杜氏藻的生態(tài)功能

杜氏藻的生態(tài)功能

杜先生是世界上高鹽環(huán)境的主要制造商。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了100多年，類型。杜氏藻為單細(xì)胞的真核生物,雙鞭毛,單核,沒有細(xì)胞壁。新陳代謝旺盛,細(xì)胞紡錘形、橢圓形、卵圓形、側(cè)卵球形、球形。前端常為圓形或稍尖,后部為圓形。有時有尾,杯狀葉綠體,淀粉粒和核一般在前端,沿著有收縮性的兩個液泡排列,色素在葉綠體周圍。有時通過細(xì)胞分裂進(jìn)行無性繁殖,產(chǎn)生一個四集藻型階段;有時細(xì)胞形成孢子,孢子萌發(fā),形成4個～8個游走孢子。由于是最耐鹽的真核生物,能在飽和的鹽溶液中生長,因此,引起了生物科學(xué)家的廣泛重視和深入研究,新的種類不斷發(fā)現(xiàn)。目前,有文獻(xiàn)記載的有20余個種或類型。對杜氏藻研究的范圍和程度不斷深入,研究手段不斷改進(jìn):從形態(tài)觀察、生理生化分析到分子生物學(xué)技術(shù)以及現(xiàn)在的蛋白質(zhì)組研究,為認(rèn)識生物的耐鹽機(jī)制提供了一個理想的方便的模式生物。杜氏藻的研究價值主要體現(xiàn)在以下幾個方面:(1)由于杜氏藻是最耐鹽的真核生物,是進(jìn)行植物耐鹽生理研究理想的模式生物;(2)杜氏藻富含胡蘿卜素及高蛋白,可以直接作為食品,或作為精細(xì)化工生產(chǎn)胡蘿卜素的原料;(3)是抗性基因的供體;(4)可以作為表達(dá)外源蛋白的新型生物反應(yīng)器;(5)杜氏藻是高鹽環(huán)境的主要初級生產(chǎn)者,具有重要的生態(tài)意義。隨著分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展,科學(xué)家開始對其進(jìn)行基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)研究,其中分類研究、培養(yǎng)技術(shù)、抗鹽生理、基因工程研究仍是當(dāng)前研究的熱點。本文回顧了杜氏藻研究的歷史,對研究進(jìn)程中里程碑式的研究成果進(jìn)行評述,并對今后的研究方向做一展望。1下鞭毛杜氏藻種1838年,MichelFelixDunal在法國鹽田中首次發(fā)現(xiàn)了該種藻類,他將觀察到的生物稱為Haematococcussalinus和Protococcus。在19世紀(jì),還有許多科學(xué)家在鹽湖及高鹽環(huán)境中,發(fā)現(xiàn)了紅色的雙鞭毛的杜氏藻,并給出了不同的名稱。如Geleznow和Butschinsky在克里米亞鹽湖、Blanchard在阿爾及利亞鹽湖、Florentin在法國的鹽湖、BujorP在羅馬尼亞鹽湖中都發(fā)現(xiàn)了杜氏藻,分別給出了不同的名稱Protococcussalinus,MonasDunaliI,DiselmisDunalii,ChlamydomonasDunalii,Sphaerellalacutrisvar.Dunalii和Dunaliellasalina。其中,1905年Teodoresco命名的Dunalliellasalina被廣泛接受。2杜氏藻屬分類Teodoresco描述了兩個種,Dunaliellasalina和Dunaliellaviridis。Lerche對羅馬尼亞和加利弗尼亞鹽湖收集到的材料進(jìn)行研究,認(rèn)為以前的Dunaliellaviridis是混合種,于是她將其細(xì)分為幾個新種Dunaliellamedia,Dunaliellaeuchlora,Dunaliellaminuta,andDunaliellaparva。但這些種并不是與Dunaliellasalina和Dunaliellaviridis一樣存在于高鹽環(huán)境中,有些是典型的海洋種類,在高鹽環(huán)境中從來沒有發(fā)現(xiàn)過。Massyuk在她的專著中將該屬分為了兩個亞屬,Dunaliella有23個種,Pascheria5個種,這5個種為淡水種。