基因工程第一章酶

基因工程第一章酶第1頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月目的基因載體限制性?xún)?nèi)切酶限制性?xún)?nèi)切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連第2頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月DNA重組技術(shù)的基本工具分子手術(shù)刀—限制性?xún)?nèi)切酶分子縫合針—DNA連接酶

分子運(yùn)輸車(chē)—運(yùn)載體第3頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月工具酶

限制性核酸內(nèi)切酶

DNA聚合酶Ⅰ

逆轉(zhuǎn)錄酶

T4DNA連接酶堿性磷酸酶末端轉(zhuǎn)移酶

TaqDNA聚合酶第4頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月重組DNA技術(shù)中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個(gè)DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補(bǔ)3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無(wú)53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標(biāo)記等反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3′羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基第5頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一、限制性核酸內(nèi)切酶

(restrictionendonuclease)這類(lèi)酶又簡(jiǎn)稱(chēng)為限制性?xún)?nèi)切酶或限制酶識(shí)別DNA的特異序列,并在識(shí)別位點(diǎn)或其周?chē)懈铍p鏈DNA的一類(lèi)核酸內(nèi)切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ第6頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（一）限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)（二）限制性核酸內(nèi)切酶的分類(lèi)（三）II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性（四）限制性核酸內(nèi)切酶的命名（五）限制性核酸內(nèi)切酶的消化反應(yīng)第7頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（一）限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)限制性?xún)?nèi)切酶本是微生物細(xì)胞中用于專(zhuān)門(mén)水解外源ＤＮＡ的一類(lèi)酶，其功能是避免外源ＤＮＡ的干擾或噬菌體的感染，是細(xì)胞中的一種防御機(jī)制。寄主控制的限制（restriction）與修飾(modification)現(xiàn)象：人們發(fā)現(xiàn)侵染大腸桿菌的噬菌體都存在著一些功能性障礙。即所謂的寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象簡(jiǎn)稱(chēng)（R/M體系）。由寄主控制第8頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月R/M體系：寄主是由兩種酶活性配合完成的一種是修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶另一種是核酸內(nèi)切限制酶第9頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶當(dāng)λ(k)噬菌體侵染E.coliB時(shí)，由于其DNA中有EcoB核酸酶特異識(shí)別的堿基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中雖然也存在這種特異序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）將甲基轉(zhuǎn)移給限制酶識(shí)別序列的特定堿基，使之甲基化。EcoB核酸酶不能識(shí)別已甲基化的序列。第10頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月R/M體系的作用：類(lèi)似于免疫系統(tǒng)保護(hù)自身的DNA不受限制；破壞外源DNA使之迅速降解由于R/M現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)使得核酸內(nèi)切酶成為基因工程重要的工具酶。第11頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（二）限制性核酸內(nèi)切酶的分類(lèi)根據(jù)酶的功能、大小和反應(yīng)條件，及切割ＤＮＡ的特點(diǎn)，可以將限制性?xún)?nèi)切酶分為三類(lèi)：

Ⅰ型酶、Ⅱ型酶、Ⅲ型酶（基因工程技術(shù)中常用的是Ⅱ類(lèi)）第12頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月I類(lèi)能識(shí)別專(zhuān)一的核苷酸順序，并在識(shí)別點(diǎn)附近切割雙鏈，但切割序列沒(méi)有專(zhuān)一性。II類(lèi)識(shí)別位點(diǎn)（回文序列）嚴(yán)格專(zhuān)一，并在識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)將雙鏈切斷。

III類(lèi)識(shí)別位點(diǎn)嚴(yán)格專(zhuān)一（不是回文序列），但切點(diǎn)不專(zhuān)一，往往不在識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)部。因此在基因工程中具有實(shí)用價(jià)值的是II類(lèi)限制性?xún)?nèi)切酶。第13頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Ⅰ型酶：

1968年，M.Meselson和R.Yuan在E.coliB和E.coliK中分離出的核酸內(nèi)切酶。分子量較大，反應(yīng)需Mg++、S-腺苷酰-L-甲硫氨酸（SAM）、ATP等。這類(lèi)酶有特異的識(shí)別位點(diǎn)但沒(méi)有特異的切割位點(diǎn)，而且切割是隨機(jī)的，所以在基因工程中應(yīng)用不大。第14頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Ⅱ型酶

