有機(jī)溶劑對hela細(xì)胞生存率的影響

有機(jī)溶劑對hela細(xì)胞生存率的影響

hela細(xì)胞是外細(xì)胞干預(yù)實(shí)驗(yàn)中使用的細(xì)胞植物。廣泛用于化學(xué)離子檢測、分子作用靶和血清藥理學(xué)的領(lǐng)域。材料與方法1胎牛血清、胰酶宮頸癌細(xì)胞株Hela細(xì)胞,購于西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心;緩沖液(PBS)配成0.01mmol/L,RPMI1640培養(yǎng)液購于美國Solarbio公司,胎牛血清、胰酶購于北京全式金生物技術(shù)有限公司,酶標(biāo)儀為美國Bio-TEK公司產(chǎn)品。DM-SO購于美國Sigma公司(純度>99.9%)、DMF購于廣東光華科技股份有限公司(純度>99.5%)、甲醇購于天津富宇精細(xì)化工有限公司(純度>99.5%)、乙醇購于天津市達(dá)森化工產(chǎn)品有限公司(純度>99.7%),3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二甲基四氮唑溴鹽(MTT)購于美國Sigma公司。2胎牛血清、0.ml激素、3.5%hepes宮頸癌細(xì)胞用RPMi1640培養(yǎng)液(10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、10mmol/LHEPES),在37℃、5%CO3dmso和dmf對hela細(xì)胞存活率的影響細(xì)胞經(jīng)過胰酶消化后計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞密度至1×104細(xì)胞形態(tài)的觀察倒置顯微鏡20倍、40倍物鏡下觀察并記錄細(xì)胞的形態(tài)變化。5AnnexinⅤ-FiTC/Pi雙標(biāo)的流式細(xì)胞術(shù)觀察8種不同濃度的乙醇對Hela細(xì)胞凋亡的影響。Hela細(xì)胞經(jīng)過胰酶消化后計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞密度至1×106統(tǒng)計(jì)學(xué)方法運(yùn)用Graphpadprism5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以(ue0af±s)表示,采用t檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,以P<0.01為差異具有極顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。1DMSO對Hela細(xì)胞存活率的影響在濃度為0.5%以內(nèi),DMSO對Hela細(xì)胞存活率無明顯影響。DMSO濃度在0.01%~0.05%時(shí),細(xì)胞生存率與培養(yǎng)基對照組均無差異。但是,當(dāng)濃度超出0.5%時(shí),隨著濃度的增加,存活率顯著下降。以5%濃度組同0.5%濃度組相比較,細(xì)胞存活率明顯下降(P<0.05)。濃度對于0.5%的各組細(xì)胞生存率明顯下降,且隨著濃度的升高,存活率逐漸下降,見表1。2DMF對Hela細(xì)胞存活率的影響DMF的濃度為0.01%組、0.05%組、0.1%組、0.25%組、0.5%組分別與培養(yǎng)基對照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),存活率與培養(yǎng)基對照組比無差異;DMF濃度為1%組、5%組、10%組、20%組分別與培養(yǎng)基對照組比較差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),Hela細(xì)胞的存活率與培養(yǎng)基對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,以0.5%濃度組同1%濃度組相較,細(xì)胞存活率有明顯下降(P<0.05),見表2。3甲醇對Hela細(xì)胞存活率的影響甲醇濃度為0.01%組、0.05%組與空白對照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),Hela細(xì)胞的存活率與培養(yǎng)基對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),且小于培養(yǎng)基對照組;0.1%組和0.5%組分別與培養(yǎng)基對照組比較,存活率無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);0.25%組與培養(yǎng)基對照組比較,存活率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),且大于培養(yǎng)基對照組;1%組、5%組、10%組和20%組分別與培養(yǎng)基對照組比較,存活率有極顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01),且隨著濃度的升高存活率逐漸下降,見表3。4各組hela細(xì)胞存活率的比較乙醇9種不同濃度各組分別與培養(yǎng)基對照組比較,差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),濃度從0.01%~0.25%,隨著濃度的升高,存活率逐漸升高。0.5%組、1%組、5%組、20%組,隨著濃度的增加,Hela細(xì)胞的存活率逐漸降低,而10%濃度組與5%濃度組相較,10%組Hela細(xì)胞的存活率高。以0.5%組同0.25%組相較,Hela細(xì)胞的存活率有顯著下降差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。提示乙醇濃度超過0.25%時(shí),Hela細(xì)胞的存活率明顯降低,見表4。