離心技術(shù)和物質(zhì)代謝實驗

離心技術(shù)和物質(zhì)代謝實驗離心技術(shù)和物質(zhì)代謝實驗第1頁離心技術(shù)概念：依據(jù)物質(zhì)沉降系數(shù)、質(zhì)量、浮力原因等不一樣，應(yīng)用離心力使物質(zhì)分離、濃縮、提純方法。應(yīng)用：分離、提純、判別生物高分子；分離線粒體、染色體、微粒體、溶酶體等亞細胞物質(zhì)。離心技術(shù)和物質(zhì)代謝實驗第2頁基礎(chǔ)原理

F：粒子在離心場中所受離心力

a：粒子旋轉(zhuǎn)加速度

m：沉降粒子有效質(zhì)量

ω：粒子旋轉(zhuǎn)角速度

r：粒子旋轉(zhuǎn)半徑(cm)，離心力F=離心技術(shù)和物質(zhì)代謝實驗第3頁

RCF(relative

centrifugal

force)：相對離心力

rpm(revolutionsperminute)

：每分鐘轉(zhuǎn)速

低速離心時常以轉(zhuǎn)速“rpm”來表示

高速離心時則以“g”表示

相對離心力

離心力相對于重力倍數(shù)，單位是g離心技術(shù)和物質(zhì)代謝實驗第4頁沉降系數(shù)（S）:超速離心時，顆粒在離心場中沉降速度用沉降系數(shù)來表示，即物質(zhì)在單位離心力場下沉降速度。單位：Svedberg，1S=10-13s是是物質(zhì)特有物理常數(shù)，可間接反應(yīng)分子量大小。離心分離技術(shù)基礎(chǔ)理論數(shù)據(jù)，與物質(zhì)大小、形狀、密度及介質(zhì)密度、粘度都相關(guān)，經(jīng)過對離心力和離心介質(zhì)選擇，即可分離純化出不一樣質(zhì)量大小和物理形狀物質(zhì)。

離心技術(shù)和物質(zhì)代謝實驗第5頁另外，對一些生物高分子或亞細胞器組分化學結(jié)構(gòu)、分子量尚不了解時，可用沉降系數(shù)對其物理特征進行初步描述，將其區(qū)分開來，如原核生物核蛋白體RNA（rRNA）分為5S、16S、23S，即是依據(jù)其在離心場中行為來進行分類。離心技術(shù)和物質(zhì)代謝實驗第6頁

離心機類型和主要結(jié)構(gòu)

類型

工業(yè)用離心機離心機制備性離心機

試驗用離心機分析性離心機

普通離心機：<6000rpm

高速離心機：6000～0rpm

超速離心機：≥0rpm制備性離心機離心技術(shù)和物質(zhì)代謝實驗第7頁主要結(jié)構(gòu)

轉(zhuǎn)頭，離心管和管帽，制冷系統(tǒng)，真空系統(tǒng)，制動裝置，指示表盤離心技術(shù)和物質(zhì)代謝實驗第8頁轉(zhuǎn)頭

1．角式轉(zhuǎn)頭

離心技術(shù)和物質(zhì)代謝實驗第9頁

2．蕩平式轉(zhuǎn)頭：這種轉(zhuǎn)頭是由吊著4或6個自由活動吊桶(離心套管)組成。

3．區(qū)帶轉(zhuǎn)頭：區(qū)帶轉(zhuǎn)頭無離心管，主要由一個轉(zhuǎn)子桶和可旋開頂蓋組成。

4．垂直轉(zhuǎn)頭：其離心管是垂直放置。

5．連續(xù)流動轉(zhuǎn)頭：轉(zhuǎn)頭與區(qū)帶轉(zhuǎn)頭類似，由轉(zhuǎn)子桶和有入口和出口轉(zhuǎn)頭蓋及從屬裝置組成。

最大額定轉(zhuǎn)速——一定使用程度，使用一定次數(shù)或一定時間后遞減10%。

離心技術(shù)和物質(zhì)代謝實驗第10頁離心管

不銹鋼和塑料離心管，管帽預(yù)防樣品溢出。

離心技術(shù)和物質(zhì)代謝實驗第11頁離心操作注意事項使用各種離心機時，必須事先在天平上精密地平衡離心管和其內(nèi)容物，轉(zhuǎn)頭中絕對不能裝載單數(shù)管子，當轉(zhuǎn)頭只是個別裝載時，管子必須相互對稱地放在轉(zhuǎn)頭中，方便使負載均勻地分布在轉(zhuǎn)頭周圍。

