主栽發(fā)酵型發(fā)酵型發(fā)酵質(zhì)量指標(biāo)下的發(fā)酵應(yīng)用遺傳多樣性分析

主栽發(fā)酵型發(fā)酵型發(fā)酵質(zhì)量指標(biāo)下的發(fā)酵應(yīng)用遺傳多樣性分析

芋頭主要種植在熱帶地區(qū)，是東南亞和太平洋地區(qū)的重要作物。芋頭的種植量在食根作物中位于馬鈴薯、木薯、甘薯和山藥之后,位列第五。據(jù)國際糧農(nóng)組織2011年報告,2009年世界芋頭產(chǎn)量1100萬t,中國的產(chǎn)量位列第二;2008年中國芋頭出口位列第一,每年4.9萬t。芋頭依食用部位不同,分為葉用變種及球莖變種。球莖變種主要分為2種類型:魁芋類和多子芋類。芋頭是高度多態(tài)性的物種,進(jìn)行無性繁殖,為異花受粉。已存在的大多數(shù)品種至少是部芋頭疫病由卵菌門的芋疫霉菌(PhytophthoracolocasiaeRacib)侵染所致。疫病是芋頭生產(chǎn)過程中的一種主要限制因素,可引起芋頭減產(chǎn)25%~30%。國外已有許多收集芋頭品種,并鑒定其疫病抗性的報道,已從芋頭品種中鑒定出9種抗疫病的基因,用AFLP對印度芋頭品種進(jìn)行了遺傳多樣性分析,并找到了與疫霉病抗性基因連鎖的分子標(biāo)記。國內(nèi)還未見芋頭品種抗疫病的報道。本研究對從廣東、廣西、湖南和湖北等主要芋頭產(chǎn)區(qū)收集芋頭品種進(jìn)行了疫病的抗病性鑒定,并用SSR對這些抗性芋頭材料進(jìn)行了遺傳多樣性分析,旨在促進(jìn)芋頭品種的遺傳改良和保存其種質(zhì)資源。1材料和方法1.1從芋頭品種中收集食物從廣東、廣西、湖南和湖北等主要芋頭產(chǎn)區(qū)收集芋頭栽培品種和野生種,種植于廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院實驗田中。1.2培養(yǎng)菌株為疫霉菌芋頭疫霉菌的分離參考李智軍等的方法。從芋頭發(fā)病田塊采集具有芋頭疫病典型癥狀的病葉,切取病健交接部位2~3小塊,置于含抗生素胡蘿卜培養(yǎng)基(CA)平板(青霉素50mg、利福平100mg、胡蘿卜200g榨汁、瓊脂20g/L)上,25-28℃培養(yǎng)2d后,挑取菌落邊緣菌絲少許,轉(zhuǎn)接至不含任何藥劑的CA培養(yǎng)基上在同樣溫度條件下培養(yǎng)3-5d。經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察培養(yǎng)菌為疫霉菌。保存菌種作抗病性鑒定。1.3病斑直徑測定用疫霉菌來鑒定不同品種的疫病抗性,鑒定方法參考Brooks的方法,并加以改進(jìn)。具體如下:將培養(yǎng)3~5d的疫霉菌用打孔器打直徑為0.5cm的菌塊。選第二或第三最嫩的葉片,在葉片的背面,接種一菌塊,用透明膠成十字型封住菌塊,接種5d后,測定病斑的直徑,以此作為芋頭抗疫霉菌的標(biāo)準(zhǔn)。每個材料接種4張葉片,選擇一致性較好的3張葉片測量病斑直徑?？共¤b定于2011和2012年在廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院實驗基地進(jìn)行。1.4饅頭ssr標(biāo)記擴(kuò)增多態(tài)性選擇抗病品種和部分感病品種,用改進(jìn)的CTAB法提取基因組DNA。調(diào)整各DNA的濃度至10ng/μL。根據(jù)Emma等開發(fā)的芋頭SSR標(biāo)記,選擇擴(kuò)增效果好、在芋頭上有多態(tài)性、及擴(kuò)增等位基因數(shù)少的SSR引物進(jìn)行芋頭遺傳多樣性分析。所選擇的SSR標(biāo)記見表1。將有某一等位基因條帶記作1,沒有該某一等位基因條帶記為0。利用軟件NTSYS計算材料兩兩間的相似系數(shù),并進(jìn)行聚類分析。2結(jié)果與分析2.1感病品種的確定將2a抗病性結(jié)果分別進(jìn)行單因素方差分析,2011年和2012年的F值分別為22.75和22.53,均比F62,124=1.45大,說明各品系間抗病性差異顯著。參考Singh等離體鑒定芋頭對疫病的抗性指標(biāo),將田間芋頭抗病性的標(biāo)準(zhǔn)定為:直徑大于40mm為感病,31~40mm為中等抗病,小于20mm為抗病。