1970年，H.O.Smith和K.W.Wilcox在流感嗜血Rd株中分離出來(lái)的限制酶。分子量較?。?05Da），只有一種多肽，通常以同源二聚體的形式存在。反應(yīng)只需Mg++的存在，并且具有以下兩個(gè)特點(diǎn)，使這類(lèi)酶在基因工程研究中，得到廣泛的應(yīng)用。識(shí)別位點(diǎn)是一個(gè)回文對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)，并且切割位點(diǎn)也在這一回文對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)上。許多Ⅱ型酶切割ＤＮＡ后，可在ＤＮＡ上形成粘性末端，有利于ＤＮＡ片段的重組。

第15頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Ⅲ型酶

這類(lèi)酶可識(shí)別特定堿基順序，并在這一順序的3’端24~26bp處切開(kāi)ＤＮＡ，所以它的切割位點(diǎn)也是沒(méi)有特異性的。第16頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月限制性核酸內(nèi)切酶的類(lèi)型主要特性I型II型III型限制修飾多功能單功能雙功能蛋白結(jié)構(gòu)異源三聚體同源二聚體異源二聚體輔助因子ATPMg2+SAMATPMg2+SAMMg2+識(shí)別序列TGAN8TGCT旋轉(zhuǎn)對(duì)稱(chēng)序列GAGCCAACN6GTGCCAGCAG切割位點(diǎn)距識(shí)別序列1kb處識(shí)別序列內(nèi)或附近距識(shí)別序列下游隨機(jī)性切割特異性切割24-26bp處第17頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月a.限制酶識(shí)別靶序列同DNA的來(lái)源無(wú)關(guān)；第18頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（三）II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性a.識(shí)別位點(diǎn)的特異性識(shí)別靶序列是唯一的，通常是由4～8個(gè)核苷酸組成的特定序列（靶序列）。b.識(shí)別序列的對(duì)稱(chēng)性靶序列通常具有雙重旋轉(zhuǎn)對(duì)稱(chēng)的結(jié)構(gòu)，以中軸線雙側(cè)的DNA上堿基呈反向?qū)ΨQ(chēng)，重復(fù)排列切割序列呈典型的旋轉(zhuǎn)對(duì)稱(chēng)型回文結(jié)構(gòu)(palindrome)如：GAA

TTCCCCGGG

CTT

AAG

GGG

CCC第19頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月c.大部分酶的切割位點(diǎn)在識(shí)別序列內(nèi)部或兩側(cè)PstIProvindenciastuartii164

CTGCAGGACGTCHaemophilusinfluenzaeRd

第20頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月d.核酸內(nèi)切酶作用后的斷裂方式粘性末端：兩條鏈上的斷裂位置是交錯(cuò)地、但又是圍繞著一個(gè)對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)中心，這樣形式的斷裂結(jié)果形成具有粘性末端的DNA片斷。平末端兩條鏈上的斷裂位置是處在一個(gè)對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)的中心這樣形式的斷裂是形成具有平末端的DNA片斷。不易重新環(huán)化。

第21頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口

第22頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第23頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月EcoRI等產(chǎn)生的5‘粘性末端5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRI37℃5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’

退火4-7℃5‘…G-C-T-GA-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-AG-C-T-C…5’OHPOHP第24頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月同裂酶（isoschizomers)

指來(lái)源不同但識(shí)別相同靶序列的核酸內(nèi)切酶。同裂酶進(jìn)行同樣的切割，產(chǎn)生同樣的末端。但有些同裂酶對(duì)甲基化位點(diǎn)的敏感性不同。Example:限制酶HpaⅡ和MspⅠ是一對(duì)同裂酶(CCGG)，當(dāng)靶序列中一個(gè)5-甲基胞嘧啶時(shí)HpaⅡ不能進(jìn)行切割，而MspⅠ可以。第25頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月同尾酶（isocaudamer）指來(lái)源不同、識(shí)別靶序列不同但產(chǎn)生相同的粘性末端的核酸內(nèi)切酶。利用同尾酶可使切割位點(diǎn)的選擇余地更大。這兩個(gè)相同的粘性末端稱(chēng)為配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA第26頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月注意：由同尾酶產(chǎn)生的粘性末端序列很容易重新連接，但是兩種同尾酶消化產(chǎn)生的粘性末端重新連接形成的新片段將不能被該兩種酶的任一種所識(shí)別。第27頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫(xiě)；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫(xiě)；第四個(gè)字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。EcoRI:來(lái)自于Escheriacoli

