第三章環(huán)境毒理學(xué)的基本研究方法演示文稿

第三章環(huán)境毒理學(xué)的基本研究方法演示文稿當(dāng)前第1頁\共有59頁\編于星期五\8點優(yōu)選第三章環(huán)境毒理學(xué)的基本研究方法當(dāng)前第2頁\共有59頁\編于星期五\8點

研究方法流行病學(xué)研究受控的臨床研究毒理學(xué)體內(nèi)試驗毒理學(xué)體外試驗優(yōu)點·

真實的暴露條件·

規(guī)定的限定暴露條·

易于控制暴露條件·

影響因素少，易于控

·

在各化學(xué)物之間發(fā)生相·

在人群中測定反應(yīng)·

能測定多種效應(yīng)

制

互作用·

對某組人群(如哮喘)·

能評價宿主特征的作用·

可進行某些深入的研

·

測定在人群的作用

的研究是有力的(如：性別、年齡、遺究(如：機制，代謝)

·

表示全部的人敏感性·

能測定效應(yīng)的強度傳特征等和其他調(diào)控因·

人力物力花費較少

素飲食等)

·

能評價機制缺點·

耗資、耗時多·

耗資多·

動物暴露與人暴露相關(guān)·

不能全面反映毒作用

·

多為回顧性，無健康·

較低濃度和較短時

的不確定性

不能作為毒性評價和

保護間的暴露·

受控的飼養(yǎng)條件與人的

危險性評價的最后依

·

難以確定暴露，有混雜·

限于較少量的人群

實際情況不一致

據(jù)

暴露問題(一般<50)

·

暴露的濃度和時間的?！?/p>

難以觀察慢性毒作用

·

可檢測的危險性增加必·

限于暫時、微小、

式顯著地不同于人群的需達到2倍以上

可逆的效應(yīng)暴露

·

測定指標(biāo)較粗(發(fā)病率，·

一般不適于研究最

死亡率)

敏感的人群毒理學(xué)研究方法的優(yōu)缺點當(dāng)前第3頁\共有59頁\編于星期五\8點1實驗動物和人對外源化學(xué)物的反應(yīng)敏感性不同，有時甚至存在著質(zhì)的差別2高劑量向低劑量外推的不確定性3小數(shù)量實驗動物到大量人群外推的不確定性4成年健康動物向年老體弱及患病個體外推的不確定性實驗動物的毒理學(xué)實驗資料外推到人群接觸的安全性時的不確定性當(dāng)前第4頁\共有59頁\編于星期五\8點1化學(xué)物在實驗動物產(chǎn)生的作用，可以外推于人?；炯僭O(shè)①人是最敏感的動物物種；②人和實驗動物的生物學(xué)過程與體重

(或體表面積)相關(guān)。2實驗動物必須暴露于高劑量，這是發(fā)現(xiàn)對人潛在危害的必需的和可靠的方法。

3成年的健康(雄性和雌性未孕)實驗動物和人可能的暴露途徑是基本的選擇。描述毒理學(xué)試驗的基本原則當(dāng)前第5頁\共有59頁\編于星期五\8點1受試物毒作用的表現(xiàn)和性質(zhì)

2劑量—反應(yīng)(效應(yīng))研究

3確定毒作用的靶器官

4確定損害的可逆性

毒理學(xué)毒性評價試驗的基本目的當(dāng)前第6頁\共有59頁\編于星期五\8點實驗動物（laboratoryanimal）指經(jīng)人工培育，對其攜帶微生物實行控制，遺傳背景明確，來源清楚，可用于科學(xué)研究的動物。實驗動物的選擇當(dāng)前第7頁\共有59頁\編于星期五\8點實驗動物的選擇物種選擇

選擇對外液化學(xué)物的毒性反應(yīng)及代謝特點與人類接近的物種；選擇自然壽命不太長的物種；選擇易于飼養(yǎng)和實驗操作的物種；選擇經(jīng)濟并易于獲得的物種。

當(dāng)前第8頁\共有59頁\編于星期五\8點近交系動物連續(xù)20代以上兄妹交配或親子交配培育突變系動物突變的基因可世代相傳并保持遺傳基因特性雜交群動物兩個不同近交系之間有目的進行交配，所產(chǎn)生的第一代動物，亦稱雜交一代動物。封閉群動物

