地中海貧血的診斷與分型

地中海貧血的診斷與分型

地中海貧血（算盤白生成的惡性貧血）是由地中海沿岸的民族繼承下來的。由于所繼承的蛋白基因的缺陷，患者的紅細胞中存在多個蛋白環(huán)，如缺乏或缺失的紅細胞，導致無效紅細胞的生成和溶血。病理狀態(tài)也被稱為“珠江白生成障礙貧血”。由于基因缺陷的復雜多樣(異質(zhì)性),導致缺乏的珠蛋白鏈的類型和數(shù)量不同,因此患者的臨床表現(xiàn)也不盡相同,輕者可能終生無癥狀,重者胎兒期就可死于宮內(nèi)。因此,自1925年由Cooley和Lee首先描述該疾病開始,對于這一人類常見基因缺陷病的研究一直未終止,尤其是隨著基因診斷技術的不斷提高,在胚胎早期診斷地中海貧血已成為可能。珠蛋白鏈缺乏的類型按照血紅蛋白(hemoglobin,Hb)的4級結構,每個Hb分子由2對珠蛋白肽鏈構成的球形4聚體,一對是α鏈(α鏈和ξ鏈),另一對是β鏈(ε、β、γ、δ鏈)。這6種不同的珠蛋白鏈組成了人類不同的6種Hb,分別是HbGowerⅠ、HbGowerⅡ、HbPortland、HbF、HbA、HbA2,隨發(fā)育的不同階段先后出現(xiàn),到成人主要是后3種,HbA占95%,HbA2占2.0%~3.5%,HbF小于1.5%。無論是國際上還是我國,目前仍根據(jù)珠蛋白鏈缺乏的類型進行地中海貧血命名和分型。α珠蛋白鏈缺乏者為α地中海貧血(α珠蛋白生成障礙性貧血),β珠蛋白鏈缺乏者為β地中海貧血(β珠蛋白生成障礙性貧血),其他少見的還有γ地中海貧血、δβ地中海貧血(δβ0、δβ+、血紅蛋白Lepore綜合征δβ融合基因)和遺傳性胎兒血紅蛋白持續(xù)存在征(HPFH,多見于黑人,分為缺失型和非缺失型,HbF升高,紅細胞內(nèi)HbF呈均勻分布,無明顯貧血表現(xiàn))等。α地中海貧血和β地中海貧血又可根據(jù)所缺乏的珠蛋白基因的種類、程度及臨床表現(xiàn)再分型。α地中海貧血基因位于16號染色體短臂13區(qū)3帶(16p13.3),α珠蛋白鏈完全不能合成者稱為α0珠蛋白生成障礙性貧血,尚能合成少量者稱α+珠蛋白生成障礙性貧血;根據(jù)α基因缺失數(shù)目(決定臨床表現(xiàn)的有無和輕重)分為4種類型,即靜止型(1個α基因異常)、標準型(2個α基因異常)、HbH病(3個α基因異常)和重型(4個α基因異常,HbBart′胎兒水腫綜合征)。β地中海貧血基因位于11號染色體短臂1區(qū)2帶(11p1.2),β珠蛋白鏈完全不能合成者稱為β0珠蛋白生成障礙性貧血,尚能合成少量者稱β+珠蛋白生成障礙性貧血;根據(jù)臨床表現(xiàn)可分為輕型(雜合子)、中間型和重型(純合子)。制備綠地血型根據(jù)典型的臨床表現(xiàn)和實驗室檢查特點,結合患者的家族史及流行病學,診斷地中海貧血一般并不困難。重點是其中少見類型的發(fā)現(xiàn)和基因類型的精確診斷。一、病害是最嚴重的區(qū)域本病以地中海沿岸和東南亞各國較多見,我國則以華南地區(qū)發(fā)病率高,尤其是廣東、廣西、海南等地區(qū),湖南、貴州、云南、四川等也是高發(fā)區(qū),而北方很少見。二、臨床表現(xiàn)與家庭1.hbarhbrthbbachis分型(1)靜止型:靜止型α地中海貧血患者可無任何臨床癥狀和體征,其父母一方有α地中海貧血。(2)標準型:標準型亦稱α地中海貧血特征、輕型α地中海貧血。該型患者的臨床癥狀輕,存在輕度貧血;其父母一方有α地中海貧血。(3)HbH病:HbH病亦稱中間型α地中海貧血。該型患者的臨床表現(xiàn)多樣,年幼時多無癥狀,約半數(shù)患者在20歲以后發(fā)病。