感染wssv的克氏原螯蝦腸道菌群多樣性分析

感染wssv的克氏原螯蝦腸道菌群多樣性分析

科克斯坦通常被稱為小龍蝦。在分類上，它屬于自然界、動(dòng)物、動(dòng)物、甲殼類、甲殼類、甲殼類、甲殼類、甲殼類、甲殼類、甲殼類、甲殼類、甲殼類、甲殼類、甲基海盜和前錨海盜。1918年，由美國(guó)引進(jìn)日本，1929年又由日本傳入我國(guó)腸道菌群與宿主營(yíng)養(yǎng)、免疫息息相關(guān)1材料和方法1.1試驗(yàn)材料試驗(yàn)用克氏原螯蝦（體質(zhì)量（25±5)g/只）由潛江龍居灣稻蝦共生專業(yè)合作社提供，試驗(yàn)前經(jīng)過1周的池塘水室內(nèi)暫養(yǎng)，暫養(yǎng)水溫24℃左右。1.2人工感染試驗(yàn)蝦經(jīng)饑餓處理1周后，隨機(jī)分為2組，每組各20只。感染組自第4步足基部注射經(jīng)PBS溶液稀釋的WSSV病毒懸液100μL，含1×101.3無(wú)線傳感器的定量檢測(cè)以靶向于WSSV聚合酶的特異性引物WDP06/071.4腸道微生物16srd的pcr檢測(cè)使用CTAB方法提取克氏原螯蝦后腸的總基因組DNA，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其濃度和純度。用無(wú)菌水將DNA稀釋至1ng/μL用于后續(xù)腸道微生物的16SrDNA的擴(kuò)增。使用16Sv3-v4引物341F-806R1.51分辨率測(cè)量與數(shù)據(jù)分析腸道細(xì)菌16SrDNA擴(kuò)增產(chǎn)物建庫(kù)按照諾禾致源公司流程和方法，PCR產(chǎn)物經(jīng)過純化后制備文庫(kù)，測(cè)序使用IonS52結(jié)果與分析2.1臨床表現(xiàn)及變化試驗(yàn)用克氏原螯蝦感染前無(wú)明顯臨床病癥。WSSV感染組于第3天開始表現(xiàn)活力降低、副肢無(wú)力、對(duì)外界刺激反應(yīng)弱等典型病癥，并于第5天開始出現(xiàn)死亡，對(duì)照組試驗(yàn)期間無(wú)明顯變化。定量PCR結(jié)果（圖1）顯示感染組血淋巴的病毒載量均升高至102.2ue0103多樣性指數(shù)pet分析如圖2所示，感染組與對(duì)照組共同擁有的OTU291個(gè)，感染組特有OTU161個(gè)，對(duì)照組特有OTU75個(gè)。Chao1、ACE、Shannon和Simpson4個(gè)αue011多樣性指數(shù)感染組均略高于對(duì)照組，但沒有顯著性差異（表1）。Beta多樣性分析顯示感染組和對(duì)照組無(wú)顯著性差異（數(shù)據(jù)略）。這些結(jié)果說明WSSV感染對(duì)克氏原螯蝦腸道菌群豐度和多樣性幾乎沒有影響。2.3蝦腸道優(yōu)勢(shì)菌種及物種組成檢測(cè)在對(duì)照組與WSSV感染組的克氏原螯蝦腸道菌群共發(fā)現(xiàn)17個(gè)門類，包括變形菌門（Proteobacteria）、軟壁菌門（Tenericute）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、梭桿菌門（Fusobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、藍(lán)藻門（Cyanobacteria）和奇古菌門（Thaumarchaeota）等。選取每個(gè)樣本或分組在門類水平上最大豐度排名前10的物種，生成物種相對(duì)豐度柱形累加圖，如圖3所示。結(jié)果顯示對(duì)照組優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門（占75.42%）和軟壁菌門（占19.17%），感染組腸道優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門（占78.14%）和擬桿菌門（占17.38%。）在屬的水平上，共檢測(cè)到207個(gè)細(xì)菌種屬，其中對(duì)照組的克氏原螯蝦腸道優(yōu)勢(shì)菌為寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）占53.01%、希瓦氏菌屬（Shewanella）占19.57%、Candidatusbacilloplasma占18.52%。WSSV感染組蝦腸道優(yōu)勢(shì)菌屬為寡養(yǎng)單胞菌屬占63.23%、希瓦氏菌屬占7.68%、擬桿菌屬（Bacteroides）占2.78%（圖4）。雖然正常和患病的蝦腸道優(yōu)勢(shì)菌屬均為寡養(yǎng)單胞菌，但患病蝦腸道中擬桿菌屬豐度顯著上升，希瓦氏菌屬及Candidatusbacilloplasma顯著降低。如圖5所示，2組中其他差異顯著的細(xì)菌分別有氣單胞菌屬（Aeromonas）、Haliangium、Chryseolinea、鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium），這些結(jié)果說明WSSV感染使克氏原螯蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。2.4顯著性菌群的確定為進(jìn)一步分析與WSSV感染相關(guān)的克氏原螯蝦腸道菌群，用LEfSe分析法對(duì)對(duì)照組和WSSV人工感染組腸道菌群相對(duì)豐度進(jìn)行比較分析，以找出顯著性變化的相關(guān)菌群。如圖6A所示，經(jīng)過線性判別分析（LDA），發(fā)現(xiàn)對(duì)照組與WSSV感染組的菌群共有3個(gè)具有顯著差異的菌群，隸屬于2個(gè)菌門。其中對(duì)照組只有1個(gè)菌屬（Candidatusbacilloplasma），隸屬于軟壁菌門，且具有較大豐度。感染組的2個(gè)菌群隸屬于擬桿菌門的擬桿菌科（Bacteroidaceae）和黃桿菌科（Flavobacteria），它們的親緣關(guān)系如圖6B所示。3wssv感染克氏原螯蝦腸道微生物本研究通過人工感染人為增加克氏原螯蝦體內(nèi)WSSV的病毒載量，模擬養(yǎng)殖過程克氏原螯蝦白斑病發(fā)病歷程，評(píng)價(jià)WSSV感染對(duì)腸道菌群的影響，發(fā)現(xiàn)WSSV感染導(dǎo)致克氏原螯蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。盡管試驗(yàn)用蝦人工感染前檢測(cè)出少量的WSSV基因組DNA，但并未呈現(xiàn)明顯臨床病癥，僅為攜帶狀態(tài)。流行病學(xué)調(diào)查顯示，養(yǎng)殖小龍蝦攜帶WSSV較為普遍克氏原螯蝦等甲殼動(dòng)物腸道棲息著大量的微生物，這些微生物是與宿主長(zhǎng)期共同進(jìn)化的結(jié)果優(yōu)勢(shì)菌群分析顯示，變形菌門是對(duì)克氏原螯蝦腸道中占比最大的菌門，其同時(shí)也是多種水產(chǎn)動(dòng)物如大黃魚、中華絨螯蟹、凡納濱對(duì)蝦等腸道中的優(yōu)勢(shì)菌群WSSV感染后，我們檢測(cè)到克氏原螯蝦后腸中黃桿菌（Flavobacterium）、氣單胞菌屬（Aeromonas）等潛在病原菌的出現(xiàn)和顯著上調(diào)。盡管這些病原菌危害魚類的報(bào)道較多，如柱狀黃桿菌，危害各種淡水魚