細(xì)胞融合與體細(xì)胞雜交演示文稿

細(xì)胞融合與體細(xì)胞雜交演示文稿本文檔共83頁；當(dāng)前第1頁；編輯于星期二\5點(diǎn)38分細(xì)胞融合與體細(xì)胞雜交本文檔共83頁；當(dāng)前第2頁；編輯于星期二\5點(diǎn)38分孕育新生命的太空“婚禮”一場籌備了10年之久的兩對“細(xì)胞太空婚禮”將在“神舟4號”飛船上舉行。植物細(xì)胞電融合實(shí)驗(yàn)采用的是有液泡的黃花煙草原

生質(zhì)體和脫液泡的“革新一號”煙草原生質(zhì)體。動物細(xì)胞電融合實(shí)驗(yàn)采用純化的乙肝疫苗病毒表面抗原免疫的小鼠B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞。在微重力條件下，細(xì)胞在融合液中的重力沉降現(xiàn)象將消失，更有利于細(xì)胞間進(jìn)行配對與融合。細(xì)胞電融合實(shí)驗(yàn)不僅可以培育出地球上植物的新品種，還能為科研人員培養(yǎng)出特定的動物細(xì)胞，為藥廠提供大量所需的單克隆抗體。本文檔共83頁；當(dāng)前第3頁；編輯于星期二\5點(diǎn)38分

一道選擇題我國2002年12月30日發(fā)射的“神舟4號”飛船順利返回

在飛船上進(jìn)行了空間動物細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn),該實(shí)驗(yàn)所依)

據(jù)的原理和促進(jìn)細(xì)胞融合的方法分別是(

A、細(xì)胞的全能性；滅活病毒誘導(dǎo)融合

B、細(xì)胞的全能性；電刺激融合

C、細(xì)胞膜的流動性；滅活病毒誘導(dǎo)融合

D、細(xì)胞膜的流動性；電刺激融合本文檔共83頁；當(dāng)前第4頁；編輯于星期二\5點(diǎn)38分神舟六號-空間細(xì)胞搭載體系進(jìn)行了心肌細(xì)胞和成骨細(xì)胞原代培養(yǎng)及地面模擬試驗(yàn)；考察在飛船入軌前與入軌后不同重力條件下細(xì)胞樣品的狀態(tài)與變化。利用“神舟”6號飛船艙內(nèi)環(huán)境，在有人參與的條件下進(jìn)行空間細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)。本文檔共83頁；當(dāng)前第5頁；編輯于星期二\5點(diǎn)38分酸酸甜甜才是生活！本文檔共83頁；當(dāng)前第6頁；編輯于星期二\5點(diǎn)38分PartI:細(xì)胞拆分與重組概述1、細(xì)胞拆分技術(shù)的發(fā)展概況1952年Briggs

