腫瘤干細胞培養(yǎng)技術(shù)

腫瘤干細胞培養(yǎng)技術(shù)隨著干細胞生物學(xué)以及腫瘤學(xué)研究的不斷深入，腫瘤干細胞已成為當(dāng)前腫瘤研究的熱點。腫瘤干細胞的體外培養(yǎng)在腫瘤干細胞研究領(lǐng)域具有不可替代的重要地位，通過分離、純化及培養(yǎng)腫瘤干細胞可以對其生物學(xué)特性如異質(zhì)性、腫瘤的演化、轉(zhuǎn)移和抗藥性等進行研究，為腫瘤的早期診斷與治療提供了新的思路和策略。腫瘤干細胞的體外培養(yǎng)多采用無血清培養(yǎng)基(serumfreemedium,SFM)，根據(jù)不同的細胞類型加入適當(dāng)?shù)募毎蜃勇?lián)合培養(yǎng)以防止其分化。腫瘤細胞系或者是臨床腫瘤組織聯(lián)合采用機械和膠原酶消化腫瘤組織得到單細胞懸液，經(jīng)過流式細胞儀或者免疫磁珠分選的方法得到腫瘤干細胞使用無血清培養(yǎng)基在379,5%CO2飽和濕度的條件下進行體外培養(yǎng),但值得注意的是臨床腫瘤組織的獲取應(yīng)該越新鮮越好,最好是在外科手術(shù)后1小時內(nèi)進行處理否則將影響腫瘤干細胞細胞的活性,不利于體外培養(yǎng)。無血清培養(yǎng)基有很多種,針對不同的細胞類型有專門的無血清營養(yǎng)液出售。無血清培養(yǎng)基具有以下的優(yōu)點：各批產(chǎn)品之間成分相對明確、質(zhì)量相對一致；便于控制培養(yǎng)的生理環(huán)境；特殊細胞類型的優(yōu)化配方有利于提高細胞的穩(wěn)定性,使不同類型的細胞能在最有利于各自生長的環(huán)境中持續(xù)傳代培養(yǎng)；依據(jù)不同類型的細胞、甚至不同的細胞系(株)都可能有各自的無血清培養(yǎng)基?？偟膩碚f可以分為基礎(chǔ)營養(yǎng)基及附加成分兩大部分［1］?；A(chǔ)培養(yǎng)基一般采用人工合成的培養(yǎng)基主要有DMEM、DMEM/F12、UltraCULTURETM、神經(jīng)干細胞專用無血清培養(yǎng)基、黑色素瘤專用培養(yǎng)基等其中以DMEM/F12(1:1,Invitrogen)最為常用。附加成分是指在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入各種不同細胞生長所需的營養(yǎng)成分，包括①營養(yǎng)因子：胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和亞硒酸鈉、牛血清白蛋白、B27、L■谷氨酰胺；②細胞因子：白血病抑制因子、表皮生長因子、成纖維細胞生長因子、神經(jīng)生長因子、血小板衍化生長因子等。使用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞經(jīng)胰酶消化傳代后不使用血清終止胰酶的作用,可使用0.1%－0.5%大豆胰酶抑制劑(soybeantrypsininhibitor)。一、腫瘤干細胞培養(yǎng)中幾種常見的細胞因子(―)白血病抑制因子LIF(leukemininhibitoryfactor丄IF)是白介素6(IL-6)細胞因子家族中的一員，是典型的多功能生長因子，具有多種生物學(xué)功能：對細胞生長、增殖與分化有著廣泛的作用，抑制分化促進干細胞增殖。胚胎干細胞的體外培養(yǎng)需要添加LIF以抑制其分化，維持其多能性。LIF可抑制成纖維細胞生長因子(FibroblastGrowthFactor,FGF)、B轉(zhuǎn)移生長因子(B-transformingGrowthFactor,TGFB)和葉酸(RetinoicAcid,RA)誘導(dǎo)的細胞分化。