多數(shù)患者病情較輕,主要表現(xiàn)為輕、中度的貧血和長期慢性溶血導致的肝脾腫大;重者則伴有黃疸;少數(shù)可伴骨骼輕微改變,不影響生長發(fā)育,因此無地中海貧血外貌。妊娠、感染、服用磺胺類或氧化劑藥物時可誘發(fā)其溶血加重,某些嚴重者的表現(xiàn)與純合子型β地中海貧血類似。往往患者的父母雙方都有α地中海貧血。(4)HbBart′s胎兒水腫綜合征:一般患有HbBart′s胎兒水腫綜合征的胎兒在妊娠30~40周時即可發(fā)生宮內(nèi)死亡,或在早產(chǎn)或出生后數(shù)小時內(nèi)死亡?；疾√浩つw蒼白、全身水腫和各漿膜腔積液,伴或不伴有黃疸、皮膚出血、肝脾腫大,胎盤大而脆,臍帶水腫明顯。其父母均為--/αα型地中海貧血。2.海投血性血癥(1)輕型:輕型β地中海貧血患者大多數(shù)無臨床表現(xiàn),少數(shù)可有輕度貧血和脾腫大;其父母一方為β地中海貧血雜合子。(2)中間型:中間型β地中海貧血患者可存在中度貧血和脾腫大;少數(shù)有骨骼改變(輕度),性發(fā)育延遲。(3)重型(Cooley貧血):重型β地中海貧血患者出生時正常,而在6~12個月后其貧血進行性加重,伴有黃疸和肝脾大;生長發(fā)育遲緩,精神萎靡,智力遲鈍,性征不全,易感染;骨皮質(zhì)變薄,骨骼變脆,甚至發(fā)生病理性骨折。其中大部分具有典型的地中海貧血特殊面容,表現(xiàn)為額部隆起、鼻梁凹陷、眼距增寬?；颊叩母改鸽p方均為β地中海貧血雜合子。三、網(wǎng)織紅細胞的形態(tài)1.血常規(guī):紅細胞呈典型的小細胞低色素性(平均紅細胞容積、平均紅細胞Hb含量降低)改變是地中海貧血的特征,可有或無Hb水平的降低。許多地中海貧血患者均在體檢血常規(guī)檢查中被發(fā)現(xiàn)和診斷。不同類型地中海貧血患者的紅細胞體積略有差異,往往隨著其臨床表現(xiàn)的加重,平均紅細胞容積、平均紅細胞Hb含量降低程度也更明顯,重型β地中海貧血的平均紅細胞容積常50~70fl/細胞,網(wǎng)織紅細胞增高可達60%以上。2.血細胞形態(tài):地中海貧血患者的血細胞形態(tài)無特異性,表現(xiàn)為繼發(fā)溶血的血細胞形態(tài)改變,如靶形紅細胞、“馬鈴薯片形”細胞。HbH病患者的血涂片經(jīng)煌焦油藍染色后,可見紅細胞中含有灰藍色、均勻、圓形的顆粒狀HbH包涵體。其骨髓象主要表現(xiàn)為紅系增生活躍,重者的鐵染色可示含鐵血黃素顯著增多。3.生物化學檢測:根據(jù)患者溶血的情況,其血清間接膽紅素和血清鐵蛋白均有不同程度的升高,后者也是鑒別缺鐵性貧血的主要指標。四、血紅蛋白電泳分析1.紅細胞滲透脆性實驗:地中海貧血患者的紅細胞滲透脆性降低。由于其紅細胞膜存在形態(tài)、生化、代謝異常,在低滲鹽溶液中易膨脹破裂而溶血。該試驗是地中海貧血群體篩查最簡便的方法。2.抗堿血紅蛋白測定:抗堿血紅蛋白測定檢測的是抗堿Hb,為HbF的篩查試驗。然而除HbF外,HbBarts和部分HbH也具有抗堿能力,需通過血紅蛋白電泳分析來鑒別。3.Hb電泳:Hb電泳簡單易行,是臨床診斷地中海貧血最常用的方法。不同的Hb等電點不同,在一定pH緩沖液中帶有不同的電荷。當緩沖液的pH大于該Hb的等電點時,其帶負電荷,電泳時向陽極游動;反之,Hb帶正電荷向陰極游動。經(jīng)一定電壓和時間的電泳后,電荷不同、相對分子量不同的Hb,泳動方向和速度不同,從而分離出各自的區(qū)帶。