和King首創(chuàng)了核移植的方法1967年Careter發(fā)現(xiàn)細(xì)胞松馳素B能誘發(fā)體外培養(yǎng)的小鼠成纖維細(xì)胞的排核作用1972年P(guān)rescott等首先應(yīng)用離心結(jié)合CB分離哺乳類細(xì)胞的胞質(zhì)體獲得成功細(xì)胞核、質(zhì)分離技術(shù)與細(xì)胞融合技術(shù)匯合起來，建立了細(xì)胞重組技術(shù)本文檔共83頁；當(dāng)前第7頁；編輯于星期二\5點(diǎn)38分胞質(zhì)體（cytoplast）：除去細(xì)胞核后由膜包裹的無核細(xì)胞，由細(xì)胞松弛素B處理后，經(jīng)離心得到。核體（karyoplast）：由胞質(zhì)體分離出來的核，帶有少量胞質(zhì)并圍有質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)。胞質(zhì)雜種細(xì)胞：將胞質(zhì)體和另一完整細(xì)胞融合得到的細(xì)胞。核體雜種細(xì)胞：核體與另一完整細(xì)胞融合。重組細(xì)胞：核體與另一種細(xì)胞的胞質(zhì)體融合。本文檔共83頁；當(dāng)前第8頁；編輯于星期二\5點(diǎn)38分1、2、3親本細(xì)胞4、6核體5、7胞質(zhì)體8、9雜種細(xì)胞10重組細(xì)胞11胞質(zhì)雜種細(xì)胞ⅠPEG介導(dǎo)Ⅱ篩選本文檔共83頁；當(dāng)前第9頁；編輯于星期二\5點(diǎn)38分2、細(xì)胞拆合與重組的概念（1）細(xì)胞拆合:把完整細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核用特殊的方法 分離開來，或把細(xì)胞核從細(xì)胞質(zhì)中吸取出來， 或用紫外線等把細(xì)胞中的核殺死，然后再把 同種或異種的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)重新組織起來， 培育新的細(xì)胞或新的生物個(gè)體本文檔共83頁；當(dāng)前第10頁；編輯于星期二\5點(diǎn)38分（2）細(xì)胞重組（cellreconstruction)將細(xì)胞融合技術(shù)與細(xì)胞核質(zhì)分離技術(shù)結(jié)合，即在融合介子的誘導(dǎo)下，使胞質(zhì)體與完整細(xì)胞合并，或胞質(zhì)體與核體重新組成，構(gòu)成細(xì)胞的過程本文檔共83頁；當(dāng)前第11頁；編輯于星期二\5點(diǎn)38分3、細(xì)胞拆合的方法（1）物理拆合法用紫外線或激光將核破壞，再用微玻璃針或微吸管將其他細(xì)胞核注入（最早使用）將細(xì)胞融合技術(shù)與顯微外科手術(shù)結(jié)合，作微吸管 將細(xì)胞核連同周圍少量細(xì)胞質(zhì)吸出，再注入已去 核的細(xì)胞中本文檔共83頁；當(dāng)前第12頁；編輯于星期二\5點(diǎn)38分顯微操作法進(jìn)行細(xì)胞核移植本文檔共83頁；當(dāng)前第13頁；編輯于星期二\5點(diǎn)38分（2）化學(xué)拆合法☆細(xì)胞松馳素B

（CytochalasinB）結(jié)合高速離心☆CB阻斷細(xì)胞質(zhì)分裂，不干擾核分裂；引起細(xì)胞表面形狀的改變和排出細(xì)胞核。機(jī)理：CB是真菌的一種代謝產(chǎn)物，可以切斷微絲，并結(jié)合在微絲末端阻抑肌動蛋白聚合，但對解聚沒有明顯影響，因而可以破壞微絲的三維網(wǎng)絡(luò)！本文檔共83頁；當(dāng)前第14頁；編輯于星期二\5點(diǎn)38分第二部分細(xì)胞融合本文檔共83頁；當(dāng)前第15頁；編輯于星期二\5點(diǎn)38分幾個(gè)關(guān)鍵問題親本的來源融合方法融合細(xì)胞的篩選融合細(xì)胞的克隆融合細(xì)胞的鑒定本文檔共83頁；當(dāng)前第16頁；編輯于星期二\5點(diǎn)38分雜交1.通過不同的基因型的個(gè)體之間的交配而取得某些雙親基因重新組合的個(gè)體的方法。2.兩條單鏈DNA或RNA的堿基配對。雜交優(yōu)勢：兩個(gè)遺傳基礎(chǔ)不同的植物或動物進(jìn)行雜交，其雜交后代所表現(xiàn)出的各種性狀均優(yōu)于雜交雙親，比如抗逆性強(qiáng)、早熟高產(chǎn)、品質(zhì)優(yōu)良等。一般情況下，通過生殖細(xì)胞相互融合而達(dá)到這一目的過程稱為雜交。較多的是種間、種內(nèi)雜交。由體細(xì)胞相互融合達(dá)到這一結(jié)果的過程稱為體細(xì)胞雜交。本文檔共83頁；當(dāng)前第17頁；編輯于星期二\5點(diǎn)38分幾種細(xì)胞融合成功的例子融合生物種類細(xì)胞來源成功年代煙草兩個(gè)種間葉——葉甘藍(lán)——青菜葉——根大豆——馬唐草愈傷組織——葉矮牽?！埫婊ㄈ~——花瓣大麥——花生種子——種子大麥——大豆葉——懸浮細(xì)胞小麥——矮牽牛葉——花瓣玉米——大豆葉——懸浮細(xì)胞大豆——野碗豆懸浮細(xì)胞——懸浮細(xì)胞大麥——蠶豆葉——根大豆——草香木犀懸浮細(xì)胞——葉酵母菌——雞原生質(zhì)體——血紅細(xì)胞大豆——煙草懸浮細(xì)胞——葉人——胡蘿卜腹水癌細(xì)胞——原生質(zhì)體番茄——馬鈴薯葉——根尖人——小鼠纖維肉瘤細(xì)胞——畸胎瘤細(xì)胞