RY13的第一個(gè)限制酶。（四）限制性核酸內(nèi)切酶的命名Hin

dⅢ

屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶第28頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（五）限制性核酸內(nèi)切酶的消化反應(yīng)一個(gè)限制酶單位（U）指：在理想的反應(yīng)條件（適宜的緩沖液和反應(yīng)溫度，通常為37℃）下，1h內(nèi)中完全降解1gDNA所需要的酶量。第29頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（一）酶切反應(yīng)的基本步驟＋－電泳紫外分析37℃1h加反應(yīng)液CKMBuffer(10X)2.0LddH2O

約16.5LDNA0.2~1.0gEnzyme1～2UVolume20.0L

1.0kb1.0kb0.4kb0.5kb0.6kbCKMTT第30頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月0-50mM低鹽酶100mM中鹽酶150mM高鹽酶II型核酸內(nèi)切酶的多酶聯(lián)合酶解：（2-1）對(duì)鹽濃度要求相同的酶，原則上可以同時(shí)酶切，但應(yīng)注意：（2-2）對(duì)鹽濃度要求不同的酶，可采取下列方法：第31頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月使用較貴的酶的鹽濃度，加大便宜酶的用量，同時(shí)酶解低鹽酶先切，然后補(bǔ)加鹽，高鹽酶再切一種酶先切，然后更換緩沖液，另一種酶再切第32頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（二）影響核酸內(nèi)切酶活性的因素：1.DNA的純度：

DNase的污染(Mg++)a.增加核酸內(nèi)切限制酶的用量，1mgDNA用10U酶

b.擴(kuò)大酶催化反應(yīng)的體系（稀釋?zhuān)?/p>

c.延長(zhǎng)酶催化反應(yīng)時(shí)間。加入亞精胺提高酶的消化作用，需適當(dāng)?shù)臏囟?。?3頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.DNA的甲基化程度大腸桿菌中的dam甲基化酶在5‘GATC3’序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影響的酶有BclI、MboI等，但BamHI、BglII、Sau3AI不受影響

第34頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3.酶切消化反應(yīng)的溫度：大多數(shù)酶的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)溫度37度。4.DNA的分子結(jié)構(gòu)：某些核酸內(nèi)切限制酶切割超螺旋的質(zhì)?；虿《綝NA所需要的酶量要比消化線性的DNA高29倍。第35頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

（三）核酸內(nèi)切限制酶標(biāo)準(zhǔn)的緩沖液1.氯化鎂、氯化鈉或氯化鉀：

不正確的NaCl或Mg++濃度，會(huì)降低限制酶的活性，還可能導(dǎo)致識(shí)別序列的改變。

2.Tris-HCl：

維持最適的pH值（pH＝7.4）。

3.β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇（DTT）：

維持酶的穩(wěn)定性。

4.牛血清蛋白（BSA）：維持酶的穩(wěn)定性。第36頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（四）核酸內(nèi)切限制酶對(duì)DNA的消化作用1.核酸內(nèi)切限制酶以同型二聚體形式與靶序列發(fā)生作用。2.核酸內(nèi)切限制酶對(duì)DNA的局部消化完全的酶切消化：識(shí)別序列n個(gè)堿基的核酸內(nèi)切限制酶，對(duì)DNA的切割能達(dá)到每隔4n切割一次的水平。局部酶切消化：不讓核酸內(nèi)切限制酶對(duì)大量的DNA消化完全，就可以獲得平均分子量大小有所增加的限制片斷產(chǎn)物，進(jìn)行不完全的限制酶消化反應(yīng)。

a.縮短酶切的消化反應(yīng)的保溫時(shí)間

b.降低反應(yīng)的溫度（37--4）結(jié)束酶的活性。第37頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3.核酸內(nèi)切限制酶對(duì)真核生物基因組的消化作用小分子量的片斷-----少（電泳-容易分離目的片斷）大分子量的片斷-----多（基因文庫(kù)）

第38頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月星號(hào)活性？第39頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月在“非最適的”反應(yīng)條件下,有些核酸內(nèi)切限制酶識(shí)別序列的特異性便會(huì)發(fā)生“松動(dòng)”，從其“正確”識(shí)別序列以外的其它位點(diǎn)切割DNA分子，這種現(xiàn)象叫星號(hào)活性。用*表示。

