付強(qiáng)-金磁微粒為載體的乙肝病毒表面抗原免疫學(xué)檢測(cè)方法的建立(西北大學(xué)碩士學(xué)位答辯PPT)2007.5

金磁微粒為載體的乙肝病毒表面抗原免疫學(xué)檢測(cè)方法的建立

答辯人付強(qiáng)專業(yè)生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)老師崔亞麗教授

答辯日期2007-5-31西北大學(xué)碩士研究生論文答辯1

答辯內(nèi)容

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背景介紹

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研究報(bào)告金磁微粒為載體的磁分離酶聯(lián)免疫法檢測(cè)乙肝病毒表面抗原方法的建立

金磁微粒為載體的化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法檢測(cè)乙肝病毒表面抗原方法的建立

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全文總結(jié)

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致謝西北大學(xué)碩士研究生論文答辯2西北大學(xué)碩士研究生論文答辯背景介紹乙型肝炎病毒概述?乙肝病毒（HBV）是一種嗜肝性DNA病毒，它是引起乙型病毒性肝炎的病原體。

電鏡下HBV顆粒的三種形態(tài)（摘自NEnglJMed2004,350:1118-29）HBV結(jié)構(gòu)模擬圖3西北大學(xué)碩士研究生論文答辯背景介紹乙肝病毒表面抗原（HBsAg）4HBsAg種類大蛋白（LHBs）中蛋白（MHBs）主蛋白（SHBs）西北大學(xué)碩士研究生論文答辯背景介紹5HBsAg的主要作用介導(dǎo)病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體（HBsAb）早期診斷的血清學(xué)標(biāo)志乙肝病毒表面抗原的常用免疫學(xué)檢測(cè)方法比較

西北大學(xué)碩士研究生論文答辯方法

優(yōu)點(diǎn)

缺點(diǎn)

雙抗體夾心ELISA法

操作簡(jiǎn)便、快速，特異性高

靈敏度不夠高，容易出現(xiàn)漏檢膠體金免疫層析測(cè)定法

簡(jiǎn)便、快速，操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，適用于急診檢驗(yàn)的需要靈敏度不如ELISA法，須與ELISA法并用

免疫熒光法

特異性強(qiáng)、敏感性高、速度快非特異性染色問題尚未完全解決，技術(shù)程序也比較復(fù)雜放射免疫分析法

靈敏度高達(dá)ng甚至pg水平，特異性強(qiáng)，精度高，可進(jìn)行超微量分析存在放射性污染，不易保存，穩(wěn)定性差背景介紹6西北大學(xué)碩士研究生論文答辯以磁性微粒為載體的磁分離酶聯(lián)免疫技術(shù)（MAIA）背景介紹?磁性微粒的定義：磁性微粒(magneticparticles)，又稱磁性微球(magneticbeads或magneticmicrospheres)，是由超順磁性納米粒子與高分子或其它無機(jī)材料復(fù)合形成的膠態(tài)顆粒。7金外殼磁內(nèi)核GoldMagTM-AS微米金磁微粒磁分離酶聯(lián)免疫法(magneticaffinityimmunoassay,MAIA)是20世紀(jì)80年代中期由瑞士Serono診斷中心發(fā)明的一種免疫檢測(cè)新技術(shù)。

MAIA技術(shù)具有靈敏度高、檢測(cè)速度快、特異性高、重復(fù)性好、無放射性污染等優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)學(xué)檢測(cè)、食品安全檢測(cè)等領(lǐng)域有著很好的應(yīng)用前景。西北大學(xué)碩士研究生論文答辯化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)背景介紹概念：集靈敏的化學(xué)發(fā)光分析和特異的抗原抗體免疫測(cè)定于一體的檢測(cè)技術(shù)。特點(diǎn)：

特異性高，敏感性高，操作簡(jiǎn)便、快速，試劑無毒，安全穩(wěn)定，可自動(dòng)化。目前，已有許多將化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)應(yīng)用于臨床檢測(cè)的研究報(bào)道。如應(yīng)用化學(xué)發(fā)光免疫分析法定量檢測(cè)乙肝病毒標(biāo)志物1，磁分離-酶標(biāo)記-化學(xué)發(fā)光法測(cè)定促甲狀腺素2等；相關(guān)的檢測(cè)儀器，如：ACCESS化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(美國BeckmanCoulter公司)81.化學(xué)發(fā)光免疫分析定量檢測(cè)乙肝病毒標(biāo)志物方法學(xué)研究，標(biāo)記免疫分析與臨床，2004,(11)3:157~159.2.磁分離-酶標(biāo)記-化學(xué)發(fā)光法測(cè)定促甲狀腺素的應(yīng)用，國外醫(yī)學(xué)臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè)，2005,(26)4:193~198.西北大學(xué)碩士研究生論文答辯以金磁微粒為載體的HBsAg免疫學(xué)檢測(cè)方法原理圖背景介紹9++化學(xué)發(fā)光金磁微?！狝nti-HBsHBsAgAg-Ab復(fù)合物HRP-Ab+Luminol,H2O2,PIPAg-Ab-酶復(fù)合物｛TMB底物檢測(cè)吸光度與樣品濃度成正比西北大學(xué)碩士研究生論文答辯研究目的及意義?研究目的以金磁微粒為載體，建立乙肝病毒表面抗原（HBsAg）的免疫學(xué)檢測(cè)方法，并用標(biāo)準(zhǔn)HBsAg血清盤對(duì)該方法進(jìn)行驗(yàn)證和比較，以期開發(fā)新的檢測(cè)系統(tǒng)用于HBsAg的檢測(cè)。