1972 1972 1972 19731974 1974 1974 1974 1974 1975 1976 1976 1976 1976 1978 1978本文檔共83頁；當(dāng)前第18頁；編輯于星期二\5點(diǎn)38分番茄+馬鈴薯本文檔共83頁；當(dāng)前第19頁；編輯于星期二\5點(diǎn)38分問題：有沒有可能培育出地下結(jié)土豆，地上結(jié)番茄的超級植物？1978年德國科學(xué)家梅歇爾斯將番茄與馬鈴薯進(jìn)行體細(xì)胞雜交育成薯番茄“泡馬豆”（po(tato)-(to)mato）。馬鈴薯與番茄兩種原生質(zhì)體的融合率竟高達(dá)40％～50％。本文檔共83頁；當(dāng)前第20頁；編輯于星期二\5點(diǎn)38分1978年德國科學(xué)家梅歇爾 斯等人把馬鈴薯(potato)和 番茄(tomato)的原生質(zhì)體 融合獲得了體細(xì)胞雜種

“泡馬豆”（pomato)

培育出的“泡馬豆”外型傾向于蕃茄，花葉果實(shí)具有雜種特點(diǎn)，遺憾的是地下部分沒有長出科學(xué)家們想象中的大土豆。TomatoesontheTopandPotatoesUnderground本文檔共83頁；當(dāng)前第21頁；編輯于星期二\5點(diǎn)38分視頻：植物體細(xì)胞雜交本文檔共83頁；當(dāng)前第22頁；編輯于星期二\5點(diǎn)38分部分野生品種的塊莖、果實(shí)雖不能食用，但它們的植株具有較強(qiáng)的抗病蟲害、抗鹽堿性和耐寒能力。因此，用野生馬鈴薯和番茄分別與馬鈴薯、番茄作物雜交，培育出了生 存能力較強(qiáng)的雜交系植物。雜交玉米等雜交植物比它們的親本 更為健壯，產(chǎn)量更高。雜交擬南芥（中間）比其親 本（左和右）要大《自然》（Nature）2008年11月23日：中美科學(xué)家近日研究發(fā)現(xiàn)雜交植物比其親本生長更大更好的原因：負(fù)責(zé)光合作用和淀粉代謝的基因更為活躍。本文檔共83頁；當(dāng)前第23頁；編輯于星期二\5點(diǎn)38分騾子：雄驢和雌馬交配所產(chǎn)的雜種叫驢騾。雌驢和雄馬交配所產(chǎn)的雜種叫馬騾。狼狗：狗與狼的雜交后代。雜交斑馬：由斑馬和馬科動物雜交產(chǎn)物獅虎：獅子和老虎的雜交產(chǎn)物。豹獅：美洲豹與獅子的后代。本文檔共83頁；當(dāng)前第24頁；編輯于星期二\5點(diǎn)38分不親和性不親和性：在有性生殖過程中，由于生物個(gè)體的細(xì)胞或組織水平上的不協(xié)調(diào)而使受精或接合不能正常進(jìn)行，或是受精后不能產(chǎn)生后代的現(xiàn)象。例如：生殖細(xì)胞不能融合，或受精卵不能發(fā)育，或子代無繁殖能力等。是雙親個(gè)體間基因型的不協(xié)調(diào)或是染色體組非同源性在生殖生理表型上的一種反映。不親和性是穩(wěn)定物種的重要機(jī)理之一。種間不親和性：異種、異屬生物個(gè)體之間的生殖不親和現(xiàn)象常由染色體組的不同所造成。一般地說，越是遠(yuǎn)緣則不親和性越高，直到完全不能受精。種內(nèi)不親和性：種內(nèi)個(gè)體間的不親和現(xiàn)象往往是受不親和基因所制約而并不是染色體組不同的結(jié)果。