第40頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月ＤＮＡ連接酶（DNAligase）與分子的體外連接第41頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminaltransferase）該酶全稱(chēng)為末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase），它是從小牛胸腺中純化出來(lái)的一種小分子量的堿性蛋白質(zhì)，在二甲胂酸緩沖液中，能催化5’脫氧核苷三磷酸進(jìn)行5’－3’方向的聚合作用，逐個(gè)地將脫氧核苷酸分子加到線性DNA分子的3’-OH末端。它不需要模板，可以用含有的3’-OHＤＮＡ片段為引物，在3’-OH端加入核苷酸達(dá)幾百個(gè)。它作用的底物可以是具有3’-OH末端的單鏈DNA,也可以是具有3’-OH突出末端的雙鏈DNA第42頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第43頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

用途：

1.催化[α-32P]-3’-脫氧核苷酸標(biāo)記DNA片斷的3’

末端?？捎糜跍y(cè)序的終止，一位不含游離的3’-OH末端。

2.催化非放射性的標(biāo)記物摻入到DNA片斷的3’-末端：生物素等，摻入后可產(chǎn)生熒光染料或抗生物素蛋白結(jié)合物的接受位點(diǎn)。

3.用于在平頭ＤＮＡ上合成一段寡聚核苷酸，從而形成粘性末端。第44頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月堿性磷酸酶：來(lái)自于大腸桿菌（bacterialalkalinephosphataseBAP）或小牛腸（calfintestinalalkalinephosphataseCIP），該酶用于脫去DNA（RNA）5’末端的磷酸根，使5’-P成為5’-OH，該過(guò)程稱(chēng)核酸分子的脫磷酸作用。當(dāng)需要5’端同位素標(biāo)記或?yàn)榱吮苊釪NA片段自身連接（或環(huán)化）時(shí)可進(jìn)行脫磷酸反應(yīng)。第45頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月S1核酸酶：來(lái)自于稻谷曲霉，該酶只水解單鏈DNA，用于將粘性末端水解成平末端及cDNA發(fā)夾式結(jié)構(gòu)的處理。反轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）這類(lèi)酶來(lái)自于反轉(zhuǎn)錄病毒，它可以RNA為模板，催化合成ＤＮＡ。目前常用的有禽源（AMV）及鼠源（M-MLV）反轉(zhuǎn)錄酶兩種。第46頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月體外連接的三種方式：

1.用ＤＮＡ連接酶連接具有互補(bǔ)粘性末端的DNA片斷

2.用Ｔ４ＤＮＡ連接酶將平末端的DNA片斷連接；或是用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶給具平末端的DNA片斷加上poly(A)-poly(T)尾巴之后，再用ＤＮＡ連接酶連接。

3.先在DNA片斷末端加上化學(xué)合成的銜接物或接頭，形成粘性末端后，再用ＤＮＡ連接酶連接

第47頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月ＤＮＡ連接酶：能夠?qū)NA鏈上彼此相鄰的3’-羥基（OH）和5’-磷酸基團(tuán)（-P），在NAD+或ATP供能的作用下，形成磷酸二酯鍵。只能連接缺口（nick），不能連接裂口（gap）。而且被連接的DNA鏈必須是雙螺旋DNA分子的一部分。第48頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第49頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第50頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

酶－－AMP（腺苷－磷酸）磷酸酰胺鍵DNA的腺苷酸復(fù)合物3’-OH對(duì)P原子作親核攻擊形成磷酸二酯鍵連接酶的作用機(jī)理此反應(yīng)是由焦磷酸(ppi)的水解作用激發(fā)的需要花費(fèi)兩個(gè)高能磷酸鍵（賴(lài)氨酸殘基）第51頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

限制片斷的末端連接作用分子間的連接：不同的DNA片斷通過(guò)互補(bǔ)的粘性末端之間的堿基配對(duì)而彼此連接起來(lái)。分子內(nèi)的連接：由同一片斷的兩個(gè)互補(bǔ)末端之間的堿基配對(duì)而形成的環(huán)形分子。第52頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第53頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

連接酶的來(lái)源

1.DNA連接酶：大腸桿菌染色體編碼的

2.T4DNA連接酶：大腸桿菌T4噬菌體DNA編碼的

DNA連接酶－－NAD+T4DNA連接酶－－ATP第54頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Ｔ４ＤＮＡ連接酶（DNAligase）該酶常從Ｔ４噬菌體的受感細(xì)胞中提取，是由Ｔ４噬菌體基因組所編碼的，所以基因工程中常用的連接酶是Ｔ４連接酶。它可催化ＤＮＡ中磷酸二脂鍵的形成，從而使兩個(gè)片段以共價(jià)鍵的形式結(jié)合起來(lái)。