正常成人Hb在pH為8.6的條件下,電泳顯示3個條帶,即HbA(α2/β2,占97%)、HbA2(α2/δ2,占2%~3%)和HbF(α2/γ2,占1%);而發(fā)生β珠蛋白生成障礙時,往往HbA2>3.5%、HbF>5%。關于地中海貧血的不同Hb定量值總結見表1、2。hb電泳的一般檢測方法一、hb/hba機電泳醋酸纖維薄膜電泳是臨床常用的篩查地中海貧血的方法。醋酸纖維薄膜是均勻的微孔物質(zhì),其對蛋白質(zhì)的吸附極少,因此該方法的優(yōu)點是拖尾現(xiàn)象少、圖像清晰、分離速度快、樣品用量少且易于洗脫定量。行醋酸纖維薄膜電泳時常規(guī)采用pH8.6的TEB緩沖液,而采用pH6.5的TEB緩沖液進行Hb電泳時易分離HbH與HbBarts。但醋酸纖維薄膜電泳影響因素較多,如電壓、電泳時間、醋酸纖膜質(zhì)量、染料濃度等;且由于HbF與HbA等電點接近,很難分辨出HbA稍后的HbF區(qū)帶,因此醋酸纖維素膜電泳對HbF分辨率有一定的局限性,從而影響了結果的可靠性。二、土地應采用0/0土地聚丙烯酰胺凝膠電泳的分辨率高,可檢出醋酸纖維素膜電泳中與HbA不易區(qū)分的不穩(wěn)定Hb、潛在的異常Hb和絕大多數(shù)α地中海貧血,明確區(qū)分β0地中海貧血與β+地中海貧血。本方法簡單易行,對地中海貧血(珠蛋白生成障礙性貧血)的診斷有重要參考價值。然而,瓊脂糖凝膠電泳不能區(qū)分HbE與HbA2。三、客觀標準診斷法毛細管電泳綜合了電泳和色譜兩者技術的優(yōu)點。與上述傳統(tǒng)的薄膜或凝膠電泳相比,不僅無需染色,且速度快、所需樣本量少。我院實驗室采用該技術可以在30min內(nèi)一次性將5種珠蛋白肽鏈完全、準確地分離,得出HbA、HbA2、HbF、HbH、HbBarts各組分的百分比。該方法操作簡便,重復性好,省時高效,適用于血紅蛋白病的快速診斷,也是目前我國地中海貧血篩查常用的方法。盡管血紅蛋白電泳在技術上不斷改進和完善,但目前仍不能將HbE、HbA2兩者區(qū)分開,因此無法完全鑒別出部分靜止型地中海貧血,有一定的漏診率,需進行基因分析等來診斷這部分人群。hba的分離和測定國際地中海貧血協(xié)會廣泛推薦使用HPLC作為Hb分析參比方法。其原理是利用離子交換樹脂作為固定相,根據(jù)各Hb的理化性質(zhì)不同,其在分離柱中停留的時間也不同,從而將各Hb分離。HPLC可分離和定量HbF和HbA2,有助于β地中海貧血、δβ地中海貧血、遺傳性胎兒Hb持續(xù)存在征的診斷。而且HPLC不受標本質(zhì)量如高脂、黃疸等血標本的干擾,檢測準確率高,重復性好,對地中海貧血尤其是β地中海貧血的診斷具有很好的臨床價值,而其不足之處是對α地中海貧血篩查仍有一定局限性,需進行基因檢測以提高診斷的準確率。利用電噴霧質(zhì)譜和基質(zhì)輔助激光解吸放電時間質(zhì)譜質(zhì)譜分析法是近代發(fā)展起來的快速、微量、精確測定相對分子質(zhì)量的方法,在此基礎上設計的電噴霧電離質(zhì)譜和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜,可提高異常Hb的檢出,作為Hb電泳和HPLC方法的補充。但該方法對大分子物質(zhì)的解析度有限,在檢測前需用胰蛋白酶預處理成較小的蛋白分子方能進行,因此臨床上仍有部分變異的Hb不能被發(fā)現(xiàn)。處理工藝在土地活檢中的應用基因檢測是地中海貧血的確診實驗,具有更直接、特異、靈敏的特點,可明確基因型及基因缺陷部位,但實際中不可能對每一個患者都進行全部基因序列的檢測。