本文檔共83頁；當(dāng)前第25頁；編輯于星期二\5點(diǎn)38分遠(yuǎn)源雜交遠(yuǎn)緣雜交：不同種屬之間，或是地理上遠(yuǎn)緣的種內(nèi)亞種之間個(gè)體的交配稱為遠(yuǎn)緣雜交。由于種屬間存在著種種隔離機(jī)制，致使遠(yuǎn)緣雜交常表現(xiàn)不親和或獲得的遠(yuǎn)緣雜種表現(xiàn)不育。體細(xì)胞雜交是解決遠(yuǎn)源雜交不親和性的有力手段之一，更好地利用自然界基因資源，培育新物種。本文檔共83頁；當(dāng)前第26頁；編輯于星期二\5點(diǎn)38分本節(jié)主要內(nèi)容：1細(xì)胞融合2細(xì)胞雜交及其在育種中的應(yīng)用關(guān)鍵問題：細(xì)胞融合的原理、方法與關(guān)鍵環(huán)節(jié)本文檔共83頁；當(dāng)前第27頁；編輯于星期二\5點(diǎn)38分一定義與意義細(xì)胞融合（Cellfusion）是指使用人工方法使兩個(gè)或兩個(gè)以上的細(xì)胞合并形成一個(gè)細(xì)胞的技術(shù)。對于植物也叫“原生質(zhì)體融合”。親本細(xì)胞是體細(xì)胞，也叫“體細(xì)胞雜交（somaticcellhybridization）”。由于它不僅能產(chǎn)生同種細(xì)胞融合，也能產(chǎn)生種間細(xì)胞的融合，因此細(xì)胞融合技術(shù)在創(chuàng)造新細(xì)胞、培育新品種方面意義重大。本文檔共83頁；當(dāng)前第28頁；編輯于星期二\5點(diǎn)38分二細(xì)胞融合的分類1.材料：原生質(zhì)體（去除了細(xì)胞壁的裸露的細(xì)胞）、動物細(xì)胞2.從親本來源：（1）同核體（Homokaryon）：基因型相同的細(xì)胞融合成的融合細(xì)胞稱為。（2）異核體（Heterokaryon）：來自不同基因型的融合細(xì)胞。3.從融合效果：（1）對稱融合（Symmetricfusion）：兩個(gè)完整的細(xì)胞間的融合。（2）不對稱融合（Asymmetricfusion）：利用物理或化學(xué)方法使某親本的核或細(xì)胞質(zhì)失活后再與另外一個(gè)完整細(xì)胞進(jìn)行融合本文檔共83頁；當(dāng)前第29頁；編輯于星期二\5點(diǎn)38分本文檔共83頁；當(dāng)前第30頁；編輯于星期二\5點(diǎn)38分三發(fā)展歷史自發(fā)融合現(xiàn)象最初在動物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。1838年發(fā)現(xiàn)正常組織、發(fā)炎組織以及腫瘤組織中的多核細(xì)胞情況。動物體內(nèi)的破骨細(xì)胞也是自發(fā)融合形成的多核細(xì)胞。1962年日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)一種叫日本血凝性病毒(HVJ)能引起艾氏腹水瘤細(xì)胞融合成多核細(xì)胞的現(xiàn)象。20世紀(jì)70年代初，華裔加籍科學(xué)家高國楠發(fā)現(xiàn)聚乙二醇(PEG)能促使植物原生質(zhì)體融合，開拓了植物細(xì)胞融合的研究。20世紀(jì)80年代，齊默曼（Zimmerman）等建立電場誘導(dǎo)細(xì)胞融合方法。本文檔共83頁；當(dāng)前第31頁；編輯于星期二\5點(diǎn)38分