5年以上不從外部引進新血緣，僅由同一品系的動物在固定場所保存繁殖的動物群

實驗動物的選擇品系選擇當(dāng)前第9頁\共有59頁\編于星期五\8點無菌動物體內(nèi)外均無任何微生物和寄生蟲無特定病原體動物（SPF）體內(nèi)無特定微生物和寄生蟲存在的動物(無傳染病)。飼養(yǎng)于封閉的系統(tǒng)。清潔動物與SPF的不同：抗體檢查常有腦脊髓炎病毒、鼠肝炎病毒等抗體滴度，但不應(yīng)有臨床癥狀、病理改變及自然死亡。飼養(yǎng)在半屏蔽系統(tǒng)。微生物控制的選擇實驗動物的選擇當(dāng)前第10頁\共有59頁\編于星期五\8點個體選擇

1年齡2性別3生理狀態(tài)4健康狀況

實驗動物的選擇當(dāng)前第11頁\共有59頁\編于星期五\8點

品系周齡 Wistar SD

雌性 雄性 雌性 雄性

3 54 56 50 52 4 91 97 86 101 5 134 134 130 150 6 166 187 172 206 7 209 233 210 262 8 214 297 240 318 9 232 325 258 365 10 246 370 272 399 大鼠體重與周齡的關(guān)系當(dāng)前第12頁\共有59頁\編于星期五\8點

小鼠體重與周齡的關(guān)系

品系周齡 昆明 BALB/c C57BL/6 615

雌性 雄性 雌性 雄性 雌性 雄性 雌性 雄性

0 1.95 2.10 1.40 1.46 1.40 1.44 1.58 1.58 1 5.54 5.82 3.35 3.50 3.42 3.50 4.64 4.64 2 7.90 8.35 5.50 5.60 5.55 5.60 7.96 7.96 3 13.55 14.80 7.32 7.40 6.40 6.90 9.83 9.83 4 21.35 22.60 11.60 12.45 12.20 12.57 15.75 19.00 5 27.90 33.25 14.75 16.10 16.90 18.10 20.75 22.58 6 32.80 39.25 15.60 17.40 18.40 20.50 21.88 25.96 7 34.70 39.90 16.10 18.65 19.00 21.60 23.12 27.96 8 34.80 40.05 18.16 20.25 20.25 22.40 24.16 28.83 當(dāng)前第13頁\共有59頁\編于星期五\8點1未處理對照組(空白對照組)：本底值，質(zhì)量控制2陰性(溶劑／賦形劑)對照：與染毒組比較的基礎(chǔ)3陽性對照：檢測試驗體系的有效性4歷史性對照：檢查試驗體系的穩(wěn)定性，即進行實驗室質(zhì)量控制和保證

毒理學(xué)試驗常用對照當(dāng)前第14頁\共有59頁\編于星期五\8點

對各個毒理學(xué)試驗應(yīng)該用同一種、同一批號受試物

受試物成分和配方必須固定

如是異構(gòu)體混合物，異構(gòu)體比例必須固定

活性成分的百分含量和可檢測的雜質(zhì)的濃度也應(yīng)固定

受試物在貯存期內(nèi)穩(wěn)定性和在飼料中的穩(wěn)定性必須進行研究并報告

受試物應(yīng)一次備齊全部實驗的用量受試樣品當(dāng)前第15頁\共有59頁\編于星期五\8點毒理學(xué)試驗設(shè)計的統(tǒng)計學(xué)要求