每個轉(zhuǎn)頭各有其最高允許轉(zhuǎn)速和使用累計期限，使用轉(zhuǎn)頭時要查閱說明書，不得過速使用。離心技術(shù)和物質(zhì)代謝實驗第12頁裝載溶液時，要依據(jù)各種離心機詳細操作說明進行，依據(jù)待離心液體性質(zhì)及體積選取適合離心管，有離心管無蓋，液體不得裝得過多，以防離心時甩出，造成轉(zhuǎn)頭不平衡、生銹或被腐蝕;而制備性超速離心機離心管，則經(jīng)常要求必須將液體裝滿，以免離心時塑料離心管上部凹陷變形。若要在低于室溫溫度下離心時。轉(zhuǎn)頭在使用前應(yīng)放置在冰箱或置于離心機轉(zhuǎn)頭室內(nèi)預(yù)冷。離心過程中不得隨意離開離心技術(shù)和物質(zhì)代謝實驗第13頁物質(zhì)代謝試驗

試驗二十一、糖酵解中間產(chǎn)物判定血清膽固醇測定血清甘油三酯測定試驗二十、鄰甲苯胺法測血糖含量離心技術(shù)和物質(zhì)代謝實驗第14頁試驗二十一、糖酵解中間產(chǎn)物判定

【試驗?zāi)繕恕?/p>

檢測糖酵解中間產(chǎn)物磷酸丙糖生成。

【試驗原理】離心技術(shù)和物質(zhì)代謝實驗第15頁糖酵解反應(yīng)過程見下列圖：離心技術(shù)和物質(zhì)代謝實驗第16頁將酵母液（含有葡萄糖及糖酵解全部酶）在一定介質(zhì)中（適宜pH，必要金屬離子等）進行保溫，在酵母液中酶體系作用下，酵母液中原來含有糖就進行酵解反應(yīng)，當反應(yīng)進行到生成二分子磷酸丙糖，深入改變是在3－磷酸甘油醛脫氫酶催化下進行，－SH為3－磷酸甘油醛脫氫酶必需基團，加入一碘醋酸可與此酶－SH起反應(yīng)，從而使酶失去活性，酵解反應(yīng)就停留在磷酸丙糖階段。酶-SH+ICH2COOH→酶S-CH2COOH+HI離心技術(shù)和物質(zhì)代謝實驗第17頁然后以硫酸肼為穩(wěn)定劑，保護磷酸丙糖不致自發(fā)分解，使其不能向其它方向改變，結(jié)果磷酸丙糖在反應(yīng)體系中堆積，從而與2，4－二硝基苯肼反應(yīng)生成對應(yīng)苯腙，后者在堿性溶液中溶解呈紫紅色，可借此判定丙糖之生成。離心技術(shù)和物質(zhì)代謝實驗第18頁離心技術(shù)和物質(zhì)代謝實驗第19頁【試驗方法】取試管3支，編號，按下表進行操作．統(tǒng)計三管所發(fā)生情況，并加以簡明分析．CCL3COOH作用：強酸，使糖酵解全部酶失活。一碘醋酸作用：使3－磷酸甘油醛脫氫酶失活。硫酸肼作用：穩(wěn)定磷酸丙糖，使其不向其它方向轉(zhuǎn)變。離心技術(shù)和物質(zhì)代謝實驗第20頁試劑（ml）123pH7.4磷酸鹽緩沖液一碘醋酸硫酸肼10％CCL3COOH酵母液水2.0

0.5

0.51.04.0－2.00.50.5－4.01.02.0－－－4.02.0混勻，在37℃－38℃恒溫水浴中保溫30分鐘一碘醋酸硫酸肼10％CCL3COOH

水－－－2.0

－－1.01.0

0.50.51.0－混勻，靜置10分鐘，離心,3000轉(zhuǎn)/min,10分鐘，再取三支試管，對號按下表操作上清液1mol/LNaOH

0.50.50.5

0.50.50.5混勻，在室溫放置10分鐘2，4－二硝基苯肼1mol/LNaOH0.53.50.53.50.53.5離心技術(shù)和物質(zhì)代謝實驗第21頁試驗注意事項：成腙反應(yīng)前，溶液必須先堿化并在室溫放置10min，目標是使磷酸丙糖中磷酸基水解脫去，生成顏色比較穩(wěn)定；一碘醋酸和三氯乙酸是酶抑制劑，使用移液管后必須徹底清洗移液管，不然易造成試驗失敗。離心技術(shù)和物質(zhì)代謝實驗第22頁血清膽固醇測定（酶法）【試驗?zāi)繕恕?/p>