DNA連接酶對(duì)具有粘性末端的DNA分子經(jīng)退火后能很好地連接，對(duì)平末端的DNA分子也可以進(jìn)行連接，但連接效率較低，必須加大酶的用量。第55頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第56頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

影響連接酶作用的因素

1.反應(yīng)溫度：連接缺口的溫度：37度連接粘性末端的最佳溫度：4～15度

2.Ｔ４ＤＮＡ連接酶的用量：

平末端DNA分子的連接反應(yīng)中，最適1～2個(gè)單位。粘性末端DNA片斷之間的連接，酶濃度0.1個(gè)單位。

ATP的用量10μmol~1mmol/L之間

3.提高外源片斷與載體的濃度的比值，（10～20倍）第57頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

粘性末端DAN片斷的連接

由于具粘性末端的載體易發(fā)生自連。對(duì)載體的5’末端進(jìn)行處理，用細(xì)菌的或小牛腸的堿性磷酸酶移去磷酸基團(tuán)，使載體不能自連。而外源片斷的5’-P能與載體的3’-OH進(jìn)行共價(jià)鍵的連接。這樣形成的雜種分子中，每一個(gè)連接位點(diǎn)中載體DNA只有一條鏈與外源片斷相連，失去5’-P的鏈不能進(jìn)行連接，形成3’-OH和5’-OH的缺口。

第58頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第59頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

平末端DNA片斷的連接

1.T4DNA連接酶

2.用末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶給平末端加上同聚物尾巴之后，再用DNA連接酶連接。常用的連接方法：同聚物加尾法、銜接物法和接頭連接法第60頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

同聚物加尾法用5’

末端特異的核酸外切酶處理DNA片斷在A和B分別中加入dATP和dTTP同聚物尾巴10~40個(gè)堿基第61頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

同聚物加尾法或T4連接酶的平末端連接法，無(wú)法用原來(lái)的限制酶作特異性的切割，獲得插入片斷進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

第62頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月銜接物連接法

平末端的另一種處理方式是利用銜接物（linker）進(jìn)行處理，人工加上粘性末端。銜接物是一種人工合成的小分子DNA，約10~20個(gè)核苷酸，其結(jié)構(gòu)特征是含有多種限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)的回文結(jié)構(gòu)。如：

CCGGATCCGGGGCCTAGGCC

將銜接物分子與平末端DNA分子連接，再用限制性核酸內(nèi)切酶酶切，便可產(chǎn)生粘性末端。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是克隆位點(diǎn)具有限制酶的酶切位點(diǎn)。

HpaIIHpaIIBamHI或Sau3A第63頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

銜接物（linker）是指用化學(xué)方法合成的一段由10～12個(gè)核苷酸組成、具有一個(gè)或數(shù)個(gè)限制酶識(shí)別位點(diǎn)的平末端的雙鏈寡核苷酸短片段。雙銜接物：可以實(shí)現(xiàn)定向克隆，防止發(fā)生自連，同時(shí)對(duì)克隆片斷的再刪除也比較方便。第64頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月銜接物連接法第65頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月雙銜接物連接法的基本程序cDNA鏈的合成通過(guò)DNA聚合酶合成第二鏈加入SalI銜接物SI核酸酶作用后的末端單鏈突出序列，由Klenow補(bǔ)齊，加入第二銜接物EcolI第66頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

在用DNA銜接物連接法時(shí)，如果待克隆DNA的片斷或基因內(nèi)部，含有與所加銜接物相同的限制位點(diǎn)，在酶切消化銜接物產(chǎn)生粘性末端的同時(shí)，也會(huì)把克隆的基因切斷。第67頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月DNA接頭（adapter）連接法：

1978年，美國(guó)康奈爾大學(xué)生化分子生物學(xué)系的教授吳瑞博士發(fā)明的。它是一類(lèi)人工合成的一頭具有某種限制酶粘性末端另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片斷。粘性末端容易通過(guò)堿基配對(duì)形成如同銜接物一樣的二聚體分子。對(duì)DNA接頭分子末端，進(jìn)行必要的修飾。移走粘性末端5’-P，暴露出5’-OH，不能產(chǎn)生穩(wěn)定的二聚體分子。第68頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第69頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月DNA接頭連接法第70頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

