不同龍眼品種的rapd分析

不同龍眼品種的rapd分析

龍眼來自中國。這是中國亞熱帶地區(qū)的特產(chǎn)水果。在我國南方部分省份（地區(qū)）的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著重要作用。龍眼品種繁多,不同地區(qū)存在同名異種或同品種異名的混亂情況,因此應(yīng)用新技術(shù)新方法對龍眼品種的分類研究越來越受到重視。近年來國內(nèi)已有學者利用RAPD技術(shù)對福建和廣西的一些龍眼品種的親緣關(guān)系進行了研究,并提出一些新的見解。四季蜜龍眼是肇慶科委龍眼研究所1995年從廣西引進的新品系,已連續(xù)8a對其進行了生物特性、經(jīng)濟性狀及適應(yīng)性的觀察和研究,發(fā)現(xiàn)該龍眼具有肉質(zhì)晶瑩嫩爽、味濃蜜甜等優(yōu)良性狀。與其他龍眼品種相比,四季蜜龍眼樹型緊湊,分枝力稍弱,葉形狹長細小,具有特殊的成花特性。該龍眼在苗期及幼樹容易成花座果,成年樹一年中可以觀察到多次開花的現(xiàn)象,成花無需低溫干旱條件,尤其以4-5月和8-9月成花較多,座果率較高?？梢?該龍眼同目前常規(guī)龍眼品種有較大的生物性狀差異,因此,分析它同常規(guī)龍眼品種的遺傳差異,對進一步確定其起源與分類地位,對以后品種的利用與繁育有著重要的意義。本實驗以四季蜜龍眼及原產(chǎn)廣東、福建、廣西的9個龍眼品種為材料,利用RAPD(randomamplifiedpolymorphicDNA)技術(shù)分析它們之間的遺傳差異及親緣關(guān)系。1材料和方法1.1花溪縣力木樹果酒品種見圖2供試材料為龍眼DimocarpuslonganLour.葉片。10個龍眼品種為,四季蜜、古山二號、大烏圓、石硤、儲良、靈龍、松風本、廣眼、龍優(yōu)和友誼,其中四季蜜、靈龍、松風本、廣眼、龍優(yōu)和友誼采自肇慶市科委龍眼研究所種植園,古山二號、大烏圓、石硤、儲良采自華南農(nóng)業(yè)大學龍眼圃。每個品種在不同位置采集3棵樹。1.2龍眼組dna的提取1.2.1一般ctag法參照Murray等(1980)方法。1.2.2改進的ctaf方法參照丁曉東等(2000)方法,略加修改,增加抽提次數(shù),確保分離的DNA質(zhì)量。1.2.3sds法參照Dellaporta等(1983)方法。1.3naa酶系統(tǒng)使用了100條由上海博亞生物技術(shù)公司生產(chǎn)的10堿基隨機引物,Taq酶和dNTP均購置于北京鼎國生物技術(shù)公司。25μL反應(yīng)體系中有100ng模板DNA、200μmol/LdNTP、0.2μmol/L引物、2mmol/LMg2+、2UTaq酶。反應(yīng)參數(shù)為94℃預(yù)變性5min;94℃變性10s,36℃復性30s,72℃延伸1min,40個循環(huán);72℃延伸5min。擴增后產(chǎn)物在w=1.2%瓊脂糖凝膠上電泳(加EB至0.5μg/mL)分離,凝膠成像儀成像。1.4dna片段聚合酶nx多態(tài)性RAPD帶的表示方法是用1表示強帶和可重復出現(xiàn)的弱帶,0表示無帶或不能重復出現(xiàn)的弱帶。由此計算出品種x和y之間的遺傳距離其中,Nx表示樣品x有而y沒有的DNA擴增片段數(shù),Ny表示樣品y有而x沒有的DNA擴增片段數(shù),Nxy則表示樣品x和y共有的DNA片段數(shù)。使用軟件RAPDistance,采用UPGMA法進行聚類分析并構(gòu)建遺傳樹。2結(jié)果與討論2.1sds法與ctab法比較龍眼等熱帶果樹的組織細胞中含有大量的多酚、多糖、原花色素、單寧等次生代謝物,為了提取高質(zhì)量的DNA,嘗試了多種基因組DNA提取方法。實驗中發(fā)現(xiàn)(圖1),常規(guī)的CTAB法和改進的CTAB法所提取的龍眼基因組DNA電泳差異不大,但作為RAPD反應(yīng)模板,前者往往擴增不出譜帶或擴增出的帶很少。而常規(guī)SDS法所提取的龍眼基因組DNA產(chǎn)量高,但是DNA沉淀為深褐色,難溶解,A260/A280比值偏低,不能用于做酶切和RAPD擴增。