不同龍眼品種的rapd分析

不同龍眼品種的rapd分析

龍眼來(lái)自中國(guó)。這是中國(guó)亞熱帶地區(qū)的特產(chǎn)水果。在我國(guó)南方部分省份（地區(qū)）的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著重要作用。龍眼品種繁多,不同地區(qū)存在同名異種或同品種異名的混亂情況,因此應(yīng)用新技術(shù)新方法對(duì)龍眼品種的分類(lèi)研究越來(lái)越受到重視。近年來(lái)國(guó)內(nèi)已有學(xué)者利用RAPD技術(shù)對(duì)福建和廣西的一些龍眼品種的親緣關(guān)系進(jìn)行了研究,并提出一些新的見(jiàn)解。四季蜜龍眼是肇慶科委龍眼研究所1995年從廣西引進(jìn)的新品系,已連續(xù)8a對(duì)其進(jìn)行了生物特性、經(jīng)濟(jì)性狀及適應(yīng)性的觀察和研究,發(fā)現(xiàn)該龍眼具有肉質(zhì)晶瑩嫩爽、味濃蜜甜等優(yōu)良性狀。與其他龍眼品種相比,四季蜜龍眼樹(shù)型緊湊,分枝力稍弱,葉形狹長(zhǎng)細(xì)小,具有特殊的成花特性。該龍眼在苗期及幼樹(shù)容易成花座果,成年樹(shù)一年中可以觀察到多次開(kāi)花的現(xiàn)象,成花無(wú)需低溫干旱條件,尤其以4-5月和8-9月成花較多,座果率較高。可見(jiàn),該龍眼同目前常規(guī)龍眼品種有較大的生物性狀差異,因此,分析它同常規(guī)龍眼品種的遺傳差異,對(duì)進(jìn)一步確定其起源與分類(lèi)地位,對(duì)以后品種的利用與繁育有著重要的意義。本實(shí)驗(yàn)以四季蜜龍眼及原產(chǎn)廣東、福建、廣西的9個(gè)龍眼品種為材料,利用RAPD(randomamplifiedpolymorphicDNA)技術(shù)分析它們之間的遺傳差異及親緣關(guān)系。1材料和方法1.1花溪縣力木樹(shù)果酒品種見(jiàn)圖2供試材料為龍眼DimocarpuslonganLour.葉片。10個(gè)龍眼品種為,四季蜜、古山二號(hào)、大烏圓、石硤、儲(chǔ)良、靈龍、松風(fēng)本、廣眼、龍優(yōu)和友誼,其中四季蜜、靈龍、松風(fēng)本、廣眼、龍優(yōu)和友誼采自肇慶市科委龍眼研究所種植園,古山二號(hào)、大烏圓、石硤、儲(chǔ)良采自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)龍眼圃。每個(gè)品種在不同位置采集3棵樹(shù)。1.2龍眼組dna的提取1.2.1一般ctag法參照Murray等(1980)方法。1.2.2改進(jìn)的ctaf方法參照丁曉東等(2000)方法,略加修改,增加抽提次數(shù),確保分離的DNA質(zhì)量。1.2.3sds法參照Dellaporta等(1983)方法。1.3naa酶系統(tǒng)使用了100條由上海博亞生物技術(shù)公司生產(chǎn)的10堿基隨機(jī)引物,Taq酶和dNTP均購(gòu)置于北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司。25μL反應(yīng)體系中有100ng模板DNA、200μmol/LdNTP、0.2μmol/L引物、2mmol/LMg2+、2UTaq酶。反應(yīng)參數(shù)為94℃預(yù)變性5min;94℃變性10s,36℃復(fù)性30s,72℃延伸1min,40個(gè)循環(huán);72℃延伸5min。擴(kuò)增后產(chǎn)物在w=1.2%瓊脂糖凝膠上電泳(加EB至0.5μg/mL)分離,凝膠成像儀成像。1.4dna片段聚合酶nx多態(tài)性RAPD帶的表示方法是用1表示強(qiáng)帶和可重復(fù)出現(xiàn)的弱帶,0表示無(wú)帶或不能重復(fù)出現(xiàn)的弱帶。由此計(jì)算出品種x和y之間的遺傳距離其中,Nx表示樣品x有而y沒(méi)有的DNA擴(kuò)增片段數(shù),Ny表示樣品y有而x沒(méi)有的DNA擴(kuò)增片段數(shù),Nxy則表示樣品x和y共有的DNA片段數(shù)。使用軟件RAPDistance,采用UPGMA法進(jìn)行聚類(lèi)分析并構(gòu)建遺傳樹(shù)。2結(jié)果與討論2.1sds法與ctab法比較龍眼等熱帶果樹(shù)的組織細(xì)胞中含有大量的多酚、多糖、原花色素、單寧等次生代謝物,為了提取高質(zhì)量的DNA,嘗試了多種基因組DNA提取方法。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)(圖1),常規(guī)的CTAB法和改進(jìn)的CTAB法所提取的龍眼基因組DNA電泳差異不大,但作為RAPD反應(yīng)模板,前者往往擴(kuò)增不出譜帶或擴(kuò)增出的帶很少。而常規(guī)SDS法所提取的龍眼基因組DNA產(chǎn)量高,但是DNA沉淀為深褐色,難溶解,A260/A280比值偏低,不能用于做酶切和RAPD擴(kuò)增。改進(jìn)的CTAB法優(yōu)點(diǎn)在于細(xì)胞核完全裂解之前,用核分離液去除細(xì)胞質(zhì)中的多糖和酚類(lèi)物質(zhì),以免它們與DNA共沉淀,影響DNA的質(zhì)量。