四細(xì)胞融合原理1細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)與功能細(xì)胞膜磷脂分子擾動出現(xiàn)通道——細(xì)胞橋本文檔共83頁；當(dāng)前第32頁；編輯于星期二\5點(diǎn)38分主要環(huán)節(jié)（1）親本選擇（單細(xì)胞或原生質(zhì)體制備）（2）兩原生質(zhì)體或細(xì)胞互相靠近，粘附（3）質(zhì)膜融合形成細(xì)胞橋P133圖7.4（4）胞質(zhì)滲透（5）細(xì)胞核融合（6）融合細(xì)胞篩選本文檔共83頁；當(dāng)前第33頁；編輯于星期二\5點(diǎn)38分原生質(zhì)體及其制備（1）定義：去除細(xì)胞壁后裸露的細(xì)胞稱之為原生質(zhì)體（protoplast）。（2）特點(diǎn)：無細(xì)胞壁，可以方便地進(jìn)行遺傳操作、人工誘變、細(xì)胞器轉(zhuǎn)移、細(xì)胞融合等操作。具有全能性，能再生細(xì)胞壁。本文檔共83頁；當(dāng)前第34頁；編輯于星期二\5點(diǎn)38分（3）制備與純化酶解法的建立1960年，英國科金第一次采用酶方法從番茄幼苗大量制備出原生質(zhì)體。使植物細(xì)胞融合技術(shù)得以建立。植物細(xì)胞的細(xì)胞壁主要成分是纖維素（纖維素微纖絲Cellulosemicrofibrils）、果膠（pectin）、多糖（glycan）。果膠酶、纖維素酶等處理植物組織，可以破壞胞間層和去掉細(xì)胞的纖維素外壁，得到游離的裸露原生質(zhì)體。本文檔共83頁；當(dāng)前第35頁；編輯于星期二\5點(diǎn)38分4分離分離方法飄浮法：常用的飄浮劑有蔗糖、Percoll、Ficoll等。離心法：低速離心，收集沉淀。結(jié)合法：先低速離心，再漂浮Percoll分層液:是經(jīng)過聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrolidone,PVP)處理的硅膠顆?；鞈乙?，對細(xì)胞無毒性和刺激性。

