實驗報告 蛋白質分子的測定

PAGEPAGE1實驗一蛋白質分子的測定─凝膠層析法實驗原理凝膠層析法（即凝膠過濾法，gelfiltration）是利用凝膠把分子大小不同的物質分離開的一種方法。將凝膠顆粒在適宜溶劑中浸泡，使充分吸液膨脹，然后裝入層析柱中，加入欲分離的混合物，再以同一溶劑洗脫，在洗脫過程中大分子不能進入凝膠內部而沿凝膠顆粒間的空隙最先流出柱外，小分子可以進入凝膠內部，流蘇緩慢，一直最后流出柱外，從而使樣品中分子大小不同的物質得以分離。凝膠是由膠體溶液凝結而成的固體物質，不論是天然凝膠還是人工合成凝膠，其內部都具有很微細的多空網狀結構。凝膠層析法常用的天然凝膠是瓊脂糖凝膠（Sepharose），人工合成的凝膠是聚丙烯酰胺凝膠（Bio-gel-P）和葡聚糖凝膠（SephadexG）。其中葡聚糖凝膠是具有不同孔隙度的立體網狀結構的凝膠，不溶于水。將凝膠裝柱后，柱床體積稱為“總體積”，以Vt表示。Vt由Vo，Vi與Vg三部分組成，即Vt=Vi+Vg+Vo。Vo為“孔隙體積”、“外水體積”，即存在于柱床內凝膠顆粒外面空隙之間的水相體積；Vi為內體積，即凝膠顆粒內部所含水相的體積；Vg為凝膠本身體積；Ve為洗脫體積，即自加入樣品時算起到組分最大濃度（峰）出現時所流出的體積，Ve與Vo及Vi之間的關系為：Ve=Vo+KdVi，；Kd為樣品組分在二相間的分配系數，Kd=(Ve-Vo)/Vi，有效分配系數為Kav，Kav=(Ve-Vo)/(Vt-Vo)。在一般情況下，凝膠對組分沒有吸附作用時，當流動相流過Vt體積后，所有的組分都應該被洗出來，這一點為凝膠層析的特點，與一般層析方法不同。Ve與分子量的關系：對同一類型的化合物，洗脫特性與組分的分子量有關，流過凝膠柱時，按分子量大小順序流出，分子量大的走在前面。Ve與分子量的關系為：Ve=K1-K2logM，K1與K2為常數，M為分子量，通常用Kav代替Ve，建立標準蛋白質分子式量LgM與Kav的標準曲線，稱為“選擇曲線”。在允許的工作范圍內，曲線越陡，則分級越好，而工作坊為越窄。凝佼層析主要決定于溶質分子的大小，每一類型的化合物，如球蛋白類，右旋糖酐類等都有它自己的特殊的選擇曲線，可用以測定未知物的Mr，測定時以使用曲線的直線部分為宜。試劑材料[試劑]1、標準蛋白質：藍色葡聚糖（分子式量200000），牛血清蛋白（分子式量67000），胃蛋白酶（分子式量36000），CytC(分子式量13700)。2、洗脫液：0.2mol/LTris-HCl-KCl，pH7.53、SephadexG-75。[器材]1、層析柱：柱管1.0×40cm。2、紫外分光光度計。3、部分收集器。4、刻度試管。實驗步驟[1]凝膠裝柱：先將洗脫液緩慢導入柱管內，然后將處理好的凝膠溶液加入層析管中。等到凝膠層膠面快接觸到管頂端時，將洗脫管接好，洗脫30分鐘，直到凝膠柱穩(wěn)定。[2]調試液滴速度：將洗脫液速度調節(jié)至每分鐘17滴，將時間定在3.0分鐘自動調換試管，為加樣收集洗脫液做準備。[3]加樣：當液滴速度穩(wěn)定在17滴每分鐘之后，將層析管打開，用膠頭滴管吸走多余的洗脫液。此時將藍色葡聚糖沿管壁加入凝膠層，同時用夾子夾住洗脫液出口，當葡聚糖加完之后，松開夾子，記錄藍色葡聚糖達到層析管低端的時間，此時收集的洗脫液體積即為Vo，Vo=Ve=1\*ROMANI。此時用夾子夾住洗脫液出口，重復上述步驟，添加牛血清蛋白質。按照上述方法將4種標準蛋白質樣本依次加入層析管中層析。需要注意的是，需記錄每次加樣的試管號，以便計算各種物質的洗脫液體積，以后每加一種蛋白質的時間都要比上一種蛋白質添加時間間隔長；用分光光度計測定各試管洗脫液吸光度值，標出各個峰值，第二次加樣到第二個峰值出現的各試管洗脫液的體積即為Ve=2\*ROMANII，第三次加樣到第三個峰值出現的各試管洗脫液的體積即為Ve=3\*ROMANIII,第四次加樣到第三個峰值出現的各試管洗脫液的體積即為Ve=4\*ROMANIV。[4]記錄上述試驗各部實驗數據，建立有效分配系數Kav和洗脫液Ve標準曲線。實驗結果實驗過程中，記錄實驗試管編號和每個試管的洗脫液體積，以及相對應的吸光度值如下表所示：表1凝膠層析實驗原始數據試管編號單管洗脫液體積/ml洗脫液總體積/mlA280nm14.54.50.052237.50.0893310.50.0814313.50.0615316.50.2526319.50.1377322.50.0408325.50.0239328.50.02310331.50.01611334.50.18812337.50.13513340.50.07114343.50.04115346.50.03216349.50.02217352.50.02018355.50.02719358.50.04020361.50.10321364.50.03622367.50.01223370.50.01424373.50.01325376.50.01726379.50.01727382.50.023281.884.30.03629387.30.03530390.30.02331393.30.00732396.30.00733399.30.006343102.30.010353105.30.018363108.30.090373111.30.237383114.30.251393117.30.172403120.30.087413123.30.034423126.30.024利用Excel2003繪制洗脫液總體積—吸光值散點圖，見圖1。和實驗操作一樣，有4個峰值，分別為藍色葡聚糖、牛血清蛋白、胃蛋白和CytC。從中可知，V0=Ve=1\*ROMANI=16.5ml，Ve=2\*ROMANII=34.5ml，Ve=3\*ROMANIII=61.5ml，Ve=4\*ROMANIV=114.3ml。圖1凝膠層析洗脫液體積與對應吸光度值散點圖建立標準蛋白Ve與與LogM標準曲線，見表2、圖1。相關系數R2=0.9267，相關性較好，可作為為測定未知蛋白的標準曲線。因此最終的標準曲線為：Ve=-84.062·LogM+452.21。表2各標準蛋白Ve與logM值蛋白質種類葡聚糖牛血清胃蛋白CytCVe16.534.561.5114.3logM5.3014.8264.5564.137圖2蛋白質Ve與LogM的線性圖分析與討論[1]在允許的工作范圍內，曲線越抖，則分級越好，本實驗選擇曲線斜率為-84.062，曲線很陡，說明此蛋白質的分級很好。[2]從洗脫液總體積—吸光值散點圖（圖1）看，除了4個標準品的峰外，在葡聚糖之前、胃蛋白和CytC之間均出現了很小的