該方法也被應(yīng)用于荔枝的基因組DNA提取。2.2rad擴(kuò)展2.2.1rapd反應(yīng)體系中模板量的確定從常規(guī)的RAPD反應(yīng)條件入手,以龍眼基因組DNA為反應(yīng)模板,對(duì)RAPD反應(yīng)的條件進(jìn)行了優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)模板量在100~150ng時(shí)擴(kuò)增效果較好,而一般的RAPD反應(yīng)體系中模板量為5~10ng時(shí)就可以獲得良好的擴(kuò)增結(jié)果,這可能同DNA模版質(zhì)量有關(guān)。在RAPD反應(yīng)條件上我們使用了優(yōu)化的RAPD反應(yīng)條件,優(yōu)化后的RAPD反應(yīng)擴(kuò)增出的帶在凝膠電泳后更為清晰明亮。2.2.2不同種類(lèi)龍眼的遺傳多樣性使用100條引物對(duì)10個(gè)龍眼品種(系)進(jìn)行RAPD擴(kuò)增。經(jīng)過(guò)篩選發(fā)現(xiàn),有15條引物擴(kuò)增失敗;有32條引物擴(kuò)增出具有多態(tài)性的DNA片段,占引物總數(shù)的32%,其中條帶清晰可用作RAPD結(jié)果分析的引物有18條(表1)。這18條引物G+C含量均在60%~70%,擴(kuò)增的位點(diǎn)數(shù)為5~11個(gè),供試的10個(gè)龍眼品種(系)共擴(kuò)增出了961條帶,DNA擴(kuò)增帶大小在0.25~4kb之間,其中多態(tài)性帶為393條,占擴(kuò)增總帶數(shù)的41.2%,說(shuō)明這10個(gè)品種(系)之間具有一定的多態(tài)性。其中,擴(kuò)增片段數(shù)最多的引物是AJ18(圖2-a),共擴(kuò)增出了72條帶,平均每個(gè)品種7.2條帶。擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)最多的引物是AH15(圖2-b),擴(kuò)增的位點(diǎn)數(shù)達(dá)11個(gè)。運(yùn)用軟件RAPDistance計(jì)算了樣品間的遺傳距離并應(yīng)用UPGMA法構(gòu)建了樹(shù)系圖(圖3)。從樹(shù)系圖中可以看出,熱帶龍眼四季蜜與其它常規(guī)龍眼品種的遺傳差異最大,在分類(lèi)上有一定的特殊地位。遺傳距離系數(shù)在0.8左右時(shí),可將10個(gè)龍眼品種分為3組:第1組僅含四季蜜。在我國(guó),研究者對(duì)熱帶龍眼的存在,一般抱審慎態(tài)度。而在泰國(guó),研究人員承認(rèn)存在熱帶龍眼和亞熱帶龍眼之分,前者主要起源于越南,在泰國(guó)中部的熱帶地區(qū)栽培。這類(lèi)的龍眼,葉片小,發(fā)梢弱,1a有2次成花,果實(shí)較小,已經(jīng)在泰國(guó)龍眼的反季節(jié)生產(chǎn)上應(yīng)用(Suranant,2000,個(gè)人通信)。四季蜜龍眼在生物性狀上同這類(lèi)龍眼有較大的相似,這可能同它的來(lái)源有關(guān),它的母樹(shù)位于廣西與越南交界的地區(qū)。要進(jìn)一步確認(rèn)熱帶龍眼的遺傳特征,需要采集更多這一類(lèi)型的龍眼進(jìn)行分析。第2組只含靈龍,是廣西培育的晚熟龍眼品種。第3組含其余8個(gè)常規(guī)龍眼品種。在第3組內(nèi),古山二號(hào)與其它7個(gè)品種差異較大。差異最小的是石硤和松風(fēng)本,大烏圓和廣眼,而它們各分在不同的亞組內(nèi)。這個(gè)結(jié)果與前人用同工酶分析的結(jié)果略有不同。李建光等把大烏圓和廣眼歸在不同的類(lèi)別中,認(rèn)為它們之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。肖艷等報(bào)道古山二號(hào)與石硤同工酶譜較相似,認(rèn)為它們?cè)谟H緣關(guān)系上較近。這種差異產(chǎn)生可能同應(yīng)用不同分析方法,以及品種采集差異有關(guān)。已經(jīng)有報(bào)道,應(yīng)用同工酶分析品種差異,存在較大的技術(shù)局限性,而且該方法可提供分析的遺傳位點(diǎn)極有限,較多研究者已經(jīng)轉(zhuǎn)向應(yīng)用RAPD、AFLP(amplifiedfragmentlengthpolymorphism)等新的分子生物學(xué)技術(shù)方法分析品種的遺傳差異。應(yīng)用RAPD技術(shù)進(jìn)行分析,只要嚴(yán)格控制反應(yīng)條件和選擇適合的分析軟件,是完全可以得到可重復(fù)驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在本研究中,還應(yīng)用了PHYLIP軟件構(gòu)建這10個(gè)品種的樹(shù)系圖發(fā)現(xiàn),以上結(jié)果都得到支持,只是其中個(gè)別品種分類(lèi)細(xì)節(jié)略有差別(結(jié)果未發(fā)表)。2.2.3儲(chǔ)良龍眼的篩選從擴(kuò)增的DNA圖譜中,找