隨機、重復(fù)、對照原則對常規(guī)毒理學(xué)試驗資料的統(tǒng)計學(xué)方法計量資料：一般用t檢驗或ANOVA

記數(shù)資料：卡方檢驗毒理學(xué)試驗的統(tǒng)計學(xué)當(dāng)前第16頁\共有59頁\編于星期五\8點1

處理組與對照組比較差別有無顯著性2

有無劑量-反應(yīng)關(guān)系3

是否伴有其他相關(guān)參數(shù)的改變4

是否在“正常”值范圍

實驗結(jié)果的判斷當(dāng)前第17頁\共有59頁\編于星期五\8點第一節(jié)急性毒性試驗一、急性毒性試驗的目的：

1、確定供試化學(xué)物急性毒性的劑量—反應(yīng)關(guān)系和中毒特征；

2、求LD50或LC50,為急性毒性評價提供依據(jù)。

3、研究毒物的毒動學(xué)和毒效學(xué)過程。表示急性毒性大小：

LD50(對受試物的個體感受性影響較小，有更高的重現(xiàn)性)當(dāng)前第18頁\共有59頁\編于星期五\8點二、試驗程序與評價

1．動物選擇：首選受試物在體內(nèi)代謝情況與人體內(nèi)相近的或?qū)κ茉囄镒蠲舾械钠废?。一般：以哺乳動物為主，常用大鼠、小鼠；?jīng)皮：兔、豚鼠、豬應(yīng)對兩種性別、成年和幼年動物進行測定。選擇兩種以上的實驗動物，最好一為嚙齒類，一為非嚙齒類。(目的：核對種間差異)當(dāng)前第19頁\共有59頁\編于星期五\8點2．染毒途徑與方式：一般與人的接觸途徑相同。

(1)經(jīng)口染毒：常用灌胃法，也可將受試物放在飲水中由動物自由攝取。

(2)經(jīng)呼吸道染毒：將實驗動物放在有毒氣或粉塵的染毒柜內(nèi)進行染毒。急性吸入染毒采用靜式染毒瓶(柜)，染毒2—4h。

(3)經(jīng)皮膚染毒：主要用于化學(xué)物經(jīng)皮(或粘膜)吸收所引起的急性毒性。正式給藥前24h，背部脫毛，勿傷皮膚。將受試物均勻涂布于皮膚表面，用紗布覆蓋，共敷24h。當(dāng)前第20頁\共有59頁\編于星期五\8點3．試驗程序：（1）劑量與分組①預(yù)試驗：找出受試物大致致死量范圍(死亡率為10%~90%)；例：欲做化合物A的經(jīng)口預(yù)試驗?；衔顱的化學(xué)結(jié)構(gòu)與A相似，已知B的=LD50=40(預(yù)期毒性中值)。則預(yù)試驗取2.5、10、40、160、640(上下各推1~2組，組距應(yīng)較大，初始4倍差)

當(dāng)前第21頁\共有59頁\編于星期五\8點③求LD50正式試驗：在LD100與LD0之間設(shè)5—7個劑量組。

組距(對數(shù))

或

式中：n------設(shè)計的劑量組數(shù)（2）癥狀觀察

時間：24h或兩周內(nèi)的反應(yīng)當(dāng)前第22頁\共有59頁\編于星期五\8點當(dāng)前第23頁\共有59頁\編于星期五\8點三、LD50的計算與結(jié)果評價

計算方法：概率單位法和寇氏法。

LD50值愈小，毒性愈大。當(dāng)前第24頁\共有59頁\編于星期五\8點當(dāng)前第25頁\共有59頁\編于星期五\8點當(dāng)前第26頁\共有59頁\編于星期五\8點概率單位法當(dāng)前第27頁\共有59頁\編于星期五\8點當(dāng)前第28頁\共有59頁\編于星期五\8點存在正態(tài)曲線關(guān)系。標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)差d=(x-μ)/δ

式中：x——劑量對數(shù)；

μ——劑量對數(shù)均數(shù)

δ——

標(biāo)準(zhǔn)差當(dāng)前第29頁\共有59頁\編于星期五\8點d=0，左邊面積(死亡率)為50％，右邊面積(存活率)50％d=1，死亡率為84.13％，d=2，死亡率為97.73％,d＞2，死亡率接近100％。d=一1，死亡率為15.87％。d=一2，死亡率為2.27％。d＜一3，死亡率接近0。當(dāng)前第30頁\共有59頁\編于星期五\8點當(dāng)前第31頁\共有59頁\編于星期五\8點從上表，可以任一死亡率換算為相應(yīng)的概率單位。當(dāng)前第32頁\共有59頁\編于星期五\8點A：劑量對數(shù)~死亡百分率B：劑量對數(shù)~概率單位當(dāng)前第33頁\共有59頁\編于星期五\8點當(dāng)前第34頁\共有59頁\編于星期五\8點LC50計算步驟如下：a.根據(jù)死亡率查概率單位(死亡率為100％或0％不計)b.繪圖求回歸方程。c.求y=5的濃度對數(shù)（m），其反對數(shù)即為LC50同理可得LC5、LC10、……當(dāng)前第35頁\共有59頁\編于星期五\8點d.求LC50的可信限先求LC50的標(biāo)準(zhǔn)誤差(Sm)：