本文檔共83頁；當(dāng)前第36頁；編輯于星期二\5點(diǎn)38分關(guān)鍵：細(xì)胞核的融合若是沒發(fā)生細(xì)胞核的融合，僅發(fā)生了細(xì)胞質(zhì)的融合，則可能成為嵌合細(xì)胞。含有多個(gè)核的異核細(xì)胞合并后形成的單核細(xì)胞稱為合核細(xì)胞。細(xì)胞核的合并發(fā)生在有絲分裂過程中。但是這種有絲分裂只有當(dāng)兩個(gè)核的DNA合成基本同步時(shí)才能發(fā)生：兩個(gè)核同時(shí)進(jìn)行有絲分裂，形成一個(gè)紡錘體，全部染色體都排列在一個(gè)赤道板上，結(jié)果伴隨著細(xì)胞分裂就形成了單核的子細(xì)胞，其細(xì)胞核中含有雙親細(xì)胞的染色體。本文檔共83頁；當(dāng)前第37頁；編輯于星期二\5點(diǎn)38分五細(xì)胞融合方法1.生物法病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合：研究最早的細(xì)胞融合誘導(dǎo)方法。主要是由于病毒會與宿主細(xì)胞膜直接融合，同時(shí)進(jìn)入兩個(gè)細(xì)胞就會打破兩個(gè)細(xì)胞膜的隔閡，引發(fā)細(xì)胞質(zhì)的交流，進(jìn)而達(dá)到細(xì)胞融合的目的。原因可能是病毒的磷脂外衣與動物細(xì)胞膜相似，病毒外殼上的某些糖蛋白有促進(jìn)細(xì)胞融合的功能。仙臺病毒、皰疹病毒、牛痘病毒和副黏液病毒等。仙臺病毒（HAJ）是兩層磷脂組成的外膜包裹著RNA與蛋白質(zhì)的復(fù)合體。因HAJ病毒毒力弱，易被滅活而常采用。缺點(diǎn)：要提前大量培養(yǎng)病毒，并且滅活后才能作為融合劑使用，操作繁瑣，而且一旦滅活不充分的話，病毒還可能感染操作者與親本細(xì)胞。因此，目前已經(jīng)很少使用病毒誘導(dǎo)法進(jìn)行細(xì)胞融合。本文檔共83頁；當(dāng)前第38頁；編輯于星期二\5點(diǎn)38分原理與過程（1）足夠量的病毒顆粒附著在細(xì)胞膜上起搭橋作用，使細(xì)胞聚集在一起。（2）通過病毒與原生質(zhì)體或細(xì)胞膜的作用使兩個(gè)細(xì)胞膜間互相滲透，胞質(zhì)互相融合。粘結(jié)部位質(zhì)膜被破壞，不同細(xì)胞間形成通道，細(xì)胞質(zhì)流通并融合（病毒也隨之進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)）。（3）有絲分裂，細(xì)胞核融合，形成雜種細(xì)胞。本文檔共83頁；當(dāng)前第39頁；編輯于星期二\5點(diǎn)38分2化學(xué)法可以采用的化學(xué)誘導(dǎo)劑包括：NaNO3、高pH的高濃度Ca2+離子、聚乙二醇（PEG）、溶菌酶、明膠、抗體、植物凝血素伴刀豆球蛋白A等。細(xì)胞膜電荷平衡被打破。本文檔共83頁；當(dāng)前第40頁；編輯于星期二\5點(diǎn)38分（1）NaNO3誘導(dǎo)融合1909年，凱斯特（Kuster）發(fā)現(xiàn)機(jī)械分離的發(fā)生了質(zhì)壁分離的洋蔥表皮細(xì)胞原生質(zhì)體在NaNO3溶液中可以恢復(fù)并伴隨著細(xì)胞融合。1972年，卡爾森（Carlson）利用NaNO3誘導(dǎo)融合了粉蘭煙草和郎氏煙草原生質(zhì)體，培育出世界第一株體細(xì)胞雜種。NaNO3的鈉離子可以中和原生質(zhì)體表面負(fù)電荷，引起原生質(zhì)體聚集，促進(jìn)細(xì)胞融合。NaNO3對原生質(zhì)體無損害，但融合效率低，一般小于4%。本文檔共83頁；當(dāng)前第41頁；編輯于星期二\5點(diǎn)38分（2）高pH的高濃度Ca2+離子誘導(dǎo)融合1973年，凱勒（Keller）和梅爾切斯（Melchers）發(fā)現(xiàn)采用強(qiáng)堿性（例如pH10.5）的高濃度鈣離子溶液（50mmol/LCaCl2?2H2O）在37℃下處理兩個(gè)品系的煙草葉肉原生質(zhì)體，很容易促使融合，融合率可以達(dá)到10%。鈣離子中和原生質(zhì)體膜或細(xì)胞膜表面電荷，使彼此緊密接觸，決定質(zhì)膜的穩(wěn)定性和可塑性；高pH能改變質(zhì)膜的表面電荷，利于細(xì)胞融合。本文檔共83頁；當(dāng)前第42頁；編輯于星期二\5點(diǎn)38分（3）PEG誘導(dǎo)聚乙二醇(Polyethyleneglycol,PEG)是一種多聚化合物，分子式為H(OHCH2-CH2)nOH)。常用的PEG平均分子量在200－20,000之間，分子量1,000以下者為液體，1,000以上者為固體。PEG分子具有輕微的負(fù)極性，可以與具有正極性基團(tuán)的水分子、蛋白質(zhì)、碳水化合物形成氫鍵，在相鄰的原生質(zhì)體間起到分子橋的作用，使原生質(zhì)體接觸。當(dāng)PEG分子被洗脫時(shí)，膜電荷發(fā)生紊亂而重新分配。此時(shí)，一種原生質(zhì)體上帶正電的基團(tuán)可能與另外一個(gè)原生質(zhì)體中帶負(fù)電的基團(tuán)相連，導(dǎo)致原生質(zhì)體融合。本文檔共83頁；當(dāng)前第43頁；編輯于星期二\5點(diǎn)38分（4）高Ca2+和pH結(jié)合PEG誘導(dǎo)在高Ca2+和pH溶液的作用下，將與質(zhì)膜結(jié)合的PEG分子洗脫，將進(jìn)一步加劇電荷平衡失調(diào)，從而提高融合的幾率。因此，PEG結(jié)合高pH的高濃度Ca2+離子誘導(dǎo)融合方法成為一種較常用的細(xì)胞融合方法。優(yōu)點(diǎn)：基于PEG的誘導(dǎo)融合優(yōu)點(diǎn)是融合成本低，勿需特殊設(shè)備；融合子產(chǎn)生的異核率較高；融合過程不受物種限制。缺點(diǎn)：是融合過程繁瑣，PEG可能對細(xì)胞有毒害。本文檔共83頁；當(dāng)前第44頁；編輯于星期二\5點(diǎn)38分