干細胞因子(stemcellfactor,SCF)又稱肥大細胞生長因子(MGF),Kit配體(KL)及Steel因子(SLF),SCF可以誘導(dǎo)干和祖細胞增生。SCF主要由腦、肝臟、骨髓、胎盤等組織(尤其骨髓)中的基質(zhì)細胞、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞、肝細胞產(chǎn)生。SCF是一種作用于最早期造血干祖細胞的造血細胞因子，在維持造血及肥大細胞存活、促進造血細胞增殖和分化、調(diào)控各系造血細胞的生長發(fā)育過程中起著重要作用。表皮生長因子(epidermalgrowthfactor,EGF)是含有53個氨基酸的多肽,早期研究中發(fā)現(xiàn)其有剌激表皮細胞生長的作用,是表皮細胞培養(yǎng)的最常用的添加因子之一OEGF可顯著促使細胞分裂、增殖，在一定濃度范圍內(nèi)(5~2Ong/ml),隨EGF濃度提高，效應(yīng)加強。堿性成纖維細胞生長因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)1975年Gospodarowicz及其同事從牛大腦和垂體中分離純化出一種分子量為16-18kD由146個氨基酸組成的陽離子多肽，并將其命名為成纖維細胞生長因子。bFGF具有多種生物學(xué)功能，可以促進和調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞、上皮細胞、和神經(jīng)膠質(zhì)細胞等多種起源于中胚層、神經(jīng)外胚層源性的許多種細胞的增殖和分化。二、腫瘤干細胞目前腫瘤干細胞已經(jīng)在多種腫瘤細胞系以及白血病、腦瘤、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、肝癌、肺癌等多種腫瘤組織中分離鑒定和培養(yǎng)。不同組織來源的腫瘤特性不同的，培養(yǎng)條件也不完全相同，本章就已有報道的從不同腫瘤細胞系或者腫瘤組織分離的腫瘤干細胞的體外培養(yǎng)體系加以闡述，在實際操作中讀者需要經(jīng)過摸索才能針對不同的腫瘤干細胞建立穩(wěn)定的體外培養(yǎng)條件。白血病干細胞ALL急性淋巴細胞白血病干細胞(CD34+/CD10-/CD19-)采用懸浮培養(yǎng)體系培養(yǎng)［2］。ALL急性淋巴細胞白血病患者來源的骨髓用Ficoll分離得到單個核細胞(MNC)，使用IMDM(Gibco)添加50%FCS(Gibco)和10%DMSO二甲基亞砜(ManorParkPharmaceuticals)凍存液將分離得到的MNC在液氮中備用。培養(yǎng)時以5x105個/mL密度接種在IMDM無血清培養(yǎng)基中，添加了10pg/mL人胰島素，200》g/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白(Sigma-Aldrich)和2%HAS。使用時以下兩組生長因子任選其一：①20ng/mL重組人Fms樣酪氨酸激酶3(rhFlt3)配體、20ng/mL重組人白介素3(rhlL-3)、20ng/mLrhlL-6、20ng/mLrhGM-CSF、20ng/mLrhG-CSF和50ng/mLSCF。②20ng/mLrhlL-3、10ng/mLrhIL-7和50ng/mLSCF(R&DSystems)。每周半量換液一次，培養(yǎng)6周后收集細胞用于細胞遺傳學(xué)和形態(tài)學(xué)分析。乳腺癌干細胞乳腺癌干細胞培養(yǎng)多參考MaxWicha及其同事建立的人乳腺上皮干/祖細胞體外懸浮培養(yǎng)體系［3］，在無血清培養(yǎng)基中乳腺上皮干細胞呈懸浮非分化形式生長，我們稱之為乳腺干細胞球。原代培養(yǎng)時在超低粘附板(Corning)以20000個/mL活性細胞傳代時以1000個/mL密度進行培養(yǎng)。