S(校準(zhǔn)差)=1/k

本例中：S=1/2.78

當(dāng)前第36頁\共有59頁\編于星期五\8點當(dāng)前第37頁\共有59頁\編于星期五\8點平均致死量法（又名寇氏法）

試驗要求：①每個試驗組動物數(shù)相同；②各組劑量按等比級數(shù)分組；③最大劑量的死亡率最好為100％或與之接近，最小劑量的死亡率最好為0％或與之接近。當(dāng)前第38頁\共有59頁\編于星期五\8點式中：Xm——最大劑量的對數(shù)值；i—相鄰劑量比值的對數(shù)；

——各組死亡率的總和（以小數(shù)表示）。當(dāng)前第39頁\共有59頁\編于星期五\8點例小鼠腹腔注射致百蟲急性毒性試驗結(jié)果如下表所示，求

LD50當(dāng)前第40頁\共有59頁\編于星期五\8點式中：p——一個組死亡率；q——一個組存活率；i——相鄰劑量比值的對數(shù)；h——各組動物數(shù)。當(dāng)前第41頁\共有59頁\編于星期五\8點當(dāng)前第42頁\共有59頁\編于星期五\8點第二節(jié)亞慢性和慢性毒性試驗一、蓄積試驗及其方法：（一）蓄積作用：某些物質(zhì)以較小劑量反復(fù)作用于機體，可使機體對該物質(zhì)的反應(yīng)性增強，即一次染毒不引起明顯中毒反應(yīng)或死亡的劑量，經(jīng)分次重復(fù)染毒后，可引起明顯中毒或死亡，此種現(xiàn)象稱為蓄積作用(accumulation)?？煞謨煞N：

物質(zhì)蓄積：毒物在體內(nèi)的排出量小于進入量，以致毒物在體內(nèi)的貯留量增多為物質(zhì)蓄積；

功能蓄積：毒物進入機體后，并未發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)明顯貯留，但可引起機體功能改變的逐漸累積，導(dǎo)致對該毒物的反應(yīng)性增強。當(dāng)前第43頁\共有59頁\編于星期五\8點

耐受性(tolerance)：機體多次接觸化學(xué)物質(zhì)后．對該物質(zhì)產(chǎn)生反應(yīng)性減弱的現(xiàn)象，顯示不易發(fā)生慢性中毒。

（二）蓄積作用的測定方法有多種，常用蓄積系數(shù)法。蓄積系數(shù)(accumulationcoefficient)K：

ED50(n)——多次染毒使半數(shù)動物出現(xiàn)某種效應(yīng)的總劑量;ED50(1)——一次染毒引起同一效應(yīng)半數(shù)效量。當(dāng)前第44頁\共有59頁\編于星期五\8點若以死亡為毒效應(yīng)指標(biāo)，上式為K越小，受試化合物的蓄積毒性越大。K蓄積作用強度＜1高度蓄積1~3明顯蓄積3~5中度蓄積＞5輕度蓄積當(dāng)前第45頁\共有59頁\編于星期五\8點1．固定劑量法：固定每天染毒劑量為1/20—1/5LD50，連續(xù)染毒，直至實驗動物半數(shù)死亡。如果染毒劑量累計已達5個LD50

動物死亡仍末達半數(shù)，實驗均可告結(jié)束，計算蓄積系數(shù)，作出評價。

2．遞增劑量法：先測定LD50（1），然后對另一組動物每天染毒，以4天為一期，開始給予0.1LD50。以后每期按1.5倍遞增劑量，直至動物半數(shù)死亡，或?qū)嶒炓堰_28天，可結(jié)束實驗，計算系數(shù)。

3.二十天試驗法：選用大鼠或小鼠每個劑量組雌雄各10只，以1/2、l/5、1/10、1/20LD50分別對每組進行染毒，每日1次，共20天。如l/20LD50組動物有死亡，且有劑量—反應(yīng)關(guān)系，則有較強蓄積作用；如1/20LD50組無死亡，則為弱蓄積。蓄積系數(shù)的測定當(dāng)前第46頁\共有59頁\編于星期五\8點二、亞慢性毒性作用及其試驗方法：1、目的：確定化學(xué)物亞慢性毒性的閾劑量和NOEL。2、試驗期限：3-6月；呼吸道吸收：30-90天；皮膚毒性：30天。3、試驗動物的選擇、飼養(yǎng)環(huán)境及染毒途徑：

