香港海鷗菌實驗室診斷技術研究

香港海鷗菌實驗室診斷技術研究

香港海膽細菌是2001年首次發(fā)現(xiàn)并命名為香港海膽細菌的食源性病原體。該菌株于2001年在香港分離并被稱為香港海膽菌。香港海鷗菌可引起社區(qū)性腸胃炎和旅行者腹瀉,臨床表現(xiàn)與沙門菌和空腸彎曲菌引起的病征相似,大部分病人出現(xiàn)水樣腹瀉2009年1-12月對肇慶市零售市場、超市的草魚、鳙魚、鯉魚、鯽魚等淡水魚及胃腸炎腹瀉患者進行香港海鷗菌的檢測,目前在4種淡水魚中分離到11株香港海鷗菌;在胃腸炎腹瀉患者中分離到1株香港海鷗菌。根據(jù)文獻報道及香港海鷗菌的生化特性,本實驗簡化了香港海鷗菌的檢測程序,選用氧化酶、觸酶及三糖鐵(TSI)三項做篩選試驗,再用PCR進行確診,旨在建立本實驗室香港海鷗菌的篩選與確診試驗的診斷技術。1材料和方法1.1材料表面1.1.1魚類樣品的采集淡水魚類標本分別采自肇慶市水產(chǎn)品零售市場、超市,共計92份,包括草魚、鳙魚、鯉魚、鯽魚,按照無菌采樣原則,采集新捕撈的魚類,置于塑料袋中加水充氧后4~8h內(nèi)檢驗。人體糞樣標本共計211份,采自肇慶市第一人民醫(yī)院胃腸炎的腹瀉患者,用采樣管中的采樣棉簽,無菌操作條件下采集新鮮糞便后置采樣管的Cary-Blair中,于當天送檢驗室檢驗。1.1.2麥康凱瓊的制備改良頭孢哌酮MacConkey瓊脂(CMA)使用北京陸橋技術有限責任公司的干粉配制麥康凱瓊脂,臨用時加熱融化瓊脂,加入1%葡萄糖和32mg/L的頭孢哌酮(cefoperazone),混合后傾注平板備用。生化鑒定管、氧化酶試購自北京陸橋技術有限責任公司;GNI1.2方法1.2.1棉施工法采集sde和aa平板魚類樣本體表用75%酒精棉球消毒,無菌條件下用剪刀打開腹腔,取出完整的動物腸道,分別剪斷動物的中腸和后腸,將棉拭子插入腸道,旋轉一圈,采集內(nèi)容物。采樣后的棉拭子直接涂布CMA平板,每個樣本涂布2塊平板;病人的標本同樣也直接涂布2塊平板。上述平板均置37℃培養(yǎng)48h。1.2.2生物化學從CMA培養(yǎng)基上挑取無色、透明、扁平、直徑在0.5~1.0mm之間的微小菌落進行染色鏡檢,凡為G1.2.2.普通型菌株的篩選挑取可疑菌落穿刺TSI,37℃培養(yǎng)24h后,TSI反應陰性(仍保持原來顏色)的菌株,再接種精氨酸雙水解酶、脲酶生化管及普通瓊脂平板,37℃培養(yǎng)24h后,精氨酸雙水解酶和脲酶均為陽性的菌株,挑取其普通瓊脂平板上的單個菌落進行氧化酶及觸酶試驗,兩項結果都是陽性的菌株,則用VitekGNI1.2.2.香港海鷗菌的篩選挑取可疑菌落進行氧化酶及觸酶試驗,兩項結果都是陽性的則挑取該菌落穿刺TSI,37℃培養(yǎng)24h后,凡TSI反應陰性的菌株,均符合篩選標準,再進行PCR鑒定,經(jīng)特異性引物PCR檢測為陽性的菌株,即可判定為香港海鷗菌菌株。1.2.3pcr對分離菌的鑒定1.2.3.特異性pcr引物設計經(jīng)GenBank比對確定香港海鷗菌16SrRNA高保守區(qū),應用Primer5.0軟件設計特異性PCR鑒定引物,上游序列為:5’-GGCTCAACCTGGGAACTGC-3’,下游序列為:5’-CACCAGAAACCGAAATCTCCAA-3’,擴增片段長度為239bp。