熱穩(wěn)定的連接

從嗜熱高溫方線菌的菌株中分離出來(lái)的。能在高溫下催化兩條寡核苷酸探針發(fā)生連接用的一種核酸酶。寡核苷酸連接測(cè)定（oligonucletideligationassay,OLA）用兩個(gè)寡核苷酸探針，同已知序列的靶DNA雜交，探針在靶DNA分子的位置是相鄰的。連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（lingasechainreaction,LCR）；也叫連接擴(kuò)增反應(yīng)（lingaseamplicationreaction）用寡核苷酸探針通過(guò)DNA連接酶的作用擴(kuò)增已知序列的靶DNA的方法。需要4種引物，

第71頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月寡核苷酸連接測(cè)定

AGTGACCTTCACTGGA

AGTGACCTAGTTACCTTCACTGGATCACTGGA

AGTGACCTACCTAGTGACCTACCT

待擴(kuò)增的DNA片斷PPBBDD地高辛配基生物素磷酸BBBBDDPP陽(yáng)性信號(hào)無(wú)信號(hào)酶抗生素蛋白由于堿基錯(cuò)配不能形成磷酸二酯鍵檢測(cè)單堿基的取代、插入、及缺失而引起的多態(tài)性第72頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月LCR：ligasechainreaction，連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。樣品DNA、探針(4)94度變性第73頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月DNA聚合酶第74頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

常用的DNA聚合酶：

大腸桿菌DNA聚合酶、大腸桿菌DNA聚合酶Ｉ的Klenow大片斷酶、

T4DNA聚合酶、

T7DNA聚合酶、

反轉(zhuǎn)錄酶等。第75頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月共同點(diǎn)：

把脫氧核糖核苷酸連續(xù)的加到雙鏈DNA分子引物鏈的3’-OH末端，催化核苷酸的聚合作用，而不發(fā)生從引物模板上解離的情況。第76頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

大腸桿菌DNA聚合酶

DNA聚合酶Ｉ（PolＩ）、

DNA聚合酶（Pol）、

DNA聚合酶（Pol）、

PolＩ和Pol的主要功能參與DNA的合成；

Pol的功能同DNA的復(fù)制有關(guān)；

PolＩ同DNA分子克隆的關(guān)系最為密切。第77頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月大腸桿菌DNA聚合酶Ｉ：

1957年，美國(guó)的生物學(xué)家A.Kornberg首次證實(shí)，在大腸桿菌提取物中存在一種DNA聚合酶，即現(xiàn)在所說(shuō)的DNA聚合酶Ｉ。由polＩ基因編碼的一種單鏈多肽蛋白質(zhì)，分子量為1091000dal。

DNA聚合酶Ｉ，可以被蛋白酶切割成兩個(gè)片斷，一個(gè)具有全部的3’5’的外切酶活性和5’3’

的聚合酶活性，另一個(gè)具有全部

5’3’的外切酶活性。第78頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

DNA聚合酶Ｉ的酶活性：

1.5’3’的聚合酶活性；

2.5’3’的外切酶活性；

3.3’5’的外切酶活性（較低）。第79頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

DNA聚合酶Ｉ發(fā)揮作用的條件：

1、底物：四種脫氧核苷5’-三磷酸（dNTP）；

2、Mg＋＋離子；

3、帶有3’-OH游離基團(tuán)的引物鏈；

4、DNA模板：?jiǎn)捂?，雙鏈（糖-磷酸主鍵上有一個(gè)或多個(gè)斷裂）。

第80頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第81頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

DNA聚合酶Ｉ5’3’的核酸外切酶活性

1、5’3’的外切酶活性，所切割的DNA鏈必須是位于雙螺旋的區(qū)段上；

2、切割部位可以是末端磷酸二酯鍵，也可以是在距5’末端數(shù)個(gè)核苷酸遠(yuǎn)的一個(gè)鍵上發(fā)生；

3、DNA的合成可以增強(qiáng)5’3’的核酸外切酶活性；

4、5’3’核酸外切酶的活性位點(diǎn)同聚合作用的活性位點(diǎn)以及3’5’的水解作用位點(diǎn)是分開(kāi)的。第82頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

DNA聚合酶Ｉ的3’5’