背景介紹?研究意義HBsAg的檢測(cè)可用于體檢、獻(xiàn)血員篩選、血液制品的復(fù)檢、了解乙肝病毒感染者的感染狀況、療效觀察及預(yù)后評(píng)估，另外還用于乙型肝炎的流行病學(xué)調(diào)查。10實(shí)驗(yàn)I西北大學(xué)碩士研究生論文答辯Ⅰ.以金磁微粒為載體的磁分離酶聯(lián)免疫法檢測(cè)乙肝病毒表面抗原

HBV表面抗體在金磁微粒表面的包被

包被抗體和酶標(biāo)抗體最佳工作濃度的選擇

溫育時(shí)間的選擇顯色時(shí)間的選擇精密度考察靈敏度考察特異性考察11實(shí)驗(yàn)I西北大學(xué)碩士研究生論文答辯HBV表面抗體在金磁微粒表面的包被

包被前抗體溶液在280nm處具有明顯的光吸收，包被反應(yīng)完畢后剩余溶液在280nm處幾乎沒有光吸收出現(xiàn)，說明抗乙肝病毒表面抗原單克隆抗體幾乎全部包被在金磁微粒表面。

HBsAb包被前后的紫外吸收曲線

12實(shí)驗(yàn)I西北大學(xué)碩士研究生論文答辯包被抗體和酶標(biāo)抗體最佳工作濃度的確定

不同量的包被抗原和不同稀釋度的HRP-標(biāo)記抗原條件下檢測(cè)的陽性和陰性血清結(jié)果注：P：陽性血清；N：陰性血清酶標(biāo)抗體稀釋度

501002003004001:600PN1.3310.0562.3210.0582.5730.0692.5820.0512.7690.0531:800PN1.140.052.1680.0582.3080.0542.5330.0522.3620.0531:1000PN0.8480.051.8390.052.0740.052.1750.052.2080.051:2000PN0.5610.051.1130.051.3300.051.4720.051.5060.511:3000PN0.2940.050.3710.050.5370.050.4780.050.4830.05抗體包被量（ng/孔）

當(dāng)控制陽性對(duì)照OD值在2.0以上，陰性對(duì)照OD值在0.05以下（小于0.05，以0.05計(jì)）時(shí)，有三個(gè)方案可滿足此條件，為了減少實(shí)驗(yàn)成本，我們選擇抗原包被量為200ng/孔，酶標(biāo)抗體1:1000稀釋作為本實(shí)驗(yàn)的最佳條件。13實(shí)驗(yàn)I西北大學(xué)碩士研究生論文答辯溫育時(shí)間的選擇吸光度值隨溫育時(shí)間的變化

本實(shí)驗(yàn)中，選用溫育時(shí)間為25min，此時(shí)抗原抗體反應(yīng)已達(dá)平衡，且時(shí)間波動(dòng)對(duì)吸光度值影響較小。

14實(shí)驗(yàn)I西北大學(xué)碩士研究生論文答辯顯色時(shí)間的選擇5min10min15min陽性對(duì)照2.6912.860OUT陰性對(duì)照0.0630.0870.113不同顯色時(shí)間下的檢測(cè)結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)中，顯色時(shí)間為15min時(shí)，非特異性的值較高，而顯色10min和顯色5min相比，陽性值和陰性值均變化不大，說明5min時(shí)，顯色反應(yīng)已達(dá)平衡。因此，選擇5min作為最佳的顯色時(shí)間。15實(shí)驗(yàn)I西北大學(xué)碩士研究生論文答辯臨界值(Cut-off)的確定16吸光度值OD=0.105