試驗動物選擇：對受試化學(xué)物敏感的物種或品系；

環(huán)境：營養(yǎng)合理，飲水清潔、充足、溫、光、濕適宜；

染毒途徑：盡量模擬人類在環(huán)境中接觸受試化學(xué)物的途徑，與急性毒性試驗相似。當(dāng)前第47頁\共有59頁\編于星期五\8點4、劑量選擇與分組

劑量：1／80—I／50LD50，對于在體內(nèi)不產(chǎn)生蓄積作用而排泄又快的物質(zhì)可適當(dāng)加大劑量，反之則可減少劑量。

設(shè)3—4個實驗組和1個對照組。

實驗組要求：在實驗結(jié)束時

最低劑量組不產(chǎn)生可觀察到的毒性反應(yīng)；

最高劑量組能引起明顯毒性反應(yīng)，但不引起死亡；

中間劑量組產(chǎn)生輕微毒性反應(yīng)。當(dāng)前第48頁\共有59頁\編于星期五\8點5、癥狀觀察一般性指標(biāo)(非特異)①一般綜合性指標(biāo)：動物體重增長率、食物消耗率、活動能力等。②一般化驗性指標(biāo)：主要指血和肝、腎功能的檢測。(2)特異指標(biāo)：測定特異性反應(yīng)。更確切闡明該物質(zhì)的閾劑量(濃度)及無作用劑量(濃度)。(3)病理組織學(xué)檢查：實驗中死亡動物的病理檢查及實驗結(jié)束時的尸檢。當(dāng)前第49頁\共有59頁\編于星期五\8點三、慢性毒性作用及其試驗方法1、目的：評價化學(xué)物在長期小劑量作用的條件下對機體產(chǎn)生的損害及其特點．確定閾劑量和最大無作用劑量。2、試驗方法：（1）動物選擇、染毒方法、觀察指標(biāo)等與亞慢性毒性試驗相似；（2）染毒期限：1-2年或終身染毒，也有人提出6月。（3）劑量分組：

3個染毒組和一個對照組。高劑量組：1/5—1/2亞慢性試驗閾值；中間劑量：1/50—1/10；低劑量組：1/100。當(dāng)前第50頁\共有59頁\編于星期五\8點第四節(jié)致突變實驗一、目的確定外源化學(xué)物對生物體是否具有致突變作用。基因點突變試驗、染色體畸變試驗、DNA損傷試驗。二、供試生物：微生物、動物細胞、昆蟲、動物或植物三、試驗方法體外基因突變試驗、細胞遺傳學(xué)試驗、體內(nèi)基因突變試驗、DNA損傷試驗當(dāng)前第51頁\共有59頁\編于星期五\8點（一）體外基因突變試驗1、Ames試驗（鼠傷寒沙門氏菌/動物肝細胞微粒體試驗）

（1）原理：利用一種突變微生物菌株與被檢測化學(xué)物接觸，使突變型微生物回復(fù)突變，重新成為野生型微生物。

突變型微生物不具備合成組氨酸的能力，不能在不含（或低濃度）組氨酸培養(yǎng)基上生長。當(dāng)前第52頁\共有59頁\編于星期五\8點（2）方法：將突變型沙氏菌在不含（或低濃度）組氨酸培養(yǎng)基上培養(yǎng),以其生長狀況作為指標(biāo)。在培養(yǎng)基中加入哺乳動物的肝細胞微粒體：提高靈敏度。當(dāng)前第53頁\共有59頁\編于星期五\8點（3）特點：優(yōu)點：簡便、靈敏、快速（48h）、費用低；檢測結(jié)果與對動物的致癌性的相符率達約90%。

缺點：利用微生物作為供試物，不能全面反映哺乳動物的遺傳信息，僅1/6；微生物的DNA修復(fù)系統(tǒng)與動物有差異；微生物無免疫功能。

當(dāng)前第54頁\共有59頁\編