PreisigHR的研究發(fā)現(xiàn),Massyuk的一些種可能是同一種的不同形態(tài)。2000年以來,有些研究者嘗試用分子生物學(xué)方法對杜氏藻進(jìn)行分類研究。分子生物學(xué)研究表明,過去一些品系可能命名有誤,而且過去分類的一些種可能是不必要的。所采用的分子生物學(xué)方法包括基于序列比較和RFLP分析的18SrRNA基因研究,以及18SrRNA基因內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的研究。GonzalezMA的研究表明,對杜氏藻屬內(nèi)種的區(qū)分,分子數(shù)據(jù)和形態(tài)、生理數(shù)據(jù)之間很少聯(lián)系。OlmosJ(2000)的研究結(jié)果表明,Dunaliellasalina、Dunaliellaparva、Dunaliellabardawil的18SrRNA基因內(nèi)分別含有1個、2個和3個內(nèi)含子。最近,有些研究者利用RAPD(隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性)技術(shù)分析杜氏藻種間關(guān)系,從生物的遺傳本質(zhì)DNA入手,為杜氏藻的鑒定與分類歸屬問題提供分子生物學(xué)借鑒。用30個10寡核甘酸隨機(jī)引物進(jìn)行多態(tài)性擴(kuò)增和篩選,其中23個引物(76.67%)可獲得清晰的多態(tài)性條帶。選擇其中清晰、重復(fù)性良好的18個引物共擴(kuò)增產(chǎn)生150條可區(qū)分的DNA條帶。利用種間Nei遺傳相似系數(shù)計算分析,構(gòu)建杜氏藻屬部分中的聚類分析圖。有關(guān)杜氏藻分子生物學(xué)系統(tǒng)分類有待做更深入的研究。3培養(yǎng)聚合物系最適生長時的培養(yǎng)基和合子的應(yīng)用杜氏藻進(jìn)行著復(fù)雜的生命周期,除了進(jìn)行無性細(xì)胞分裂外,還可進(jìn)行有性繁殖。在19世紀(jì)30年代,首次進(jìn)行了鹽度對不同杜氏藻分離物生長影響的實驗。Baas-BeckingLGM(1928)。觀察到Dunaliellaviridis在1M～4M(6%～23%)NaCl,pH6～9范圍內(nèi)生長良好。他還發(fā)現(xiàn),高濃度的鈣、鎂抑制杜氏藻的生長。LercheW(1937)。利用不同的種類和品系做了詳細(xì)的報道,大多數(shù)的品系在2%～8%鹽度生長最好,在15%以上鹽度生長緩慢,在最適生長條件下,每天的分裂率是0.47～1.22。不同品系對營養(yǎng)的需求,GiborA(1956)、Johnsonetal(1968)、VanAuken(1973)等做了深入的研究,配置了能使藻最適生長的培養(yǎng)基。最適的培養(yǎng)鹽濃度隨不同的品系而有所不同:Dunaliellaviridis6%,Dunaliellasalina12%。大鹽湖分離的品系最適鹽濃度10%～15%,有的甚至達(dá)到19%。一般的趨勢是,這些研究中,實驗室培養(yǎng)的最適鹽濃度總是比分離這些品系的環(huán)境的實際鹽濃度低。這個結(jié)果可能很好地反映了這樣一個事實:生物在某種環(huán)境中存在,并不意味著這種環(huán)境最適合它的生長發(fā)育,但是,這種生物要比它的競爭者生長的更好。兩個大小相等的配子融合為一個合子,最早有許多文獻(xiàn)報道。LercheW(1937),利用5個種(Dunaliellasalina,Dunaliellaparva,Dunaliellapeircei,Dunaliellaeuchlora和Dunaliellaminuta)研究了合子的形成過程。她報道,當(dāng)鹽度從10%降到3%時,首先是Dunaliellasalina的鞭毛接觸,然后兩個細(xì)胞形成一個胞質(zhì)橋和一個并合體。合子有一個厚的外層,能在淡水中和干燥的環(huán)境中存活一段時間。合子萌發(fā),釋放達(dá)32個單倍體的子細(xì)胞。