固定化超氧化物歧化酶的制備及其酶學(xué)性質(zhì)研究

固定化超氧化物歧化酶的制備及其酶學(xué)性質(zhì)研究

這是1973年發(fā)現(xiàn)的一種含有金屬離子的酶，也是此前僅發(fā)現(xiàn)的一種以自由基為基礎(chǔ)的酶。該酶能專一地清除生物氧化過程中產(chǎn)生的超氧陰離子自由基(O2-),是機(jī)體對抗自由基的第一道防線,在維持生物機(jī)體內(nèi)自由基產(chǎn)生與清除的動態(tài)平衡過程中起著極其重要的作用。SOD在藥物、食品、日化等方面有著廣泛的應(yīng)用,但由于其穩(wěn)定性差、易失活、半衰期短等缺點,在一定程度上限制了其應(yīng)用。對此,許多研究者采用各種方法對SOD進(jìn)行修飾改造,如聚乙二醇、β-環(huán)糊精、山梨醇月桂酸、右旋糖苷、聚蔗糖及肝素修飾等,與天然SOD相比較,這些產(chǎn)品的生物學(xué)性質(zhì)有不同程度的改善。將SOD固定化,不僅能保持其原有特性,穩(wěn)定性也有很大提高,而且可重復(fù)使用。固定化酶可進(jìn)一步組裝成酶傳感器。本研究以殼聚糖為載體,戊二醛為交聯(lián)劑,對SOD進(jìn)行固定,并對其貯存穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性等進(jìn)行考察。1.材料和方法1.1生化酶及氨基酸質(zhì)殼聚糖(脫乙酰度≥95%)購自濟(jì)南海得貝海洋生物工程有限公司;銅鋅超氧化物歧化酶購自美國Sigma公司;小牛血清白蛋白購自羅氏制藥有限公司;戊二醛25%水溶液購自中國醫(yī)藥集團(tuán)(上海)化學(xué)試劑公司;維生素C購自天津市科源化學(xué)試劑有限公司;鄰苯三酚購自天津市標(biāo)準(zhǔn)科技有限公司;Tris購自天津市博迪化工有限公司。1.2固定化酶的制備以殼聚糖為載體,戊二醛為交聯(lián)劑,分兩步制備固定化超氧化物歧化酶。制備過程見圖1。1.2.1戊二醛溶液的配制取2.0g殼聚糖粉末,加入25ml0.3%的戊二醛溶液,室溫下攪拌3h后,于4℃下放置過夜;次日抽濾,并用50ml磷酸鹽緩沖液洗滌,得到淡黃色活化的殼聚糖粉末。1.2.2化酶液制備酶取0.5g活化的殼聚糖粉末,加入10ml超氧化物歧化酶液,室溫下攪拌1.5h,于4℃下放置過夜;取少量上清液保存在4℃待測,將余下的混合物抽濾,并用50ml磷酸鹽緩沖液分5次洗滌,即得到固定化SOD酶粉。見圖1。1.2.3空白對照殼聚糖粉的制備取0.5g活化的殼聚糖粉末,加入10ml小牛血清白蛋白液,室溫下攪拌1.5h,于4℃下放置過夜,抽濾,用50ml磷酸鹽緩沖液分5次洗滌,即得空白對照殼聚糖粉。1.3酶活性測定1.3.1鄰苯三酚總成分配的測定取3支帶刻度的離心管,將溶液酶加入Tris-HCl緩沖液(pH8.02)中預(yù)熱10min后,加入鄰苯三酚,準(zhǔn)確反應(yīng)3min,加入終止劑5%維生素C,室溫放置5min后測定A325值。按表1加樣,以1號管溶液為空白,測定各管的A325值。1.3.2值的測定取3支帶刻度的離心管,將固定化酶及空白對照殼聚糖粉加入Tris-HCl緩沖液(pH8.02)中預(yù)熱10min后,加入鄰苯三酚,準(zhǔn)確反應(yīng)3min,加入終止劑5%維生素C,在室溫下放置數(shù)分鐘,3200g離心10min,吸取上清液,測定A325值。按表2加樣,以1號管溶液為空白,測定各管的A325值。1.3.3酚自氧化抑制率單位的測定在25℃條件下,1ml反應(yīng)液中,每分鐘使溶液A325值減小一半(即使鄰苯三酚自氧化抑制率達(dá)50%)的酶量定義為1個酶活力單位。鄰苯三酚自氧化抑制率α=(Ao-As)/Ao×100%其中:V為反應(yīng)液的總體積,v為溶液酶的加入量,m為固定化酶的加入量,Ao為自氧化速率,As為加入酶后的氧化速率。1.3.4計算回收率的公式如下回收率(%)=固定化酶活力/(初始溶液酶活力-上清液酶活力)×100%1.4溶液酶和固定化酶的溫度穩(wěn)定性檢測1.4.1溫穩(wěn)定試驗取溶液酶150μl和固定化酶300mg,分別分裝于15個離心管中,在室溫條件下保存,每天測定3次酶活力,連續(xù)檢測5d。1.4.2不同升溫水浴中的酶活力測定取溶液酶30μl和固定化酶60mg,分別分裝于3個離心管中,置85℃的恒溫水浴中,分別于40、80和120min測定酶活力;將溶液酶與固定化酶分別置于25、35、45、55、65、75和85℃下30min,測定酶活力。1.5酶活力的測定將固定化酶和溶液酶分別置于pH2和pH13的緩沖液中,分別于40、80和120min測定酶活力。將固定化酶和溶液酶分別置于pH2、4、6、8、10和13的緩沖液中,放置30min,測定酶在不同pH條件下的活力,篩選固定化酶和溶液酶的最適pH值。