細(xì)胞融合例子1甘藍(lán)與大白菜的化學(xué)誘導(dǎo)融合本文檔共83頁；當(dāng)前第45頁；編輯于星期二\5點(diǎn)38分本文檔共83頁；當(dāng)前第46頁；編輯于星期二\5點(diǎn)38分本文檔共83頁；當(dāng)前第47頁；編輯于星期二\5點(diǎn)38分本文檔共83頁；當(dāng)前第48頁；編輯于星期二\5點(diǎn)38分本文檔共83頁；當(dāng)前第49頁；編輯于星期二\5點(diǎn)38分實(shí)驗(yàn)方法舉例正交實(shí)驗(yàn)法:

正交實(shí)驗(yàn)法就是利用排列整齊的表-正交表來對試驗(yàn)進(jìn)行整體設(shè)計(jì)、綜合比較、統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)現(xiàn)通過少數(shù)的實(shí)驗(yàn)次數(shù)找到較好的生產(chǎn)條件，以達(dá)到最高生產(chǎn)工藝效果。正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)包括兩部分內(nèi)容：第一，是怎樣安排實(shí)驗(yàn)；第二，是怎樣分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。響應(yīng)面分析法:

是一種最優(yōu)化方法，它是將體系的響應(yīng)（如萃取化學(xué)中的萃取率）作為一個(gè)或多個(gè)因素（如萃取劑濃度、酸度等）的函數(shù)，運(yùn)用圖形技術(shù)將這種函數(shù)關(guān)系顯示出來，以供我們憑借直覺的觀察來選擇試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的最優(yōu)化條件．本文檔共83頁；當(dāng)前第50頁；編輯于星期二\5點(diǎn)38分3物理法電融合誘導(dǎo)法（Electrofusion）：利用電場來誘導(dǎo)細(xì)胞彼此連接成串，再施加瞬間強(qiáng)脈沖促使質(zhì)膜發(fā)生可逆性電擊穿，促進(jìn)細(xì)胞融合的技術(shù)。原理：在直流電脈沖的刺激下，細(xì)胞膜或原生質(zhì)體質(zhì)膜表面的電荷和氧化還原電位發(fā)生改變，使異種細(xì)胞或原生質(zhì)體粘合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂，進(jìn)而連接，直到閉和成完整的膜形成融合體。優(yōu)點(diǎn)：融合率高、重復(fù)性與可控制性強(qiáng)。缺點(diǎn)：可能會造成不可恢復(fù)的細(xì)胞損傷。本文檔共83頁；當(dāng)前第51頁；編輯于星期二\5點(diǎn)38分本文檔共83頁；當(dāng)前第52頁；編輯于星期二\5點(diǎn)38分棉花細(xì)胞電融合