她利用富含胡蘿卜素的紅色細(xì)胞和綠色細(xì)胞雜交,能觀察到合子的形成過程(圖1)。4甘油在杜氏藻細(xì)胞的生長和滲透調(diào)節(jié)中的作用杜氏藻細(xì)胞沒有細(xì)胞壁,由一層富有彈性的質(zhì)膜包裹,結(jié)果是細(xì)胞形態(tài)受滲透變化強(qiáng)烈影響。MarrrieandSeretta(1959)。利用冰點來測量細(xì)胞質(zhì)液體來判斷鹽藻胞內(nèi)“鹽”濃度,結(jié)果表明,生長的細(xì)胞的鹽濃度超過3.9M,當(dāng)時推斷,細(xì)胞膜在鹽度升高時吸收了NaCl,隨后自由水流出來平衡胞內(nèi)外的滲透勢。但實際情況是,杜氏藻細(xì)胞內(nèi)的鹽濃度不能那么高,Johnsonetal(1968)的酶學(xué)研究證實了這一結(jié)果。藻代謝的關(guān)鍵酶,比如果糖磷酸異構(gòu)酶、核糖磷酸碳酸酐酶、果糖-6-磷酸脫氫酶和磷酸異構(gòu)酶受NaCl的強(qiáng)烈抑制。我們現(xiàn)在已知道,杜氏藻胞內(nèi)的濃度非常低,利用鋰離子作為胞外水空間的標(biāo)記來評估胞內(nèi)的體積及胞內(nèi)Na離子濃度,在0.5M和4MNaCl生長的細(xì)胞一般不超過100mM(KatzA,1985)。如此低濃度的Na離子濃度是通過Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白活性(KatzA,1989)。以及電子轉(zhuǎn)移與Na+外排偶聯(lián)(KatzA,2001)實現(xiàn)的。但較低的細(xì)胞內(nèi)離子濃度和細(xì)胞內(nèi)滲透平衡的需求之間存在著明顯的矛盾,這一矛盾是如何解決的呢?研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞累積光合作用產(chǎn)物甘油可作為滲透調(diào)節(jié)的“可溶性”溶質(zhì)。非常有趣的是,甘油對杜氏藻作用效果的實驗是由百年前Teodoresco(1906)完成的,他驗證了甘油和其他非離子化合物引起胞質(zhì)收縮的效果。他觀察到,當(dāng)杜氏鹽藻細(xì)胞懸在50%甘油中時,暫時失去了游動性,當(dāng)甘油濃度在潮濕的環(huán)境下逐漸降低,又逐漸恢復(fù)了游動,75%甘油濃度的效果極為相似。但在100%甘油濃度下,大部分的細(xì)胞死亡,僅有很少的細(xì)胞存活。第一個證明甘油在杜氏藻累積并作為滲透調(diào)節(jié)劑的是Craigie和Mclachlan(1964)發(fā)表的簡報,他們利用14CO2和Dunaliellatertoilecta共培養(yǎng),然后用酒精提取細(xì)胞,分離含有溶質(zhì)碳水化合物的中間相,利用離子交換程序的相關(guān)化合物及雙向紙層析、放射自顯影技術(shù)分析其特征。當(dāng)培養(yǎng)基鹽濃度從0.025M增加100倍到2.5M時,在中間相中發(fā)現(xiàn)放射活性增加了94倍。在0.025M、0.5M、2.5M濃度下共培養(yǎng)的細(xì)胞,甘油數(shù)量是中間相放射活性的56%、76%和81%,其它可能是可溶性的多糖。在隨后的研究中,Wegmann(1971)證實,隨著鹽濃度的增加,放射性標(biāo)記的14CO2轉(zhuǎn)化為甘油增加,可達(dá)到2.8M。他推斷,甘油的形成是杜氏藻在高鹽生境存活的保護(hù)機(jī)制。甘油在杜氏藻鹽適應(yīng)中的作用,由Ben-Amots和Avron(1973)及Borowitzka和Brown(1974)的研究做了進(jìn)一步證實。由DuncanBrown創(chuàng)造的“兼性溶質(zhì)”這個名詞表明,甘油這一溶質(zhì)不僅能維持細(xì)胞滲透勢,也維持酶的活性,在高鹽度下,酶活性很大程度上得益于甘油的功能。杜氏藻胞內(nèi)甘油的濃度能達(dá)到很高,在4MNaCl下生長的細(xì)胞,椐報道含有7.8M的甘油,相當(dāng)于718g/L的甘油水溶液(BrownAD,1990)。