地中海貧血的研究進(jìn)展

地中海貧血診斷(zhěnduàn)和治療的進(jìn)展中山大學(xué)附屬(fùshǔ)第二醫(yī)院兒科李文益第一頁，共五十八頁。精選ppt

發(fā)病率(含雜合子(hézǐ))：

●全世界約1.5億人攜帶血紅蛋白病基因

全國：異常血紅蛋白0.33%α-地貧2.64%β-地貧0.66%

廣東：α-地貧7.3%(9.64%)β-地貧1.83～3.36%(3.54%)

廣西：α-地貧14.9%●繼發(fā)性α-地貧

第二頁，共五十八頁。精選ppt

遺傳學(xué)

·

α珠蛋白基因簇位于(wèiyú)16號(hào)染色體上

·

β珠蛋白基因簇位于11號(hào)染色體上第三頁，共五十八頁。精選ppt

IVSI

IVSⅡ

16號(hào)染色體5’

3’

13132991001415’3’ζФζФα1α2α1

Kb0102030

第四頁，共五十八頁。精選ppt

IVSⅠIVSⅡ

11號(hào)染色體5’3’

13031104105146

5’

3’ψβ2εGγAγψβ1δβkb0102030405060

第五頁，共五十八頁。精選ppt缺失(quēshī)型α-地貧◆全世界缺失型已達(dá)31種◆其中－α4.2(左側(cè)(zuǒcè)缺失)和－α3.7(右側(cè)缺失)缺失型是遍布全世界的類型，其余突變則隨地理和人群分布的不同而異?！粼谖覈鲜龆N缺失外，尚有－SEA(缺失20kb)、THAI(缺失31kb)、FIL(缺失30～34kb)和－α2.7等。第六頁，共五十八頁。精選ppt

非缺失型α-地貧◆目前已報(bào)道42種◆包括啟動(dòng)子突變、剪接點(diǎn)突變、移碼突變、無義突變、終止密碼子突變、核苷酸信號(hào)位點(diǎn)改變等◆中國(zhōnɡɡuó)人非缺失型：HbCS終止密碼子突變?chǔ)?TAA→CAAHbQOα2CD125(Lcu→Pro)◆其他：HbDuan，Hbwestmead,HbHekinan,HbH-CD30,HbH-CD31,HbH-CD59

第七頁，共五十八頁。精選ppt獲得性α-地中海貧血(pínxuè)●繼發(fā)于惡性(èxìng)血液病/MDS●機(jī)制：◆acquireddeletionofthe-globingeneclusterlimitedtotheneoplasticclone◆morecommonly,inactivatingsomaticmutationsofthetrans-actingchromatin-associatedfactorATRX,whichcausedramaticdown-regulationof-globingeneexpression.第八頁，共五十八頁。精選ppt

β-地貧◆以點(diǎn)突變?yōu)橹?，少?shù)為缺失所致(suǒzhì)◆全世界報(bào)告突變類型>170，中國28種◆中國常見類型：(9省區(qū)檢測資料)CD41-42(41.6%)、IVS-Ⅱ-654(21.8%)CD17(18.0%)、TATA-nt-28(8.0%)CD71/72(+A)(3.9%)、TATA-29(1.2%)CD26(HbE)第九頁，共五十八頁。精選ppt診斷(zhěnduàn)※臨床表現(xiàn)★β地貧：◆輕型常無臨床癥狀或輕微貧血?！糁匦?zhòngxíng)患者在嬰兒期出現(xiàn)慢性進(jìn)行性貧血、輕度黃疸（間歇性）、肝脾腫大；常有發(fā)育不良和骨骼改變，出現(xiàn)地中海貧血面容?！糁虚g型多在幼兒期出現(xiàn)貧血，其癥狀比重型輕。第十頁，共五十八頁。精選ppt★α地貧：◆靜止型無臨床癥狀，◆輕型常無臨床癥狀或輕微貧血?！糁虚g型（HbH）多在幼兒期或以后出現(xiàn)貧血、黃疸、肝脾腫大；感染常使貧血加重甚至出現(xiàn)溶血危象?！糁匦投喑霈F(xiàn)死胎(sǐtāi)或胎兒水腫綜合征。第十一頁，共五十八頁。精選ppt※實(shí)驗(yàn)室檢查★血象：貧血為小細(xì)胞低色素性，MCV＜80fl，MCH＜28pg，MCHC＜32%。網(wǎng)織紅細(xì)胞正?；蛟龈?zēnggāo)。外周血細(xì)胞涂片染色示紅細(xì)胞大小不等，中央淺染色區(qū)擴(kuò)大，出現(xiàn)異型、靶形、碎片紅細(xì)胞和有核紅細(xì)胞、點(diǎn)彩紅細(xì)胞、嗜多染性紅細(xì)胞、豪-周小體等。第十二頁，共五十八頁。精選ppt★地貧篩查：