1.6計算壽命計算將新制備的固定化酶置于4℃下,隔日檢測其活力。分別以第1天與第3天,第3天與第5天所得活力值代入下式,計算半衰期。其中t1/2為半衰期(即固定化酶活力下降為最初活力一半所經(jīng)歷的連續(xù)工作時間,單位h),E0為原始酶活力,t為時間(h),E為t時的酶活力,最后將所得t1/2求平均值。1.7固定化酶重復(fù)使用回收率檢測對固定化酶進(jìn)行重復(fù)回收使用,測定其酶活力及回收率。1.8米氏常數(shù)的測定在25℃,pH7.0的條件下,利用雙倒數(shù)作圖法作出其Lineweaver-Burk曲線圖,求得固定化酶和溶液酶的米氏常數(shù)(Km)。2.結(jié)果2.1固定酶的活力和回收率經(jīng)計算,固定化酶的活力為333U/g,酶活回收率為86.32%。2.2溶液酶和固定化酶的溫度穩(wěn)定性2.2.1室內(nèi)溫度室溫保存5d后,固定化酶的相對酶活力仍保持在80%以上,而溶液酶的相對酶活力則隨著保存天數(shù)的增加呈線性降低,見圖2。2.2.2固定化酶的活力在85℃的條件下,隨著時間的延長,溶液酶的活力顯著下降,而固定化酶的活力則有一定的提高,見圖3。在25、35、45、55、65和75℃分別放置30min,固定化酶的活力也優(yōu)于溶液酶,固定化酶的最適反應(yīng)溫度在45℃,見圖4。2.3sod的堿穩(wěn)定性在強堿(pH13)和強酸(pH2)的條件下,固定化酶在1h內(nèi)仍保持著較高的活性,且隨著時間的延長,其相對酶活力雖有下降,但仍高于溶液酶,見圖5和圖6,表明SOD的酸堿穩(wěn)定性通過固定化得到了較大的提高。pH梯度實驗結(jié)果可見,固定化酶及溶液酶活性的最適pH均為6,見圖7,在較強的酸堿性環(huán)境下,固定化酶均比溶液酶穩(wěn)定。2.4固定化酶的半衰期經(jīng)計算,固定化酶的半衰期為43.8d。2.5固定化酶重復(fù)使用回收率固定化酶的回收率在第1次(70.12%)和第2次(51.72%)仍保持較高水平,但第3次(24.15%)較低。2.6固定化酶及溶液酶的1/[s]的線性關(guān)系固定化酶及溶液酶Km分別為0.18和0.16mmol/L。在低底物濃度下,固定化酶及溶液酶的1/V對1/[S]均有較好的線性關(guān)系;在相對高的底物濃度下,兩者均偏離線性關(guān)系,向上彎曲,見圖8。表明二者出現(xiàn)不同程度的底物抑制現(xiàn)象。3.固定化超氧化物歧化酶的活性和穩(wěn)定性本實驗以殼聚糖為載體、戊二醛為交聯(lián)劑,采用固定化的方法對超氧化物歧化酶進(jìn)行優(yōu)化。并采用鄰苯三酚自氧化法測定SOD的活性。鄰苯三酚在堿性條件下發(fā)生自氧化反應(yīng),在自氧化過程中,超氧陰離子(O2-)不斷消失又不斷生成,當(dāng)達(dá)到穩(wěn)態(tài)時,其濃度保持恒定,鄰苯三酚的自氧化率呈O2-濃度相關(guān)性。SOD能催化O2-發(fā)生歧化反應(yīng),生成H2O2和O2,從而抑制鄰苯三酚的自氧化。樣品對鄰苯三酚的抑制程度,可反映樣品中SOD的含量。實驗測定在325nm處有色醌類的吸光度變化,反映出鄰苯三酚自氧化反應(yīng)的抑制程度。O2-在水溶液中是中等強度的還原劑和弱氧化劑,它能迅速參與單電子還原反應(yīng),但也能被強氧化劑還原。當(dāng)強還原劑維生素C作為終止劑加到反應(yīng)體系時,便迅速與O2-反應(yīng),阻止自氧化反應(yīng)的繼續(xù)進(jìn)行,為同時測定多樣品爭取了時間。經(jīng)檢測,固定化超氧化物歧化酶活力可達(dá)333U/g,酶活回收率為86.32%,均明顯高于其他同類實驗(192U/g,34%;123U/g,41%)。固定化酶在85℃高溫條件下,活力并沒有明顯下降,反而有微小上升,可能是由于高溫使固定化酶的載體更為活躍,空間位阻變小,更有利于酶與底物的結(jié)合。固定化酶在強酸、強堿條件下活性維持得更久,但在2h后也會降低至50%以下。在較強的酸堿環(huán)境下固定化酶比溶液酶穩(wěn)定,這是由于溶液酶在強酸、強堿中,酶與底物的結(jié)合位點構(gòu)象被破壞,不能有效地結(jié)合底物,表現(xiàn)為活力大幅度下降;而固定化酶由于載體的保護(hù)作用,其結(jié)合位點構(gòu)象較穩(wěn)定,受酸堿的破壞程度降低,表現(xiàn)為耐酸堿能力增強。固定化酶的Km比溶液酶稍大,顯示固定化酶與底物的親和能力稍有下降。有文獻(xiàn)表明,Km值的下降主要由以下因素引起:①酶分子構(gòu)象的改變;②微環(huán)境的影響;③底物在載體和溶液間存在分配效應(yīng);④擴(kuò)散效應(yīng)的影響。本實驗結(jié)果與文獻(xiàn)報道內(nèi)容一致。酶固定化后,更易于回收利用,而酶回收實驗表明,本方法