維持如此高濃度的甘油需要特殊的細(xì)胞膜特性。因為大部分細(xì)胞膜對甘油有透性,而杜氏藻的膜對甘油有不尋常的低透性,能使甘油保持在細(xì)胞內(nèi)。但目前杜氏藻對甘油的低透性的機(jī)理還沒有完全搞清楚。盡管利用杜氏藻生產(chǎn)甘油的技術(shù)從理論上將是可能的,但由于經(jīng)濟(jì)效益低,目前還沒有利用杜氏藻生產(chǎn)甘油的生物技術(shù)。5-胡蘿卜素的生物技術(shù)杜氏鹽藻中含有鮮紅色的色素,早期認(rèn)為是“血色素”,后來鑒定為胡蘿卜素。這些鑒定工作是由BlanchardR(1897)、TeodovescoEC(1906)、LercheW(1937)、RuinenJ(1938)等完成的。根據(jù)色素在酒精和乙醚中的可溶性,以及在濃硫酸中形成蘭色的特性,確定為胡蘿卜素。早期的Teodovesco和LabbeA(1921)認(rèn)為,類胡蘿卜素分布于整個細(xì)胞質(zhì)中,但利用電子顯微鏡顯示,β-胡蘿卜素位于細(xì)胞單一葉綠體類囊體之間的顆粒體中。β-胡蘿卜素是由D.salina和D.bardawil積累的主要類胡蘿卜素類型,是一種價值很高的化工產(chǎn)品,作為天然食品色素具有大量的需求;作為維生素A的前提,是化妝品添加劑,而且是有益健康的食物(BorowitzkaMA,1986)。一些杜氏藻的品系能大量累積β-胡蘿卜素,如在澳大利亞pinklake中的Dunaliella.salina,干物質(zhì)中的13.8%的有機(jī)物為β-胡蘿卜素;某種品系的培養(yǎng)物中,β-胡蘿卜素占干重的10%甚至更高,包括比例較大的9-順式異構(gòu)體(Ben-AmotzA,1988)。因此,很早就有了利用杜氏藻來生產(chǎn)β-胡蘿卜素的生物技術(shù)的研究。第一個生產(chǎn)β-胡蘿卜素的杜氏藻培養(yǎng)的工廠是1966年在前蘇聯(lián)建立的(MassyukNP,1968;DrokovaIH,1961)。目前,在全世界范圍內(nèi),建立了大量的鹽藻培養(yǎng)的生產(chǎn)工廠或基地。生產(chǎn)杜氏藻的廠家及公司主要有十幾家,產(chǎn)品主要有干藻粉及植物油濃縮物(表1)。采用的技術(shù)有所不同,從瀉湖的粗放培養(yǎng),到可控制條件的高細(xì)胞密度的集約化培養(yǎng)。其中一種誘導(dǎo)大量類胡蘿卜素積累的生物技術(shù)是降低營養(yǎng)水平,減少生長率。細(xì)胞中的大量的類胡蘿卜素的產(chǎn)生可能是由于營養(yǎng)的限制和高強(qiáng)度的光照。LercheW(1937)報道,當(dāng)出現(xiàn)紅色時,特別是在老的培養(yǎng)物中,相應(yīng)地在培養(yǎng)條件中減少一種或多種化合物,當(dāng)P或N營養(yǎng)處于有限的數(shù)量,我們就能首先獲得類胡蘿卜素。6杜氏藻類互補(bǔ)研究6.1鹽藻的遺傳轉(zhuǎn)化開展鹽藻分子生物學(xué)研究對深入了解鹽藻的抗性機(jī)制和更好地開發(fā)利用具有重要的意義,但目前研究基礎(chǔ)還相當(dāng)薄弱。迄今已從鹽藻中克隆出20多個基因,這些基因的功能見表2。國內(nèi)外已有多個實驗室進(jìn)行了鹽藻遺傳轉(zhuǎn)化方面的嘗試,取得了一定的進(jìn)展。耿德貴等利用電激法將GUS基因轉(zhuǎn)入杜氏鹽藻細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行瞬時表達(dá),研究了鹽藻的生長狀態(tài)和電激條件對轉(zhuǎn)化率的影響,并比較了5種啟動子的轉(zhuǎn)化效率。采用鹽藻作為外源基因表達(dá)系統(tǒng)有許多的優(yōu)點:比如,鹽藻沒有細(xì)胞壁,比高等植物細(xì)胞有利于轉(zhuǎn)化和破碎;鹽藻具有游動能力,培養(yǎng)時可以不需要搖床搖動;由于營養(yǎng)簡單,能夠進(jìn)行光合作用,培養(yǎng)時只需要無機(jī)鹽,不需要有機(jī)物;由于可以高鹽度培養(yǎng),不易污染微生物以及其他雜藻和食藻動物。