5相同溶劑對hela細(xì)胞存活率影響當(dāng)濃度同在0.25%以內(nèi)時(shí),乙醇分別與甲醇、DMSO、DMF相比較,Hela細(xì)胞的存活率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),乙醇中Hela細(xì)胞的存活率高于其他三種溶劑。提示0.25%濃度以內(nèi),首選乙醇作為有機(jī)溶媒。當(dāng)有機(jī)溶媒濃度超0.5%,隨著濃度的增大,Hela細(xì)胞的存活率逐漸下降,與空白對照組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示,DMSO、DMF、甲醇、乙醇四種有機(jī)溶劑在參與到Hela細(xì)胞培養(yǎng)的離體實(shí)驗(yàn)中時(shí),濃度均不可高于0.5%(圖1)。6dmf對甲醇組細(xì)胞的抑制作用對照組(圖2A)細(xì)胞核清晰可見、完整、型好,細(xì)胞個(gè)體緊實(shí)、邊界清楚、貼壁良好、緊緊相連。與空白對照組相比,DMSO組細(xì)胞隨著濃度的增加,細(xì)胞腫脹,細(xì)胞核明顯腫脹、變形、固化,邊界清晰可見無連接(圖2B、C、D);DMF組細(xì)胞中可見,細(xì)胞體積腫脹,細(xì)胞核變大、固化(圖2E、F、G);甲醇組細(xì)胞隨著濃度增大,細(xì)胞核逐漸腫脹變大,相較于其他三種溶劑其細(xì)胞核折疊程度明顯增加(圖2H、I、J);乙醇組細(xì)胞隨著濃度增大體積逐漸腫大,固化,邊界清晰,無連接,細(xì)胞核腫大與保質(zhì)邊界清晰可見(圖2K、L、M)。各組Hela細(xì)胞形態(tài)變化與MTT檢測結(jié)果一致。7乙醇對hela細(xì)胞存活率的影響當(dāng)乙醇濃度為0.25%時(shí),以刺激6h后Hela細(xì)胞的存活率與刺激12h后Hela細(xì)胞的存活率相比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),提示乙醇刺激Hela細(xì)胞6h和12h,Hela細(xì)胞的存活率無差別。同樣比較Hela被乙醇刺激6h與24h,12h與24h,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),提示當(dāng)乙醇濃度為0.25%時(shí),刺激時(shí)間在24h內(nèi),Hela細(xì)胞的存活率無差別。同理比較乙醇濃度為0.5%時(shí),Hela細(xì)胞被刺激6h與24h比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示乙醇濃度為0.5%時(shí),Hela細(xì)胞被刺激6h與24h后的存活率有差別。當(dāng)Hela細(xì)胞被乙醇刺激同為12h時(shí),以濃度為1%組同5%組相比較,差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),提示同被乙醇刺激12h后,Hela細(xì)胞的存活率1%組與5%組有顯著性差別,5%組Hela細(xì)胞的存活率明顯低于1%組。當(dāng)Hela細(xì)胞被乙醇刺激同為6h時(shí),同樣以濃度為1%組同5%組相比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示1%組與5%組Hela細(xì)胞的存活率有差別。結(jié)果顯示,Hela細(xì)胞離體實(shí)驗(yàn)中,乙醇作為有機(jī)溶媒時(shí),濃度不可超過0.5%,與MTT檢測結(jié)果基本一致,刺激時(shí)間控制在12h為最佳(圖3)。8mtt法檢測細(xì)胞體外培養(yǎng)計(jì)數(shù)及存活率乙醇刺激12hHela細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示:對照組Hela細(xì)胞群99.99%集中在Q3象限;0.25%乙醇組有少部分細(xì)胞分散到其他3個(gè)象限,同時(shí)Q3象限細(xì)胞數(shù)量明顯減少;5%乙醇組可以看到明顯的有多部分細(xì)胞分散到Q1和Q2象限,Q3象限相較0.25%組有減少;10%乙醇組細(xì)胞數(shù)量明顯減少,分散在4個(gè)象限的細(xì)胞也明顯稀疏(圖4)。乙醇刺激12hHela細(xì)胞顯微鏡下顯示:對照組細(xì)胞均勻分布,細(xì)胞形態(tài)完好,呈梭狀或不規(guī)則形狀,貼壁。0.25%乙醇組細(xì)胞有部分呈圓形,不貼壁,透亮度增大,另一部分呈梭形。5%乙醇組可以看見細(xì)胞少部分貼壁,腫脹,同樣透亮度增大。10%乙醇組細(xì)胞已沒有細(xì)胞形態(tài),皺縮呈黑色團(tuán)狀,周圍有光暈,細(xì)胞數(shù)量也明顯減少(圖5)。鏡下觀察與流式檢測結(jié)果基本一致。細(xì)胞體外培養(yǎng)計(jì)數(shù)及存活率檢測是細(xì)胞研究的基本技術(shù)指標(biāo),DMSO、DMF、甲醇和乙醇是開展細(xì)胞研究最常用的四種有機(jī)溶劑。雖然目前已開展了四種有機(jī)溶劑對不同細(xì)胞株的毒性和干預(yù)效應(yīng)研究,但缺乏在同一細(xì)胞和培養(yǎng)環(huán)境四種溶劑的比較研究研究結(jié)果顯示乙醇是體外細(xì)胞培養(yǎng)中較為理想的溶劑,但濃度不可超過0.25%,時(shí)間不可超過12h。研究還發(fā)現(xiàn)乙醇刺激24h后,濃度小于1%時(shí),Hela細(xì)胞的數(shù)量和存活率均較6h、12h高,且與濃度呈正相關(guān),提示較低濃度的乙醇可以刺激細(xì)胞增殖。結(jié)合MTT的實(shí)驗(yàn)原理研究還發(fā)現(xiàn)甲醇溶劑培養(yǎng)的Hela細(xì)胞核明顯折疊,細(xì)胞腫脹沒有其他三種溶劑中的細(xì)胞明顯。推斷可能甲醇可能通過對細(xì)胞核的影響引起了細(xì)胞凋亡。因此建議在實(shí)驗(yàn)中,如溶質(zhì)分子可能進(jìn)入細(xì)胞核時(shí),