用于測序用的16SrRNA的通用引物參考文獻1.2.3.模板模板的制備用接種環(huán)挑取生化篩選試驗符合的菌落若干,于100μl無菌蒸餾水中制備懸液,振蕩混勻,水浴煮沸10min,然后冰浴2~5min,10000轉/min離心5min,取上清液作為模板。以香港海鷗菌肇慶株LHZQ001模板DNA為陽性對照,并以去離子水為陰性對照。1.2.3.3rc反應系統(tǒng)制劑按照試劑盒推薦的參數(shù)配制,反應體積為50μl,10×PCR緩沖液5μl,25mmol/LMgCl1.2.416srna基因搜索取特異性引物PCR陽性的菌株進行16SrRNA基因擴增,方法參照文獻2結果2.1香港海鷗菌的分離和鑒定共采集4類淡水魚,共計92條,分離到香港海鷗菌11株,陽性率為11.96%。其中草魚51條,分離到香港海鷗菌9株,陽性率為17.65%;鳙魚16條,分離到香港海鷗菌1株,陽性率為6.25%;鯉魚24條,分離到香港海鷗菌1株,陽性率為4.17%;鯽魚1條,未分離到香港海鷗菌。2.2未檢出細菌多樣性共采集胃腸炎腹瀉患者的糞便標本211份,分離到香港海鷗菌1株,陽性率為0.48%,該例患者未檢出沙門菌、志賀氏菌和副溶血性弧菌。其主要的臨床癥狀為黃色水樣便,腹瀉6次/d,不發(fā)熱,有陣發(fā)性腹痛,無嘔吐,無里急后重,臨床使用喹諾酮類藥物治療有效,服藥后2d內(nèi)停止腹瀉。2.3生化反應結果常規(guī)生化和篩選生化鑒定均從相同編號的魚類、人體標本中分離到12株香港海鷗菌,兩種方法的符合率為100%,而且這12株香港海鷗菌的生化反應結果均與香港株HKU1相符合,具有革蘭氏染色陰性、尿素酶和精氨酸雙水解酶陽性、鳥氨酸脫羧酶和賴氨酸脫羧酶陰性、不能利用枸檬酸鹽、不發(fā)酵葡萄糖、不溶血、動力活躍等特征。從該12株菌株中選取草魚分離株LHZQ1,與香港海鷗菌香港株HKU1、肇慶株LHZQ001進行生化特征比較,具體結果見表1。2.4特異性pcr檢測結果對氧化酶、觸酶與TSI3項生化試驗均符合篩選標準的菌株進行特異性PCR檢測,共計12株,其中魚類株11株,人類株1株,結果均為陽性,電泳結果見圖1。2.5srrna的序列用ABI3730測序儀對12株分離的香港海鷗菌的16SrRNA進行雙向序列測定,去掉重疊區(qū)域和引物區(qū),得到的16SrRNA的序列長度在707~946bp之間。將所測序列和GenBank中發(fā)布的香港海鷗菌HKU1株進行同源性比較,12株細菌中,有3株DNA序列與香港海鷗菌HKU1株完全同源,有5株與HKU1株僅相差1個堿基,還有4株與HKU1株有2個堿基的差異,同源性達99.5%~100%。3香港海鷗菌的檢測目前香港海鷗菌已成為廣東淡水魚輸往香港的必檢致病菌之一本研究結果顯示,肇慶市淡水魚香港海鷗菌檢出率為11.96%,高于廣東省的6.76%檢測發(fā)現(xiàn),當前測定香港海鷗菌的方法存在著需經(jīng)全面生化試驗后才能排除或確認等缺陷,整個過程繁瑣、耗時、費力,不利于快速檢測細菌16SrRNA具有高度的保守性,而且具有多拷貝、多信息、長度適中的特點,因此可以作為鑒定細菌菌屬的黃金法則綜上所述,為更好地開展淡水魚產(chǎn)品中香港海鷗菌的污染監(jiān)測,以利于真實地評估香港海鷗菌對食品安全的潛在危險