無血清培養(yǎng)基選擇無血清乳腺上皮生長培養(yǎng)基MEGM(BioWhittaker)，添加了B27(Invitrogen)、20ng/mlEGF、20ng/mLbFGF(BDBiosciences)和4pg/mL肝磷脂(Sigma)，不添加牛垂體浸膏。乳腺干細胞球培養(yǎng)7-10天后用0.05%胰酶和0.53mMEDTA-4Na消化10分鐘(Invitrogen)，收集細胞到離心管中800rpm離心。離心后得到的細胞需通過40》m濾膜并且在顯微鏡下觀察是否為單個細胞。10000個單細胞懸液中兩個相連、三個相連、多個細胞相連的團塊數(shù)量應(yīng)該在30到150之間，如果細胞團大于＞100需要重復(fù)進行消化和過濾的步驟。外科手術(shù)得到乳腺癌實體瘤中乳腺癌干細胞(CD44+/CD24/low)的培養(yǎng)需要在手術(shù)后30分鐘內(nèi)對乳腺癌標(biāo)本進行處理，在膠原酶(Roche)和透明質(zhì)酸(Sigma)按1:1比例配成的消化液中379消化2小時后通過30》m濾膜后得到單細胞懸液。以1000個/mL無血清DMEM-F12(Cambrex),添加10ng/mLbFGF、20ng/mLEGF、5》g/mL胰島素和0.4%牛血清白蛋白(Sigma)。細胞在上述培養(yǎng)基中呈懸浮球狀細胞團生長每隔3天使用胰酶?EDTA消化2分鐘后傳代［4］。乳腺癌細胞系MCF-7和MDA-MB-231中分離得到乳腺癌干細胞(CD24/low/CD44+)，收集細胞500g離心5分鐘，使用Hanks'緩沖鹽溶液洗滌后以1000個/mL重懸于無酚磺酞的DMEM-F12(Cellgro)添加0.4%牛血清白蛋白BSA(Sigma)、5pg/mL牛胰島素(Sigma)、20ng/mLbFGF(Sigma)和10ng/mLEGF(Sigma)，每三天換液一次［5］。腦膠質(zhì)瘤臨床獲得的腫瘤標(biāo)本使用lympholyte-M(Cedarlane)去除紅細胞，在充氧的人工腦脊液中使用胰酶消化成單細胞懸液，總的來說，每份腫瘤標(biāo)本大概可以獲得2-5X106個細胞。腫瘤細胞使用TSM(tumorspheremedium)腫瘤細胞球培養(yǎng)基，添加20ng/ml重組人EGF(Sigma)、20ng/mlbFGF(Upstate)、10ng/mlLIF(Chemicon)、1X神經(jīng)元存活因子NSF(Clonetics)和60pg/mlN-乙酰半胱氨酸(Sigma),使用60-mm細胞培養(yǎng)板進行培養(yǎng)確?；罴毎麛?shù)量為3X106。原代培養(yǎng)三天后免疫磁珠分選得到CD133+腦膠質(zhì)瘤干細胞，使用上述細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)［6］。也有學(xué)者從臨床腫瘤組織獲得的單個腫瘤細胞懸液在Neurobasal培養(yǎng)基(Invitrogen)，添加2mML-谷氨酰胺、N2(Invitrogen)、B27(Invitrogen)、20ng/mlhrEGF(Invitrogen)、20ng/mlhrbFGF(Invitrogen)和50mg/mlBSA。實驗中使用的細胞應(yīng)該在4代之內(nèi)，分選得到的Nestin+/CD133+細胞即為腦腫瘤干細胞⑺。大鼠膠質(zhì)瘤細胞系C6采用SP分選的方法得到腦膠質(zhì)瘤干細胞［8］,在100-mm培養(yǎng)盤中(Nunc)使用無血清的DMEM培養(yǎng)添加了10pg/ml牛胰島素、100pg/ml人轉(zhuǎn)鐵蛋白、100pg/mlBSA、60ng/ml黃體激素、16pg/ml四甲烯二胺、40ng/ml亞硒酸鈉、63pg/mlN-乙酰半胱氨酸、5pM血小板凝集抑制劑forskolin、50units/ml青霉素、50pg/ml鏈霉素(GIBCO)、10ng/mlbFGF和10ng/mlPDGF。