◆地貧5項(xiàng)：①溶血度（脆性），正常值：＞60%；②HbF；③Hb電泳：HbA2,HbH；④紅細(xì)胞形態(tài)（參見(cānjiàn)上）；⑤ZPP，以排除缺鐵性貧血◆地貧6項(xiàng)：：①溶血度（脆性）；②Hb電泳；③HbF；④HbA2；⑤MHb；⑥G6PD活性。第十三頁，共五十八頁。精選ppt

※α-地貧的基因診斷(zhěnduàn)★缺失型：◆

Southern印跡雜交—限制性酶譜分析法：

主要用于較大片段缺失◆PCR法：

▲跨越斷裂點(diǎn)的PCR擴(kuò)增法(gap-PCR)：

可診斷、區(qū)分α地貧1純合子和雜合子▲由gap-PCR衍生的多重PCR：一次PCR擴(kuò)增能夠明確缺失突變形成的各種α地貧基因型或臨床類型。第十四頁，共五十八頁。精選ppt★非缺失型◆Southern印跡雜交診斷法◆PCR-酶解法：◆擴(kuò)建酶切點(diǎn)法：◆PCR-ASO◆其他方法(fāngfǎ)：聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)合單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（PCR-SSCP）和變性梯度凝膠電泳（DGGE）也曾用于α地貧點(diǎn)突變的基因分析，一般多用于點(diǎn)突變的研究而不是基因診斷和產(chǎn)前診斷。第十五頁，共五十八頁。精選ppt※β-地中海貧血的基因診斷◆PCR結(jié)合ASO探針斑點(diǎn)雜交技術(shù)(jìshù)◆擴(kuò)增不應(yīng)突變系統(tǒng)法（ARMS法）◆DNA芯片技術(shù)（DNAchip）◆反向點(diǎn)雜交（Reversedotblot,RDB）第十六頁，共五十八頁。精選pptβ-地貧的鑒別(jiànbié)診斷

與小細(xì)胞低色素性貧血的鑒別●缺鐵性貧血●感染或炎癥性貧血●肺含鐵血(tiěxuè)黃素沉著癥●鐵粒幼紅細(xì)胞性貧血●鉛中毒●銅缺乏●先天性轉(zhuǎn)鐵蛋白缺乏癥第十七頁，共五十八頁。精選ppt※缺鐵性貧血

●多于6月~2歲發(fā)病，無家族史●不當(dāng)喂養(yǎng)史●無溶血(rónɡxuè)證據(jù)，網(wǎng)織紅N/↓●SI、TS、SF↓TIBC、FEP↑●骨髓內(nèi)、外鐵減少第十八頁，共五十八頁。精選ppt※慢性感染性貧血

●有感染(gǎnrǎn)、炎癥史及相應(yīng)臨床表現(xiàn)

●貧血有時(shí)僅為小細(xì)胞性

●無溶血，網(wǎng)織紅N/↓

●SI、TIBC、TS↓，SF、FEP↑

●鐵粒幼細(xì)胞↓，外鐵↑

第十九頁，共五十八頁。精選ppt※鐵粒幼紅細(xì)胞性貧血

●頑固貧血，鐵劑治療無效，個(gè)別(gèbié)病例母系B6治療有效

●無溶血，網(wǎng)織紅N/↓

●BM、外鐵↑，鐵粒幼紅↑，可見環(huán)狀鐵粒幼紅細(xì)胞●SI、SF、FEP↑、TIBCN/↓第二十頁，共五十八頁。精選ppt※肺含鐵血黃素沉著癥●發(fā)作性蒼白，無力(wúlì)，咳嗽，痰中帶血●X線胸片肺野中可見網(wǎng)點(diǎn)狀陰影●痰和胃液中可找到含鐵血黃素細(xì)胞●小細(xì)胞低色素性貧血，網(wǎng)織紅↑●SI、TS↓、TIBC↑●SR↑第二十一頁，共五十八頁。精選ppt※鉛中毒

●紅細(xì)胞中可見嗜堿性點(diǎn)彩

●長骨(chánggǔ)X線改變

●FEP↑↑※銅缺乏性貧血

●脂溢性皮炎，皮膚毛發(fā)色素少淺表靜脈擴(kuò)張，自發(fā)性骨折精神障礙

●貧血、WBC↓，血銅藍(lán)蛋白↓第二十二頁，共五十八頁。精選ppt※轉(zhuǎn)鐵蛋白缺乏癥●自幼貧血(pínxuè)，1歲時(shí)貧血(pínxuè)嚴(yán)重●肝脾輕度大，鐵劑治療無效●網(wǎng)織紅↓，BM內(nèi)、外鐵↓●SI、TIBC、TS、SF↓※其他：Coombs陰性自溶第二十三頁，共五十八頁。精選ppt

*

地中海貧血(pínxuè)的預(yù)防

?