由于大多數(shù)的α地中海貧血均由基因缺失所致,而90%以上的β地中海貧血是由基因突變所致,所以在基因分析時,對于α地中海貧血,先檢測常見的大片段缺失,然后再檢測少見的點突變;對于β地中海貧血,先檢測常見的17種突變,然后再檢測少見的大片段缺失。常用的基因檢測方法有基因探針、DNA微陣列、限制性內(nèi)切酶圖譜分析、聚合酶鏈反應(PCR)、擴增不應突變系統(tǒng)技術、多重突變引物延伸技術、反向斑點雜交、特異性寡核苷酸雜交等一系列分子生物學技術。Gap-PCR可用于α地中海貧血基因攜帶者的一線篩查?；贕ap-PCR原理設計,建立檢測常見缺失型α地中海貧血突變(-SEA、-A3.7和-A4.2)的單管多重PCR技術,可成功檢出這3種常見缺失型α地中海貧血突變的純合子、雜合子和雙重雜合子,具有簡單、快速、準確、可靠、經(jīng)濟、實用的優(yōu)點,目前也?？捎糜诘刂泻Ｘ氀漠a(chǎn)前診斷。與常規(guī)血液學篩查方法比較,Gap-PCR分子篩查技術更具有特異性和可靠性。二、高靈敏性原則反向斑點雜交法是目前國內(nèi)對β地中海貧血診斷率最高的方法,其具有快速、簡便、高靈敏度和特異性強的特點。但在反向斑點雜交檢測過程中,斑點信號可能會存在不均一現(xiàn)象,且該檢測受到各種試驗因素、條件的影響,其穩(wěn)定性和重復性有待提高。三、系統(tǒng)的建立過程基因芯片的檢測原理是,將許多特定的寡核苷酸片段(或cDNA片段)作為靶基因,有規(guī)律地排列固定于支持物上;樣品DNA通過PCR擴增摻入熒光標記分子或放射性核素作為探針,然后按堿基配對原理將兩者進行雜交;再通過熒光或核素檢測系統(tǒng)對芯片進行掃描,由計算機系統(tǒng)對每個探針上的信號作出比較和檢測,從而得出所需要的信息。基因芯片檢測的突出優(yōu)點是高通量,α地中海貧血和β地中海貧血的診斷可集成于1張芯片上進行。地中海貧血的診斷基因芯片將我國人群中常見的3種缺失型α珠蛋白基因突變(特別是對HbH病)及β珠蛋白基因突變探針固定于同一張基因芯片表面,簡便、省時,且無需接觸放射性核素,可同時、快速、準確地檢測α與β地貧基因突變,為臨床提供了一種快速、有效的地中海貧血基因診斷及產(chǎn)前診斷方法,便于推廣應用。四、血清學檢測方法有文獻報道,將多重PCR與磁珠懸浮陣列技術相結合,操作時間短,可一次檢測100個樣本,同時檢測出地中海貧血基因缺失及點突變。相對于傳統(tǒng)檢測方法,該技術既方便又可減少花費,有待進一步推廣。lin等利用基于實時熒光PCR的探針高分辨率熔點曲線分析技術,在40min完成對常見12種β地中海貧血基因突變的檢測,具有準確、快速、高效的特點,可作為新生兒血液篩查的項目。胎兒游離dna檢測技術因地中海貧血為常染色體隱性遺傳性疾病,在我國地中海貧血高發(fā)地區(qū)中應推廣專項婚前檢查。如夫婦雙方均為地中海貧血基因攜帶者,則應于妊娠期進行產(chǎn)前診斷?？捎谌焉锏?~12孕周吸取絨毛,妊娠第16~20孕周抽羊水分離脫落細胞,妊娠第20孕周后抽取臍帶血,提取胎兒的DNA,按上述基因診斷方法(單管多重PCR技術、PCR-反向斑點雜交等)檢測胎兒是否獲得了地中海貧血的缺陷基因。近年來,無創(chuàng)產(chǎn)前診斷技術發(fā)展迅速,其中以胎兒游離DNA檢測技術的應用最為廣泛。Lin等利用PCR與導流雜交技術相結合,通過低密度基因芯片對60例孕婦成功進行了常見的3種缺失型及3種突變型α-地中海貧血和17種β地中海貧血基因突變、復合地中海貧血的產(chǎn)前診斷;也有研究通過該方法對141例孕婦成功進行檢測。因