如果2a的直徑差別不超過20mm,但直徑跨越2個抗性標(biāo)準(zhǔn)區(qū)間,取平均值后確定其抗性;如果2a的結(jié)果差別超過20mm,其抗性定為未知(表2)。在這些品系中,抗病品系只有6個,分別為廣州-2、江門-2、湛江-5、湛江-6、湛江-9、北海-1,占9.5%;中抗9個,分別為高州-1、連州-1、羅定-2、梅州-2、汕頭-3、遂溪-2、吳川-1、賀州-2和興安-2,占14.3%;感病品系42個,占66.7%;有6個品系2年鑒定的結(jié)果差別較大,因此將其抗性定為未知。這些抗性品系中,江門-2為野生芋和湛江-5為食葉芋。其余13個抗病品系中,梅州-2、汕頭-3和吳川-1為魁芋,其余10個品系為多仔芋。2.2抗側(cè)品種聚類分析選取全部的抗病品系及分別代表不同地區(qū)的品系37個,用表1中的11對引物進(jìn)行遺傳多樣性分析,結(jié)果只有5對引物uq55-112、uq56-191、uq73-164、uq91-262和uq110-283能擴(kuò)增出多態(tài)性,一共可擴(kuò)增10條有多性條帶。其中uq73-164擴(kuò)增的結(jié)果如圖1所示。數(shù)據(jù)用軟件NTSYS進(jìn)行聚類分析后結(jié)果如圖2。聚類分析結(jié)果(圖2)表明,芋頭品系在聚類系數(shù)0.3左右時,芋頭品系可分為5個類群。在15個抗及中抗的品系中,10號江門-2為野生芋,37號湛江-5為食葉芋。它們的親緣關(guān)系較近,屬于第5類群,與其它類群的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。其余各抗病品系分屬其余4個類群。3討論3.1田間接種方法的確定采用2種抗病性鑒定指標(biāo),侵染頻率和病斑直徑,認(rèn)為離體葉片接種法是一種簡潔快速鑒定芋頭的疫病抗病性方法,接種后5d的病斑平均直徑是鑒定疫霉菌的有效指標(biāo)。Birhman和Singh也認(rèn)為病斑的大小是鑒定馬鈴薯晚疫病抗性最重要的指標(biāo)。離體抗性的鑒定結(jié)果并不總是很好地與田間鑒定的結(jié)果相吻合,其原因可能是芋頭的生長狀況、抗性鑒定的方法和病原物的差異。本研究在前人的基礎(chǔ),將田間接種的方法由接種一定濃度的疫霉菌孢子,改為接種直徑為0.5cm大小的菌塊。芋頭疫霉菌的鑒定指標(biāo)由發(fā)病葉片的百分率改為病斑直徑。該方法比原來芋頭疫霉菌接種方法更為簡便,可較準(zhǔn)確地鑒定出芋頭對疫霉菌的抗性。在抗病性鑒定過程中,2a的抗病性鑒定結(jié)果大多數(shù)相吻合,但還有少數(shù)品種的抗病性在2a間有較大的差異,其原因可能是寄主的抗性,除取決于寄主本身,還受地上部菌原量和環(huán)境條件(溫濕度、土壤、塊莖在土壤中分布)、栽培措施等多種因素制約。3.2ssr標(biāo)記多態(tài)性分析我國芋頭主產(chǎn)區(qū)珠江流域、長江及淮河流域,有大量的芋頭品種。許多種植者不知道所種植的芋頭品種的名稱,這不利于芋頭品種的收集、抗病性鑒定及核心種質(zhì)資料庫的建立。國外在建立芋頭的核心種質(zhì)資源庫時,使用顯性的穩(wěn)定的農(nóng)業(yè)性狀可對芋頭品系進(jìn)行初步分類。在此基礎(chǔ)上,可進(jìn)一步利用分子標(biāo)記,對這些品系進(jìn)行遺傳多樣性分析,在保證遺傳多樣性的前題條件下,極大地減少所需保存的芋頭品種。因此有人用形態(tài)學(xué)標(biāo)記,輔助以AFLP標(biāo)記或RAPD標(biāo)記對芋頭進(jìn)行了分類從而建立核心種質(zhì)資源。與AFLP、RAPD標(biāo)記相比,SSR標(biāo)記具有更加簡便、可靠及共顯性等特征,因此國外有人利用形態(tài)學(xué)性狀和SSR標(biāo)記對芋頭進(jìn)行了分類從而建立核心種質(zhì)資源。本研究從我國南方4個主要芋頭種植區(qū)收集了100多個芋頭品系,經(jīng)根據(jù)形態(tài)學(xué)性狀初步將芋頭進(jìn)行了選擇,將芋頭品系減少到60多個,并進(jìn)行了疫病的抗病性鑒定。篩選出8個抗或中抗的品系,這些品系可直接用于生產(chǎn)上來防治芋頭疫病,或作為抗源加以利用,它們還為進(jìn)一步研究芋頭抗病的分子機(jī)理提供材料。