人群普查

?

遺傳咨詢

?

產(chǎn)前診斷第二十四頁，共五十八頁。精選ppt

治療

★紅細(xì)胞輸注和去鐵治療(zhìliáo)

●本療法仍是最基本治療方法

●高、中量輸血配合鐵螯合劑

●能活到成年并達(dá)到(dádào)正常人的生活能力

缺點(diǎn)：需終身治療，費(fèi)用昂貴易出現(xiàn)輸血副反應(yīng)，尤其是輸血傳染病等第二十五頁，共五十八頁。精選ppt紅細(xì)胞輸注①低量輸血法：目前已不用此法

②中量輸血法(moderatetransfusion)維持(wéichí)輸血之前的Hb濃度＞90～105g/L

③高量輸血法(hypertransfusion):維持輸血前Hb＞100g/L

④超量輸血法(supertransfusion)：維持輸血前Hb＞120g/L第二十六頁，共五十八頁。精選ppt紅細(xì)胞輸注

●每次輸濃縮紅細(xì)胞10～20ml/kg,每2～4周1次●使輸注后Hb濃度達(dá)130～135g/L●無論何種方法，每次輸注之后Hb不能超過150g/L●濃縮紅細(xì)胞輸注速度(sùdù)應(yīng)＜4～5ml/（kg·h）●重度貧血者輸注的速度應(yīng)更慢＜2ml/kg·h）第二十七頁，共五十八頁。精選ppt去鐵治療(zhìliáo)

鐵螯合劑去鐵胺(deferoxamine,DFO)過早使用（＜１歲）可產(chǎn)生骨骼(gǔgé)畸形、生長抑制等副作用，在規(guī)則輸血１年或輸紅細(xì)胞10～20單位之后進(jìn)行鐵負(fù)荷的評(píng)估第二十八頁，共五十八頁。精選ppt鐵負(fù)荷(fùhè)的評(píng)估方法：

①

測定血清鐵蛋白(SF),簡便可行，但影響因素較多；②肝穿刺后測定肝組織的鐵含量，此法較準(zhǔn)確,但屬損傷性檢查，一般醫(yī)院難于實(shí)行(shíxíng)；③

影像學(xué)方法如MRI，此法雖簡便但準(zhǔn)確度不夠且費(fèi)用高如有鐵超負(fù)荷，則開始使用鐵螯合劑(>3.2mg/g干肝組織或血清鐵蛋白＞第二十九頁，共五十八頁。精選pptDFO劑量(jìliàng)

●20～60mg/kg.d，每周應(yīng)用5～6天●長期應(yīng)用以控制鐵蛋白在1000～2000μg/L之間為理想，采用連續(xù)皮下注射12小時(shí)，或持續(xù)靜脈滴注8～12小時(shí)等方法(fāngfǎ)●缺點(diǎn)是使用較麻煩,病兒依從性差，如使用不當(dāng)(鐵負(fù)荷輕而用大劑量DFO）,可致白內(nèi)障、聽力喪失、長骨生長障礙等副作用第三十頁，共五十八頁。精選ppt口服(kǒufú)鐵螯合劑※deferiprone(L1)●化學(xué)名羥基吡啶1，二齒狀分子結(jié)構(gòu)●以3:1與Fe3+結(jié)合，結(jié)合效率差些●吸收快，迅速轉(zhuǎn)化成活性形式，排泄快●1984年臨床實(shí)驗(yàn)，1995年上市(卬度)●常用量75mg/kg.d●短期療效較差，長期療效仍有爭議(zhēngyì)●副作用：關(guān)節(jié)痛、(常見)粒細(xì)胞減少(嚴(yán)重)、鋅缺乏、胃腸反應(yīng)、肝功能異常第三十一頁，共五十八頁。精選ppt※ICL670●三齒狀分子結(jié)構(gòu)三氮唑化合物●以2:1與Fe3+結(jié)合(jiéhé)●吸收快，在血循環(huán)中存活幾小時(shí)●效果為DFO的5倍，L1的10倍●劑量20mg/kg.d●副作用：胃腸反應(yīng)，皮疹。肝腎功能無影響。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)I小管上皮細(xì)胞有改變(非鐵超負(fù)荷)第三十二頁，共五十八頁。精選ppt

