第07章 蛋白質(zhì)的分離、純化和表征

南昌大學生命科學院李思光

生物化學網(wǎng)絡(luò)教程蛋白質(zhì)的分離、純化和表征章節(jié)目錄一、蛋白的酸堿性質(zhì)二、蛋白質(zhì)分子的大小與形狀三、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)的沉淀四、蛋白質(zhì)分離純化的一般原則五、蛋白質(zhì)的分離純化方法蛋白質(zhì)分子由氨基酸組成，在蛋白質(zhì)分子中保留著游離的末端α-氨基和α-羧基以及側(cè)鏈上的各種功能團。因此蛋白質(zhì)的化學和物理化學性質(zhì)有些是氨基酸相同的，例如，側(cè)鏈上功能團的化學反應，分子的兩性電解質(zhì)等。蛋白質(zhì)和游離氨基酸中相應基團的pKa值不完全相同天然球狀蛋白質(zhì)的可解離基團大多數(shù)可被滴定，某些天然蛋白質(zhì)有一些可解離基團由于埋藏在分子內(nèi)部或參與氫鍵形成而不能被滴定蛋白質(zhì)的等離子點：在沒有其他鹽類干擾時，蛋白質(zhì)質(zhì)子供體基團解離出來的質(zhì)子數(shù)與質(zhì)子受體基團結(jié)合的質(zhì)子數(shù)相等時的pH一、蛋白的酸堿性質(zhì)蛋白質(zhì)是一類兩性電解質(zhì)，能和酸或堿發(fā)生作用。蛋白質(zhì)的等電點：蛋白質(zhì)所帶正電荷與負電荷恰好相等時的pH。蛋白質(zhì)的滴定曲線形狀和等電點，在有中性鹽存在下可以發(fā)生明顯變化（一）根據(jù)化學組成測定最低相對分子質(zhì)量（二）滲透壓法測定相對分子質(zhì)量（三）蛋白質(zhì)的擴散和擴散系數(shù)（四）沉降分析法測定相對分子質(zhì)量（五）凝膠過濾法測定相對分子質(zhì)量（六）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定相對分子質(zhì)量RTMr=———lim—πcc→0Mr=————RTsD（1-vρ）-二、蛋白質(zhì)分子的大小與形狀（一）蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)溶液是一種分散系統(tǒng)。蛋白質(zhì)溶液由于具有水化層與雙電層兩方面的穩(wěn)定因素，所以作為膠體系統(tǒng)是相當穩(wěn)定的。蛋白質(zhì)溶液也和一般的膠體系統(tǒng)一樣具有丁達爾效應、布郎運動以及不能通過半透膜等性質(zhì)。（二）蛋白質(zhì)的沉淀鹽析法使蛋白質(zhì)脫去水化層有機溶劑沉淀法使蛋白質(zhì)脫去水化層、降低介電常數(shù)重金屬鹽沉淀法pH大于pI時，蛋白質(zhì)顆粒帶負電荷，容易與重金屬離子結(jié)合成不溶性鹽而沉淀。生物堿試劑和某些酸類沉淀法pH小于pI時，蛋白質(zhì)顆粒帶正電荷，容易生物堿試劑和酸類的酸根負離子發(fā)生反應生成不溶性鹽而沉淀。加熱變性沉淀法三、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)的沉淀

前處理

粗分級分離

細分級分離（一）分離純化某一特定蛋白質(zhì)的一般程序動物組織和細胞：電動搗碎機或勻漿器破碎、或超聲波破碎植物組織和細胞：石英砂或玻璃粉研磨、或纖維素酶處理細菌：超聲波震蕩、與砂研磨、高壓擠壓或溶菌酶處理鹽析、等電點沉淀和有機溶劑分級分離等方法有些蛋白質(zhì)提取液體積較大，可采用超過濾、凝膠過濾、冷凍真空干燥進行濃縮凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析、親和層析必要時，還可選擇電泳法，包括區(qū)帶電泳、等電聚焦結(jié)晶四、蛋白質(zhì)分離純化的一般原則（一）根據(jù)分子大小不同的純化方法（二）利用溶解度差別的純化方法（三）根據(jù)電荷不同的純化方法（四）利用選擇性吸附的純化方法（五）利用對配體的特異生物學親和力的純化方法（六）高效液相層析和快速蛋白質(zhì)液相層析透析和超過濾、密度梯度離心、凝膠過濾等電點沉淀和pH控制、有機溶劑