陰性血樣OD值分布平均值OD值：X=0.05根據(jù)常用的臨界值判定標(biāo)準(zhǔn)來計(jì)算該方法的臨界值，即為陰性對(duì)照平均值×2.1，陰性對(duì)照平均值<0.05時(shí)，陰性對(duì)照值以0.05計(jì)算，得Cut-off值為0.105，我們將OD=0.105作為本實(shí)驗(yàn)中判定陽性血樣的臨界值。實(shí)驗(yàn)I西北大學(xué)碩士研究生論文答辯金磁微粒為載體HBsAg檢測(cè)系統(tǒng)的精密性檢測(cè)結(jié)果

次數(shù)檢測(cè)結(jié)果(扣除空白值)陽性檢測(cè)平均值(扣除空白值)RSD(%)(批內(nèi)-)1P2.0582.2242.1702.1112.2132.1562.91N0.050.050.050.050.052P1.8502.1322.2172.2302.2192.1306.77N0.050.050.050.050.053P2.1372.1112.1902.1572.1492.1491.20N0.050.050.050.050.054P2.0912.1322.2302.1622.2042.1632.29N0.050.050.050.050.055P2.0452.0772.1712.1022.1502.1092.19N0.050.050.050.050.05RSD(%)(批間-)2.03

除一組檢測(cè)外，方法的批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于5%，批間RSD僅為2.03%。另外，用該系統(tǒng)對(duì)HBsAg國家參考標(biāo)準(zhǔn)品也進(jìn)行了精密度測(cè)定，檢測(cè)10份樣品的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為8.3%，這符合HBsAg國家參考標(biāo)準(zhǔn)品的精密度要求（RSD應(yīng)小于15%）。說明金磁微粒為載體HBsAg檢測(cè)系統(tǒng)的精密性較好。17實(shí)驗(yàn)I西北大學(xué)碩士研究生論文答辯靈敏度考察adr亞型陽性對(duì)照陰性對(duì)照0.2ng/mL0.5ng/mL1.0ng/mLOD（扣除空白）OUT0.050.1430.1540.145adw亞型陽性對(duì)照陰性對(duì)照0.5ng/mL1.0ng/mL2.0ng/mLOD（扣除空白）OUT0.050.1100.1770.300ay亞型陽性對(duì)照陰性對(duì)照0.5ng/mL1.0ng/mL2.0ng/mLOD（扣除空白）OUT0.050.0600.1080.184adr亞型陽性對(duì)照陰性對(duì)照0.2ng/ml0.5ng/ml1.0ng/mlOD（扣除空白）

OUT0.050.050.0910.187adw亞型陽性對(duì)照陰性對(duì)照0.5ng/ml1.0ng/ml2.0ng/mlOD（扣除空白）OUT0.050.0370.0910.204ay亞型陽性對(duì)照陰性對(duì)照0.5ng/ml1.0ng/ml2.0ng/mlOD（扣除空白）OUT0.050.0260.0740.146金磁微粒為載體HBsAg檢測(cè)系統(tǒng)的靈敏度檢測(cè)結(jié)果

商品化的ELISA試劑盒的靈敏度檢測(cè)結(jié)果

注：OUT表示所測(cè)值超出儀器的檢測(cè)范圍

18實(shí)驗(yàn)I西北大學(xué)碩士研究生論文答辯特異性考察

用本系統(tǒng)檢測(cè)HBsAg國家參考品的20份陰性血清及3份強(qiáng)陽性血清，結(jié)果顯示，陰性符合率為100%(20/20)，陽性符合率為100%(3/3)。此外檢測(cè)了203份獻(xiàn)血者的血樣，其結(jié)果與應(yīng)用商品化試劑盒的結(jié)果一致。同時(shí)檢測(cè)了81份HBsAg陰性獻(xiàn)血者的血樣，其陰性符合率為100%(81/81)。

19陽性參考品1.4392.552.708陰性參考品0.0640.0710.0540.0460.0590.0820.0600.0510.0520.0670.0550.0520.0690.0530.0530.0540.0670.0550.0450.071實(shí)驗(yàn)I西北大學(xué)碩士研究生論文答辯小結(jié)建立了以金磁微粒為載體，檢測(cè)血清中HBsAg的方法。精密性試驗(yàn)表明，應(yīng)用該法檢測(cè)陽性血清及陰性血清時(shí)，方法的批內(nèi)及批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.20~7%的范圍，符合臨床檢測(cè)要求。選用衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心的HBsAg國家參考品對(duì)本系統(tǒng)進(jìn)行靈敏度分析，結(jié)果顯示乙肝病毒表面抗原adw，adr，ay三種亞型的最低檢出濃度分別為0.5ng/ml，0.5ng/ml及1.0ng/ml；符合HBsAg國家參考品靈敏度檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)，且與目前商品化ELISA試劑盒的檢測(cè)水平相當(dāng)。用該方法檢測(cè)獻(xiàn)血員血清