造血干細(xì)胞移植（HSCT）●是目前(mùqián)能夠根治重型β地貧的一種治療方法●HSCT分為骨髓移植(BMT)、臍血移植(UCBT)和外周血干細(xì)胞移植（PBSCT）●胎兒期予HSCT:宮內(nèi)造血干細(xì)胞移植(IUSCT)第三十三頁，共五十八頁。精選pptBMT治療(zhìliáo)重型β地貧

●1982年首例成功●至今全世界應(yīng)用已達(dá)1000余例●長期生存率達(dá)80％●供體來源困難，費(fèi)用(fèiyong)昂貴血第三十四頁，共五十八頁。精選pptUCBT治療(zhìliáo)重型β地貧

●1989年首例UCBT治療范可尼貧血成功●1995年泰國治療HbE／β地貧獲得成功●1998年1月中山二院在內(nèi)地開展首例●不少醫(yī)院開展，總數(shù)已超過100例●由血緣相關(guān)發(fā)展(fāzhǎn)至無血緣相關(guān)●HLA位點(diǎn)由全相合發(fā)展至1～3個(gè)位點(diǎn)不合第三十五頁，共五十八頁。精選ppt異基因(jīyīn)外周血干細(xì)胞移植(Allo-PBSCT）

●1989年治療1例慢性白血病取得成功，血細(xì)胞分離機(jī)從外周血可采到足夠的造血干細(xì)胞供者無需麻醉，安全(ānquán)●PBSCT治療地貧國外從1996年開始，香港1998報(bào)告３例，內(nèi)地1999年中山二院首例，各地陸續(xù)開展第三十六頁，共五十八頁。精選ppt宮內(nèi)造血(zàoxuè)干細(xì)胞移植