改進的CTAB法優(yōu)點在于細胞核完全裂解之前,用核分離液去除細胞質(zhì)中的多糖和酚類物質(zhì),以免它們與DNA共沉淀,影響DNA的質(zhì)量。該方法也被應(yīng)用于荔枝的基因組DNA提取。2.2rad擴展2.2.1rapd反應(yīng)體系中模板量的確定從常規(guī)的RAPD反應(yīng)條件入手,以龍眼基因組DNA為反應(yīng)模板,對RAPD反應(yīng)的條件進行了優(yōu)化。實驗中發(fā)現(xiàn)模板量在100~150ng時擴增效果較好,而一般的RAPD反應(yīng)體系中模板量為5~10ng時就可以獲得良好的擴增結(jié)果,這可能同DNA模版質(zhì)量有關(guān)。在RAPD反應(yīng)條件上我們使用了優(yōu)化的RAPD反應(yīng)條件,優(yōu)化后的RAPD反應(yīng)擴增出的帶在凝膠電泳后更為清晰明亮。2.2.2不同種類龍眼的遺傳多樣性使用100條引物對10個龍眼品種(系)進行RAPD擴增。經(jīng)過篩選發(fā)現(xiàn),有15條引物擴增失敗;有32條引物擴增出具有多態(tài)性的DNA片段,占引物總數(shù)的32%,其中條帶清晰可用作RAPD結(jié)果分析的引物有18條(表1)。這18條引物G+C含量均在60%~70%,擴增的位點數(shù)為5~11個,供試的10個龍眼品種(系)共擴增出了961條帶,DNA擴增帶大小在0.25~4kb之間,其中多態(tài)性帶為393條,占擴增總帶數(shù)的41.2%,說明這10個品種(系)之間具有一定的多態(tài)性。其中,擴增片段數(shù)最多的引物是AJ18(圖2-a),共擴增出了72條帶,平均每個品種7.2條帶。擴增位點數(shù)最多的引物是AH15(圖2-b),擴增的位點數(shù)達11個。運用軟件RAPDistance計算了樣品間的遺傳距離并應(yīng)用UPGMA法構(gòu)建了樹系圖(圖3)。從樹系圖中可以看出,熱帶龍眼四季蜜與其它常規(guī)龍眼品種的遺傳差異最大,在分類上有一定的特殊地位。遺傳距離系數(shù)在0.8左右時,可將10個龍眼品種分為3組:第1組僅含四季蜜。在我國,研究者對熱帶龍眼的存在,一般抱審慎態(tài)度。而在泰國,研究人員承認存在熱帶龍眼和亞熱帶龍眼之分,前者主要起源于越南,在泰國中部的熱帶地區(qū)栽培。這類的龍眼,葉片小,發(fā)梢弱,1a有2次成花,果實較小,已經(jīng)在泰國龍眼的反季節(jié)生產(chǎn)上應(yīng)用(Suranant,2000,個人通信)。四季蜜龍眼在生物性狀上同這類龍眼有較大的相似,這可能同它的來源有關(guān),它的母樹位于廣西與越南交界的地區(qū)。要進一步確認熱帶龍眼的遺傳特征,需要采集更多這一類型的龍眼進行分析。第2組只含靈龍,是廣西培育的晚熟龍眼品種。第3組含其余8個常規(guī)龍眼品種。在第3組內(nèi),古山二號與其它7個品種差異較大。差異最小的是石硤和松風本,大烏圓和廣眼,而它們各分在不同的亞組內(nèi)。這個結(jié)果與前人用同工酶分析的結(jié)果略有不同。李建光等把大烏圓和廣眼歸在不同的類別中,認為它們之間的親緣關(guān)系較遠。肖艷等報道古山二號與石硤同工酶譜較相似,認為它們在親緣關(guān)系上較近。這種差異產(chǎn)生可能同應(yīng)用不同分析方法,以及品種采集差異有關(guān)。已經(jīng)有報道,應(yīng)用同工酶分析品種差異,存在較大的技術(shù)局限性,而且該方法可提供分析的遺傳位點極有限,較多研究者已經(jīng)轉(zhuǎn)向應(yīng)用RAPD、AFLP(amplifiedfragmentlengthpolymorphism)等新的分子生物學技術(shù)方法分析品種的遺傳差異。應(yīng)用RAPD技術(shù)進行分析,只要嚴格控制反應(yīng)條件和選擇適合的分析軟件,是完全可以得到可重復驗證的實驗結(jié)果。在本研究中,還應(yīng)用了PHYLIP軟件構(gòu)建這10個品種的樹系圖發(fā)現(xiàn),以上結(jié)果都得到支持,只是其中個別品種分類細節(jié)略有差別(結(jié)果未發(fā)表)。2.2.3儲良龍眼的篩選從擴增的DNA圖譜中,找