保元湯物質(zhì)基準(zhǔn)uplc-pda指紋圖譜的建立及成分指認(rèn)

保元湯物質(zhì)基準(zhǔn)uplc-pda指紋圖譜的建立及成分指認(rèn)

寶元湯是著名的古代經(jīng)典方劑目錄（第一批）。保元湯的現(xiàn)代研究目前僅涉及到藥理研究和臨床應(yīng)用方面，化學(xué)成分研究很少，對(duì)其指紋圖譜研究至今未見(jiàn)報(bào)道?；诖?，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用現(xiàn)代工藝進(jìn)行保元湯物質(zhì)基準(zhǔn)的制備，通過(guò)色譜技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)對(duì)各成分進(jìn)行分離鑒定研究。利用UPLC-PDA技術(shù)建立了保元湯物質(zhì)基準(zhǔn)的指紋圖譜，并通過(guò)UPLC-ESI-MS/MS進(jìn)一步對(duì)共有峰進(jìn)行研究，指認(rèn)了22個(gè)共有峰，可為保元湯質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定及成藥的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。1藥材來(lái)源及熱價(jià)ACQUITYUPLCH-Class型超高效液相色譜儀和VionIMSQTOF型離子淌度分析高分辨質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters公司），Quintix125D-1CN型1/1萬(wàn)電子分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）。甘草酸銨，人參皂苷Rg保元湯處方藥材均采自道地產(chǎn)區(qū)，采集批次均超過(guò)25批，經(jīng)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所陳士林研究員鑒定，人參為五加科植物人參Panaxginseng的干燥根和根莖，黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceusvar.mongholicus的干燥根，甘草為豆科植物甘草Glycyrrhizauralensis的干燥根和根莖，肉桂為樟科植物肉桂Cinnamomumcassia的干燥樹(shù)皮，生姜為姜科植物姜Zingiberofficinale的新鮮根莖，按照2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》（簡(jiǎn)稱(chēng)《中國(guó)藥典》）要求炮制加工，制成飲片，經(jīng)鑒甄檢測(cè)技術(shù)（上海）有限公司按2015年版《中國(guó)藥典》要求全檢，各挑選15批合格飲片，各藥材產(chǎn)地與批號(hào)信息詳見(jiàn)表1。將各批飲片隨機(jī)組合，根據(jù)《古代經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑及其物質(zhì)基準(zhǔn)申報(bào)資料要求（征求意見(jiàn)稿）》2方法和結(jié)果2.1條件1以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，ACQUITYUPLCBEHShieldC2.2標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備分別取人參皂苷Rb2.3保元湯基準(zhǔn)凍干粉的制備保元湯物質(zhì)基準(zhǔn)的制備方法參照《古代經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑及其物質(zhì)基準(zhǔn)申報(bào)資料要求（征求意見(jiàn)稿）》，根據(jù)明代一錢(qián)=3.73g和一分=0.373g折算，確定處方為人參3.73g，黃芪7.46g，甘草1.86g，肉桂0.75g，生姜1片按3g折算。分別按表2中組合稱(chēng)取4倍處方量飲片，放入煎藥壺中，浸泡30min，一煎加水800mL，煎煮60min，二煎加水760mL，煎煮40min，減壓濃縮后進(jìn)行冷凍干燥，即得保元湯物質(zhì)基準(zhǔn)凍干粉，批號(hào)分別記為BYT01～BYT15。分別取BYT01～BYT15凍干粉約0.2g，精密稱(chēng)定，置15mL量瓶中，加50%甲醇超聲處理（功率250W，頻率40kHz)30min，放冷，加50%甲醇定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。2.4耐試驗(yàn)2.4.1酸水溶液洗脫系統(tǒng)分別考察了甲醇-水、甲醇-甲酸水溶液、乙腈-甲酸水溶液、甲酸乙腈混合液-甲酸水溶液等洗脫系統(tǒng)，結(jié)果表明甲酸乙腈混合液-甲酸水溶液系統(tǒng)的分離效果較好，進(jìn)一步考察了甲酸乙腈混合液-甲酸水系統(tǒng)中甲酸的比例，最終確定以0.05%甲酸水溶液為流動(dòng)相A,0.05%甲酸乙腈溶液為流動(dòng)相B進(jìn)行梯度洗脫的效果較好。2.4.2樣品溶液的制備方法分別考察了3種不同型號(hào)C2.4.4柱溫的確定分別在20,30,40℃不同柱溫條件下考察柱溫對(duì)分離條件的影響，結(jié)果表明不同柱溫條件下色譜圖整體變化較小，說(shuō)明柱溫影響不顯著，擬采用柱溫30℃。2.5方法研究2.5.1儀器精密度試驗(yàn)取批號(hào)BYT01的保元湯物質(zhì)基準(zhǔn)，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果顯示各共有峰在2個(gè)波長(zhǎng)條件下保留時(shí)間的RSD均≤1.0%，峰面積的RSD均≤2.0%，表明儀器精密度良好。