核酸外切酶活性

能催化DNA鏈發(fā)生水解作用，從DNA鏈3’-OH末端開(kāi)始向5’的方向水解DNA，并釋放出單核苷酸分子。

對(duì)酶活的影響：

反應(yīng)物中缺乏dNTPs時(shí)，大腸桿菌DNA聚合酶Ｉ的3’5’核酸外切酶活性，將會(huì)發(fā)揮作用。但對(duì)于底物是雙鏈的DNA，在具有dNTPs時(shí)，這種降解活性將會(huì)被5’3’

的聚合酶活性所抑制。

第83頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

第84頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

DNA聚合酶在分子克隆中的主要用途：

通過(guò)DNA缺口轉(zhuǎn)移，制備供核酸分子雜交用的帶放射性標(biāo)記的DNA探針。

DNA缺口轉(zhuǎn)移（nicktranslation）在DNA分子的單鏈缺口上，DNA聚合酶Ｉ的5’3’核酸外切酶活性和聚合作用可以同時(shí)發(fā)生。當(dāng)外切酶活性從缺口的5’一側(cè)移去一個(gè)5’核苷酸之后，聚合酶作用就會(huì)在缺口的3’一側(cè)補(bǔ)上一個(gè)新的核苷酸，但polＩ不能在3’-OH和5’-P之間形成一個(gè)鍵，隨著5’一側(cè)的核苷酸不斷移去，3’一側(cè)的核苷酸又按序列增補(bǔ)，缺口便沿著DNA分子合成的方向移動(dòng)。

第85頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

DNA雜交探針的制備

典型的反應(yīng)體系是。在25μl總體積中含有1μg純化的特定DNA片斷，并加入適量的DnaseＩ、PolＩ、α-32p-dNTPs和未標(biāo)記的dNTPs。

DnaseＩ：造成DNA分子的斷裂或缺口；

PolＩ

：進(jìn)行缺口轉(zhuǎn)移，使反應(yīng)混合物中的32p標(biāo)記的核苷酸取代原有的未標(biāo)記的核苷酸，最終從頭到尾都被標(biāo)記。第86頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

dNTP對(duì)PolＩ酶活性的影響

在低濃度dNTPs的條件下，PolＩ具有良好的活性，提高dNTPs濃度時(shí)，PolＩ則能夠更有效的合成DNA。低濃度的32p-dNTPs（2μmol/L）和高濃度的dNTPs（20μmol/L）一般希望有30%左右的32p-dNTPs參入DNA鏈（DnaseＩ數(shù)量）。

第87頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

Klenow片斷與DNA末端標(biāo)記

1、Klenow片斷：是由大腸桿菌DNA聚合酶經(jīng)枯草桿菌蛋白酶的處理之后，產(chǎn)生出來(lái)的分子量為761000dal的大片斷分子。仍具有5’3’的聚合酶活性和3’5’

的外切酶活性，失去了全酶的5’3’

外切酶活性。

第88頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Klenow片斷的主要用途：

1、修補(bǔ)經(jīng)限制酶消化的DNA所形成的3’隱蔽末端；

2、標(biāo)記DNA片斷的末端；

3、cDNA克隆的第二鏈cDNA的合成；

4、DNA序列的測(cè)定。第89頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

DNA片斷末端標(biāo)記：

具有3’隱蔽末端的帶標(biāo)記得的DNA片斷

5’GATCT…3’3’A…5’在反應(yīng)物中加入Klenow聚合酶α-32p-dGTP,一道溫育后生成：

5’GATCT…3’3’

32pGA…5’

或是同時(shí)加入α-32p-dATP＋dGTP5’GATCT…3’3’32pAGA…5’第90頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

DNA片斷末端標(biāo)記可以作為用凝膠電泳法測(cè)定分子大小的標(biāo)記樣品。因?yàn)楸粯?biāo)記的DNA片斷是同它們的摩爾濃度成比例，而與他們的分子大小無(wú)關(guān)。所以在限制酶消化過(guò)程產(chǎn)生的大小DNA片斷都得到了同等程度的標(biāo)記。不能夠有效的標(biāo)記帶有5’突出末端的DNA分子。第91頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

T4DNA聚合酶和取代合成法標(biāo)記DNA片斷

1、從T4噬菌體感染的大腸桿菌培養(yǎng)物中純化出的一種特殊的DNA聚合酶。具有5’3’的聚合酶活性和3’5’

的外切酶活性