BLS細(xì)胞融合儀（1）聚集：在直流電脈沖的誘導(dǎo)下，極化產(chǎn)生偶極子，彼此靠近，定向排列成串球狀。（2）細(xì)胞膜融合：在直流電脈沖的誘導(dǎo)下，原生質(zhì)體膜兩側(cè)產(chǎn)生電勢，正負(fù)電荷相吸，細(xì)胞膜變薄，觸發(fā)膜的穿孔（質(zhì)膜瞬間破裂）。（3）異核體：膜之間形成通道，細(xì)胞質(zhì)等得以交換、融合。（4）融合細(xì)胞：細(xì)胞核融合。本文檔共83頁；當(dāng)前第53頁；編輯于星期二\5點(diǎn)38分

細(xì)胞融合舉例2——薄荷的電誘導(dǎo)融合親本：E33、E47兩個(gè)薄荷親本原生質(zhì)體（5-9×105），0.7M山梨醇。儀器：Eppendorf電轉(zhuǎn)儀、融合杯（-250微升，-50微升）觀察：DAPI染色：4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚是一種常用的熒光染料，與DNA的雙鏈緊密結(jié)合。結(jié)合后產(chǎn)生的熒光基團(tuán)的吸收峰是358nm而散射峰是461nm，正好UV（紫外光）的激發(fā)波長正好是356nm。染色標(biāo)記細(xì)胞核的位置。參數(shù)：電壓：1.5-3V，超過2V破裂，選1.5V。脈沖電壓：0-300V。脈沖時(shí)間：30-60S，每次增加10S，40S最佳。本文檔共83頁；當(dāng)前第54頁；編輯于星期二\5點(diǎn)38分融合率達(dá)到16-27%，原生質(zhì)體存活率97%本文檔共83頁；當(dāng)前第55頁；編輯于星期二\5點(diǎn)38分融合細(xì)胞的篩選因融合的隨機(jī)性而成為細(xì)胞融合的關(guān)鍵而必需的技術(shù)本文檔共83頁；當(dāng)前第56頁；編輯于星期二\5點(diǎn)38分1篩選的原因與必要性細(xì)胞融合是一個(gè)隨機(jī)的物理過程，經(jīng)融合后細(xì)胞將以多種形式出現(xiàn)，需要通過培養(yǎng)和篩選，除去不需要的細(xì)胞，分離出需要的雜種細(xì)胞，從而解決融合細(xì)胞的選擇問題。問題：A與B融合過程中，你能預(yù)見有哪些形式的細(xì)胞嗎？A-B，A-A，B-B。A-A-A，B-B-B，A-A-B，B-B-A等多聚體。未融合的A，B。本文檔共83頁；當(dāng)前第57頁；編輯于星期二\5點(diǎn)38分2雜種細(xì)胞篩選方法（1）細(xì)胞形態(tài)大小差異（2）選擇性培養(yǎng)基篩選法：利用原生質(zhì)體對培養(yǎng)基成分要求與反應(yīng)的差異選擇雜種細(xì)胞的方法。例如：利用抗性標(biāo)記、酶缺陷型、激素需求差異等。親本原生質(zhì)體生長要求外源激素，而有的雜種細(xì)胞由于雙親互補(bǔ)作用會產(chǎn)生內(nèi)激素，從而使雜種細(xì)胞能在無激素的培養(yǎng)基上生長。（3）再生后雜種與親本形態(tài)、性質(zhì)差異本文檔共83頁；當(dāng)前第58頁；編輯于星期二\5點(diǎn)38分異硫氰酸熒光素（FITC）和 異硫氰酸羅丹明（RITC）分別發(fā)出綠色和紅色◆熒光染料法兩個(gè)親本原生質(zhì)體在融合前用能發(fā)不同顏色熒光的熒光染料進(jìn)行染色。細(xì)胞分類器辨別和收集發(fā)兩種熒光的異核體。但儀器價(jià)格昂貴，不常用。本文檔共83頁；當(dāng)前第59頁；編輯于星期二\5點(diǎn)38分本文檔共83頁；當(dāng)前第60頁；編輯于星期二\5點(diǎn)38分本文檔共83頁；當(dāng)前第61頁；編輯于星期二\5點(diǎn)38分