2.5.2重復(fù)性試驗(yàn)取批號(hào)BYT01的保元湯物質(zhì)基準(zhǔn)6份，按照2.3項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果顯示各共有峰在2個(gè)波長(zhǎng)條件下保留時(shí)間的RSD均≤1.0%，峰面積的RSD均≤5.0%，說(shuō)明該方法重復(fù)性良好。2.5.3溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一批次保元湯物質(zhì)基準(zhǔn)，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于配制后0,2,8,10,16,24h按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果顯示各共有峰在2個(gè)波長(zhǎng)條件下保留時(shí)間的RSD均≤1.0%，峰面積的RSD均≤3.0%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。2.6指紋譜的構(gòu)建2.6.1指紋圖譜的制備按2.3項(xiàng)下方法制備15批保元湯物質(zhì)基準(zhǔn)供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，以峰面積占總峰面積0.1%進(jìn)行積分，分別將203nm和260nm處得到的色譜圖導(dǎo)入“中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2012版），采用中位數(shù)法進(jìn)行指紋圖譜分析，得15批保元湯物質(zhì)基準(zhǔn)的指紋圖譜，見(jiàn)圖1,2；同時(shí)，生成對(duì)照指紋圖譜，見(jiàn)圖3,4。2.6.2指紋圖譜的相似度采用“中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2012版）軟件分別對(duì)保元湯物質(zhì)基準(zhǔn)在203nm和260nm處的UPLC圖譜進(jìn)行相似度分析，結(jié)果顯示15批物質(zhì)基準(zhǔn)與對(duì)照指紋圖譜的相似度均>0.90，樣品BYD01～BYT15在203nm處的相似度分別為0.955,0.970,0.986,0.963,0.926,0.963,0.960,0.968,0.951,0.949,0.972,0.979,0.954,0.983,0.961；在260nm處的相似度分別為0.979,0.996,0.963,0.969,0.974,0.967,0.978,0.994,0.962,0.964,0.989,0.988,0.977,0.975,0.976。2.7總峰splc-esims/ms分析2.7.1備方法色譜條件（進(jìn)樣量除外）和對(duì)照品溶液、供試品溶液制備方法同2.1～2.3。質(zhì)譜條件為sensitivity模式，低能通道碰撞電壓4eV，高能通道碰撞電壓25～45eV，采用全信息串聯(lián)質(zhì)譜（MS2.7.2成分指認(rèn)，確定藥材成分總離子流色譜圖見(jiàn)圖5，采用數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)分析進(jìn)行成分指認(rèn)，結(jié)果指認(rèn)了22個(gè)成分，均來(lái)源于人參、黃芪、甘草、生姜4味藥材。以峰6,5,16為例進(jìn)行裂解途徑解析，6號(hào)峰的相對(duì)分子質(zhì)量418，與甘草苷相同，查閱文獻(xiàn)3指紋圖譜的選擇《簡(jiǎn)明醫(yī)彀》中保元湯煎煮方式僅記載“水煎服”，但在該書(shū)卷一要言煎丸服法中載：“煎藥大法：每劑水二鐘，煎八分。渣用水鐘半，煎七分……”，后世醫(yī)書(shū)如《醫(yī)宗金鑒》保元湯物質(zhì)基準(zhǔn)的化學(xué)成分較復(fù)雜，但主要為皂苷類(lèi)物質(zhì)，本研究采用二極管陣列檢測(cè)器，分別對(duì)300,260,237,203nm等不同波長(zhǎng)條件下指紋圖譜進(jìn)行了綜合分析，發(fā)現(xiàn)單一波長(zhǎng)下很難對(duì)物質(zhì)基準(zhǔn)中整體化學(xué)成分同時(shí)表征，其中260nm處指紋圖譜信息最豐富，但人參皂苷類(lèi)成分在該波長(zhǎng)下檢測(cè)信號(hào)較弱，考慮到人參在保元湯處方中為君藥，應(yīng)盡量將其標(biāo)志性成分在指紋圖譜中體現(xiàn)，經(jīng)分析，203nm波長(zhǎng)條件下人參皂苷類(lèi)成分檢測(cè)信號(hào)最強(qiáng)，故本研究同時(shí)采集了203nm和260nm的指紋圖譜。本研究考察了大量不同類(lèi)型流動(dòng)相組成對(duì)色譜圖分離效果的影響：(1)由于203nm波長(zhǎng)下很多流動(dòng)相具有末端吸收，故選擇末端吸收較小的乙腈本研究采用UPLC-PDA雙波長(zhǎng)同時(shí)檢測(cè)方法系統(tǒng)研究了保元湯物質(zhì)基準(zhǔn)指紋圖譜，該方法精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性良好，15批物質(zhì)基準(zhǔn)與對(duì)照指紋圖譜的相似度均>0.90，通過(guò)質(zhì)譜解析指認(rèn)了22個(gè)共有峰，這22個(gè)成分來(lái)自4味藥材（人參、黃芪、甘草、生姜），說(shuō)明該方法表征了保元湯組分的整體特征，可為經(jīng)