●國外于1996年開始報(bào)告(bàogào)，但至目前僅數(shù)例●國內(nèi)尚未開展第三十七頁，共五十八頁。精選ppt基因治療

★根治性基因治療（基因矯正治療）●基因矯正治療是把正常的目的基因?qū)塍w內(nèi)，并達(dá)到適當(dāng)、有效、持久的表達(dá)，以完全取代原來的病態(tài)基因●β地貧是β珠蛋白基因的單基因缺陷遺傳病，理論上是基因治療最理想的模型●1984年開始基因治療的研究，進(jìn)展緩慢，其原因之一是載體問題，二是轉(zhuǎn)導(dǎo)(zhuǎndǎo)的β珠蛋白基因片段的大小。第三十八頁，共五十八頁。精選ppt★β珠蛋白基因族●非常龐大，調(diào)控(diàokònɡ)也非常復(fù)雜●β珠蛋白基因組●上游基因調(diào)節(jié)元件即位點(diǎn)調(diào)控區(qū)(locuscontrolregion,LCR)的DNase敏感（hypersensitive,HS）片段（包括HS2、HS3、HS4）對(duì)轉(zhuǎn)導(dǎo)后的基因表達(dá)非常重要。第三十九頁，共五十八頁。精選ppt★逆轉(zhuǎn)錄病毒載體●常用癌瘤逆轉(zhuǎn)錄病毒（onco-retroviralvector）攜帶β珠蛋白基因(jīyīn)及其調(diào)節(jié)元件●將人珠蛋白基因?qū)胄∈蠹t白血病(MEL)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),可成功表達(dá)β珠蛋白●在小鼠動(dòng)物模型上將β基因通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染鼠造血干細(xì)胞,在受體紅細(xì)胞中獲得表達(dá)。將人β珠蛋白基因?qū)毽碌刂泻Ｘ氀∈篌w內(nèi),其癥狀可獲得部分改善第四十頁，共五十八頁。精選ppt逆轉(zhuǎn)錄病毒載體有如下缺點(diǎn)：①載體的容量有限（僅7kb左右），無法完全包含β珠蛋白基因組及其上游LCR片段(piànduàn)，因而表達(dá)效價(jià)低和不穩(wěn)定；②不能轉(zhuǎn)染靜止期細(xì)胞；③病毒隨機(jī)插入靶細(xì)胞的基因組中可使插入點(diǎn)附近的基因表達(dá)失控，插入的基因也有可能不恰當(dāng)?shù)谋磉_(dá)；④病毒可能感染宿主；⑤致癌作用，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已發(fā)現(xiàn)淋巴瘤發(fā)生。第四十一頁，共五十八頁。精選ppt慢病毒(bìngdú)（lentivirus）載體●優(yōu)點(diǎn)是：①載體容量大，能包含大片段的β珠蛋白基因組及其上游調(diào)節(jié)元件，保證β珠蛋白基因的高效、穩(wěn)定表達(dá)；②可以轉(zhuǎn)染靜止期細(xì)胞,并能永久表達(dá)。●常用的是HIV-1為基礎(chǔ)(jīchǔ)的慢病毒載體。第四十二頁，共五十八頁。精選ppt2000年MayC等首次應(yīng)用攜帶有大片段的調(diào)節(jié)序列的人的β珠蛋白基因慢病毒載體轉(zhuǎn)染小鼠骨髓細(xì)胞，人的β珠蛋白基因有效、準(zhǔn)確的整合到宿主(sùzhǔ)DNA中，并能高效表達(dá)，合成正常血紅蛋白可達(dá)17-24%，達(dá)到治療β地中海貧血小鼠的目的。文章發(fā)表在Nature第四十三頁，共五十八頁。精選pptPawlin等（2001）、Imrens等（2002）、Persons等（2003）、Levasceur等（2003）、Rivella等（2003）報(bào)告采用同樣載體，在中間型β地貧鼠（Hbbth3/+）模型中顯示每拷貝載體可使Hb增加(zēngjiā)1.1～2.3g/dl，血液參數(shù)明顯糾正,紅細(xì)胞形態(tài)明顯好轉(zhuǎn)。第四十四頁，共五十八頁。精選ppt●以上用的Hbbth3/+鼠為中間型鼠●為了更接近人重型β地貧，Rivella等建立了重型β地貧鼠模型。這種鼠如不治療將在6～8周內(nèi)死于嚴(yán)重貧血（Hb2～3g/dl）●用上述載體(zàitǐ)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)后則轉(zhuǎn)變?yōu)橹虚g型地貧鼠。由此提示治療人重型β地貧時(shí)，采用這些載體(zàitǐ)轉(zhuǎn)導(dǎo)β或γ珠蛋白基因還需要更高的表達(dá)。第四十五頁，共五十八頁。精選ppt位點(diǎn)獨(dú)立性表達(dá)（positionindependentexpression）：在鼠的研究中還發(fā)現(xiàn)一個(gè)特征，盡管(jǐnguǎn)包含了β或γ珠蛋白基因的調(diào)節(jié)元件，但β或γ珠蛋白的表達(dá)在不同的鼠之間差異很大雞HS4(cHS4)具染色質(zhì)隔離成分（chromatininsulatorelement），在癌瘤逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中已發(fā)現(xiàn)可減少位點(diǎn)作用差異（positioneffectvariegation,PEV）cHS4元件具有阻斷增強(qiáng)子活性作用，可能有較好的載體生物安全性，對(duì)克服載體的致癌作用很重要。第四十六頁，共五十八頁。精選pptPuthenveetil等報(bào)告采用慢病毒載體，所包含的β珠蛋白基因族中加入cHS4染色質(zhì)隔離成分,修正后的人β地貧CD34＋細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)中得到一致的紅系分化(fēnhuà)和糾正異常的β地貧特征，移植入免疫缺陷鼠后，3～4個(gè)月后仍是紅系正常分化(fēnhuà)。第四十七頁，共五十八頁。精選ppt基因(jīyīn)調(diào)控治療

●是廣義的基因治療●機(jī)理是根據(jù)β地貧的病理生理基礎(chǔ)是α鏈和非α鏈合成速率的不平衡，藥物來激活(jīhuó)非α鏈珠蛋白基因的功能，增加非α鏈珠蛋白的合成速率；或抑制α珠蛋白基因功能，降低α珠蛋白的成速率的合成速率；減輕α和非α珠蛋白的失衡程度減輕臨床癥狀第四十八頁，共五十八頁。精選ppt基因(jīyīn)調(diào)控治療主要有：

①

藥物基因(jīyīn)調(diào)控治療；②

反義核酸性基因調(diào)控治療；③

造血生長因子治療。④中藥治療第四十九頁，共五十八頁。精選ppt藥物基因調(diào)控治療1982年首先(shǒuxiān)報(bào)告應(yīng)用５-氮胞核苷許多藥物，如羥基脲、丁酸鹽、阿糖胞苷、馬利蘭、雷米封等都有研究報(bào)告羥基脲（HU）的研究報(bào)告最多，效果也較好第五十頁，共五十八頁。精選ppt羥基(qiǎngjī)脲（HU）

是抑制二磷酸核糖核苷還原酶的S期特異性細(xì)胞毒藥物(yàowù)，一種相對(duì)