實驗細(xì)胞器分離

實驗細(xì)胞器分離第1頁，課件共11頁，創(chuàng)作于2023年2月[目的要求]

(1)初步掌握細(xì)胞器的分離原理及一般方法。(2)學(xué)習(xí)并掌握高速離心機(jī)和勻漿器的使用方法實驗二.細(xì)胞器的分離

第2頁，課件共11頁，創(chuàng)作于2023年2月[實驗原理]

細(xì)胞器的分離常通過組織細(xì)胞勻漿、分級分離和分析三個步驟完成。分級分離方法有兩種，即：差速離心法和密度梯度離心法。第3頁，課件共11頁，創(chuàng)作于2023年2月差速離心：采取逐漸提高離心速度的方法分離大小不同的細(xì)胞器。

被分離的分子越小，需要的離心速度越高。

大顆粒首先沉到管底較小顆粒沉降第4頁，課件共11頁，創(chuàng)作于2023年2月速度區(qū)帶分離法：預(yù)先裝入有一定密度梯度的材料（蔗糖或甘油），利用各種顆粒在梯度液中的沉降速度不同，使具有相同沉降速度的顆粒處于同一梯度層內(nèi)。注：待分離顆粒密度比介質(zhì)密度都要大：不能離心太久，否則兩種顆粒都會沉到底部第5頁，課件共11頁，創(chuàng)作于2023年2月[內(nèi)容與方法]內(nèi)容：

大鼠肝細(xì)胞細(xì)胞核及線粒體的分離第6頁，課件共11頁，創(chuàng)作于2023年2月方法：

(3)過濾：將組織勻漿完畢，用尼龍網(wǎng)過濾，每組取2ml的過濾液移入離心管中。(2)勻漿:

每組取適量剪碎組織，放入勻漿器中,加入3ml的0.25mol/L蔗糖溶液進(jìn)行勻漿。(1)取材：將饑餓24h的大白鼠處死。迅速取出肝組織浸入預(yù)冷的生理鹽水，洗去血污，濾紙吸干。在小燒杯中剪碎，用少量0.25mo1/L蔗糖液洗滌數(shù)次。第7頁，課件共11頁，創(chuàng)作于2023年2月(4)離心：

第一次:1000rpm,8min。(5)純化：在沉淀中加入0.34mo1/L蔗糖-0.5mmol/LMg(Ac)2至2ml，混懸。用長針頭注射器在混懸液下輕輕加入2ml

的0.88mo1/L蔗糖-0.5mmol/LMg(Ac)2溶液。盡量使兩種溶液明顯分層。

2000rpm離心15min。加0.25M蔗糖至4ml，混勻第二次:1300rpm,8min。棄上清上清保留于試管1.0處重復(fù)一次第8頁，課件共11頁，創(chuàng)作于2023年2月（7）鏡檢：觀察先用低倍鏡。再用高倍鏡

(6)細(xì)胞核鑒定：

。涂片,空氣干燥．浸入95％的乙醇溶液5min，晾干滴加甲基綠-派洛寧染液染色12min分色:快速放入丙酮中，記時90秒,用吸管吸水沖洗，擦干水分固定：染色：懸?。涸陔x心后的沉淀中加入幾滴PBS，混勻第9頁，課件共11頁，創(chuàng)作于2023年2月線粒體的分離將分離細(xì)胞核時收集的上清液以11400離心10分鐘,棄去上清,沉淀用預(yù)冷0.25mol/l的蔗糖溶液懸浮至離心管1.0處,11400g離心10min,去上清。鑒定:在干凈的載玻片中央,用牙簽挑取沉淀物均勻涂片.滴加1滴中性紅-詹母綠染液染色15min,蓋上蓋玻片,鏡檢.被染成亮綠色的即為線粒體.第10頁，課件共11頁，創(chuàng)作于2023年2月

[思考題]本次實