1.了解膽固醇氧化酶法測定血清膽固醇原理。

2.掌握血清膽固醇測定臨床意義。離心技術(shù)和物質(zhì)代謝實驗第23頁

血清中總膽固醇包含膽固醇酯(CE,70%)和游離型膽固醇(FC,30%)。膽固醇酯酶（CEH）先將膽固醇酯水解為膽固醇和游離脂肪酸（FFA），膽固醇在膽固醇氧化酶（COD）作用下氧化生成Δ-4--膽甾烯酮和過氧化氫。后者經(jīng)過氧化物酶（POD）催化與4-氨基安替比林（4-AAP）和酚反應(yīng)，生成紅色醌亞胺，其顏色深淺與膽固醇含量呈正比，在500nm波優(yōu)點測定吸光度，與標準管比較可計算出血清膽固醇含量。反應(yīng)式以下：【試驗原理】離心技術(shù)和物質(zhì)代謝實驗第24頁1.標本：不溶血血清或血漿標本。血漿用肝素鈉、EDTA抗凝，不可用草酸鹽、氟化物。2.取試管3支，編號，按下表操作?！驹囼灧椒ā考尤胛铮╱l）測定管標準管空白管血清10--膽固醇標準液-10-蒸餾水--10酶應(yīng)用液100010001000離心技術(shù)和物質(zhì)代謝實驗第25頁【計算】ΔA標本

CHO（mmol/L）=——————×標準液濃度

ΔA標準

【標準液】

膽固醇5.17mmol/L（200mg/dL）

【正常參考范圍】3.10～5.70mmol/L

混勻后，37℃水浴保溫15分鐘，在500nm波優(yōu)點比色，以空白管調(diào)零，讀取各管吸光度。

離心技術(shù)和物質(zhì)代謝實驗第26頁血清甘油三酯測定（酶法）【試驗?zāi)繕恕?、了解酶法定量測定血清甘油三酯基礎(chǔ)原理。

2、掌握酶法定量測定血清甘油三酯試驗方法。離心技術(shù)和物質(zhì)代謝實驗第27頁

血清中甘油三酯經(jīng)脂肪酶水解為甘油和脂肪酸，甘油在甘油激酶（GK）及ATP存在下，生成3-磷酸甘油，爾后，在磷酸甘油氧化酶（GPO）作用氧化成磷酸二羥丙酮并生成過氧化氫，過氧化氫與底物4-氨基安替比林和ESPAS在過氧化物酶（POD）作用下，生成紅色亞醌化合物，其顏色深淺與甘油三酯含量成正比。在500nm波優(yōu)點測定吸光度，與標準管比較可計算出血清甘油三酯含量。反應(yīng)式以下：

甘油三酯+4H2O

脂蛋白脂酶甘油+脂肪酸甘油+ATP

甘油激酶/Mg2+

甘油-3-磷酸+ADP

甘油-3-磷酸+O2

甘油-3-磷酸氧化酶磷酸二羥丙酮+H2O22H2O2+ESPAS+4-氨基安替比林過氧化物酶紅色醌亞胺色素+4H2O【試驗原理】離心技術(shù)和物質(zhì)代謝實驗第28頁1.標本：不溶血血清或血漿標本。血漿用肝素鈉、EDTA抗凝，不可用草酸鹽、氟化物。2.取試管3支，編號，按下表操作。【試驗方法】加入物（ul）測定管標準管空白管血清10--甘油三酯標準液-10-蒸餾水--10酶應(yīng)用液100010001000離心技術(shù)和物質(zhì)代謝實驗第29頁【計算】

ΔA標本甘油三酯（mmol/L）=——————×標準液濃度

ΔA標準【標準液】

甘油三酯2.26mmol/L【正常參考范圍】0.56～1.71mmol/L

混勻后，37℃水浴保溫15分鐘，在500nm波優(yōu)點比色，以空白管調(diào)零，讀取各管吸光度。

離心技術(shù)和物質(zhì)代謝實驗第30頁

葡萄糖在濃酸溶液中（加在含有硼酸冰醋溶液中），水浴加熱至100℃左右，脫水生成羥甲基呋喃甲醛（或稱羥甲基糠醛），后者能與鄰甲苯胺縮合生成藍綠色化合物，依據(jù)顏色深淺并進行630nm波長比色測定其含量。

試驗二十、鄰甲苯胺法測血糖含量【試驗?zāi)繕恕空莆锗徏妆桨贩y定血糖原理及方法【試驗原理】離心技術(shù)和物質(zhì)代謝