表1。PCR反應(yīng)體系配制反應(yīng)體系中各成分每個(gè)樣品反應(yīng)組分用量/μL10×PCRbuffer4.520μmol/L引物P10.520μmol/L引物P20.5RT產(chǎn)物5.05U/μLTaqE0.5ddH2O39.0總體積50.0反應(yīng)程序采用以下反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增：第一階段：95℃3min；第二階段：95℃20s，55℃20s，72℃30s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；第三階段：72℃10min。RT-PCR擴(kuò)增也可使用商品化的RT-PCR試劑盒，按說明書要求操作。電泳取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物6μL與10×上樣緩沖液1μL混合，加入到1.5%的X脂糖凝膠孔中，同時(shí)在旁邊點(diǎn)樣孔中加入2000bpLadderMarker（分子量標(biāo)準(zhǔn)物）10μL，以5V/cm電壓進(jìn)行電泳25min～30min，在紫外分析儀上觀察結(jié)果。結(jié)果判定試驗(yàn)成立條件在陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)一條大小226bp的單一條帶，同時(shí)陰性對(duì)照無此條帶的情況下，檢測(cè)結(jié)果成立。結(jié)果判定被檢樣品出現(xiàn)與陽(yáng)性對(duì)照同樣大小的條帶時(shí)，判為陽(yáng)性；被檢樣品未出現(xiàn)與陽(yáng)性對(duì)照同樣大小的條帶時(shí)，判為陰性。參見附錄A。熒光RT-PCR方法儀器與設(shè)備高速冷凍離心機(jī)。熒光定量PCR擴(kuò)增儀。試劑或材料TRIZol。無RNA酶水。SYBRGreen熒光RT-PCR反應(yīng)液（2×SYBRPremix）。陽(yáng)性參照物（鴨新型呼腸孤病毒）。陰性參照物（陰性尿囊液）。操作步驟樣品處理參見5.2.3.1。RNA提取參見5.2.3.2。引物上游引物P3：5'ATCGCACTATTGACGCACTT3'下游引物P4：5'TTGACGACGCCAATCCC3'熒光RT-PCR擴(kuò)增反轉(zhuǎn)錄（RT）反應(yīng)參見5.2.3.4.1。熒光PCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系為25.0μL，配制見表2。熒光PCR反應(yīng)體系配制反應(yīng)體系中各成分每個(gè)樣品反應(yīng)組分用量/μL2×SYBRPremix12.520μmol/L引物P30.520μmol/L引物P40.5RT產(chǎn)物1.0ddH2O10.5總體積25.0反應(yīng)程序采用以下反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增：第一階段：95℃45s；第二階段：95℃10s，56℃10s，72℃15s，40個(gè)循環(huán)，每次循環(huán)在72℃延伸時(shí)收集熒光。熒光RT-PCR擴(kuò)增也可使用商品化的Real-timeRT-PCR試劑盒，按說明書操作。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)分析軟件得出的Ct值和擴(kuò)增曲線來判XX果。結(jié)果判定試驗(yàn)成立條件在陽(yáng)性對(duì)照的Ct值≤33且出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線，陰性對(duì)照Ct值≥35的情況下，試驗(yàn)成立。結(jié)果判定當(dāng)被檢樣品Ct值≤33且出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線時(shí)，判為陽(yáng)性；當(dāng)被檢樣品無Ct值或者Ct值≥35時(shí)，判為陰性；當(dāng)被檢樣品Ct值在33-35之間時(shí)判為可疑，需重做，再次檢測(cè)結(jié)果的Ct值＜35，且出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線，則判為陽(yáng)性，否則判為陰性。參見附錄B。RT-LAMP方法儀器與設(shè)備高速冷凍離心機(jī)。水浴鍋。紫外分析儀。試劑或材料TRIZol。無RNA酶水。甜菜堿（betaine）。TritonX-100。反轉(zhuǎn)錄酶AMV。RNA酶抑制劑。BstDNA聚合酶。SYBRGreenⅠ染料。陽(yáng)性參照物（鴨新型呼腸孤病毒）。陰性參照物（陰性尿囊液）。操作步驟樣品處理參見5.2.3.1。RNA提取參見5.2.3.2。引物RT-LAMP檢測(cè)引物序列見表3。RT-LAMP引物序列引物名稱序列（5’-3’）NDR-F3TGAGATATATTAGGGTGGGTCNDR-B3GACATGCCTAGTATGGAGCATNDR-FIPagcgatatcctgaggttgctTTTGCCATTGCTCTGCATGTCNDR-BIPaggcgaggatatgacgcTTTTCATCGATCATCTTCCAACCCRT-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)體系反應(yīng)體系為25.0μL，配制見表4。RT-LAMP反應(yīng)體系配制PCR反應(yīng)體系中各成分每個(gè)樣品反應(yīng)組分用量/μL10×Bstbuffer2.510mmol/LdNTP1.025mmol/LMgCl23.05mol/LBetaine2.010μmol/L外引物NDR-F30.510μmol/L外引物NDR-B30.540μmol/L內(nèi)引物NDR-FIP1.040μmol/L內(nèi)引物NDR-BIP1.040U/μLRNA酶抑制劑1.05U/μL反轉(zhuǎn)錄酶AMV1.08U/μLBstDNA聚合酶1.0RNA5.0無RNA酶水5.5總體積25.0反應(yīng)程序采用以下反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增：第一階段：63℃45min；第二階段：85℃2min。結(jié)果判定試驗(yàn)成立條件反應(yīng)結(jié)束后，取1μL10倍稀釋的SYBRGreenⅠ加入產(chǎn)物中，混勻后在紫外線下觀察。在陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)黃綠色熒光，同時(shí)陰性對(duì)照不出現(xiàn)黃綠色熒光的情況下，試驗(yàn)成立。結(jié)果判定在紫外線下被檢樣品出現(xiàn)黃綠色熒光，判為陽(yáng)性；在紫外線下被檢樣品未出現(xiàn)黃綠色熒光，判為陰性。參見附錄C。綜合判定符合臨床診斷規(guī)定的疑似病例經(jīng)5.2、5.3、5.4中的任一方法檢測(cè)，結(jié)果為陽(yáng)性者，可判定為鴨新型呼腸孤病毒病。

（資料性附錄）

RT-PCR結(jié)果電泳圖RT-PCR結(jié)果電泳圖見圖A.1。說明：M——