大鼠膠質(zhì)瘤細胞系9L,無血清NSC增殖培養(yǎng)基采用DMEM/F12添加20ng/mlEGF(Peprotech)和bFGF(Peprotech)、50ng/ml肝磷脂、1XB27(Gibco)。每隔兩天換液一次。當(dāng)腫瘤細胞球達到 100-200個時使用0.1%胰酶和1XEDTA(Gibco)37°C消化10分鐘。通過25》m細胞濾膜(BDBiosciences)以1000個/ml密度接種在添加促有絲分裂劑的NSC培養(yǎng)基中每隔兩天換液一次，18天后可以進行細胞的傳代，培養(yǎng)的細胞球即為具有化療抵抗和侵襲能力的腫瘤干細胞樣細胞［9］。黑色素瘤原代培養(yǎng)轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細胞，外科手術(shù)獲得的腫瘤組織在1－2小時內(nèi)處理，沖洗腫瘤組織去除表面壞死組織后1mg/mLIV型膠原酶(Invitrogen)DMEM中4°C消化4-6小時，得到的單細胞懸液用HBSS洗滌后種在非粘附性的培養(yǎng)板中，使用以下兩種培養(yǎng)基①小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)-人胚胎干細胞(hESC)營養(yǎng)液，并且添加4ng/mLbFGF。②使用黑色素瘤培養(yǎng)液建立黑色素瘤細胞系由以下成分組成MCDB153培養(yǎng)基(Sigma)、L15(Invitrogen)、2%FCS、5pg/mL胰島素(Sigma)、15pg/mL牛垂體浸膏(Cambrex)、1.68mmol/L氯化鈣和5ng/mLEGF(Sigma)。建立的WM115andWM239A黑色素瘤細胞系使用Mel2%培養(yǎng)液不加垂體浸膏和EGF。在hESC培養(yǎng)基采用有限稀釋的方法從原代培養(yǎng)的細胞中培養(yǎng)黑色素瘤細胞［10］，盡管單個細胞增殖能力有限，兩個單個原代培養(yǎng)的細胞經(jīng)培養(yǎng)可以形成新的腫瘤細胞球，7-10天后以1000個/mL密度消化傳代。黑色素瘤干細胞表面標(biāo)記為CD20+。分離自小鼠黑色素瘤細胞系B16F10中CD44+CD133+CD24+腫瘤干細胞在無血清培養(yǎng)基中添加20pg/LEGF、20pg/LbFGF和100U/ml青霉素G和100》g/ml鏈霉素［11］。結(jié)腸癌干細胞臨床結(jié)腸癌標(biāo)本使用機械和酶消化得到單細胞懸液，流式或免疫磁珠分選的CD133+細胞被認(rèn)為是腫瘤干細胞并使用無血清營養(yǎng)液培養(yǎng)培養(yǎng)［12］，添加20ng/mlEGF和10ng/mlFGF-2。為了獲得原代培養(yǎng)的腫瘤細胞在酶消化后將細胞種到膠原包被的培養(yǎng)板種營養(yǎng)液為添加了10%FCS的DMEM。前列腺癌干細胞前列腺癌組織中分離腫瘤干細胞：人前列腺癌組織在征得病人的同意下從40個病人根治性前列腺切除術(shù)中獲得腫瘤標(biāo)本。前列腺癌通過組織學(xué)檢查而確認(rèn)，有些使用的標(biāo)本是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶。從腫瘤組織中分離得到的CD44/a201hi/CD133+(同時也是正常前列腺上皮細胞的標(biāo)志)細胞并且在四個標(biāo)本中進行了長期培養(yǎng)一個活組織檢查為良性腫瘤。完全角(質(zhì))化細胞生長介質(zhì)培養(yǎng)基■角質(zhì)化細胞無血清培養(yǎng)基添加EGF和牛垂體浸膏(Invitrogen),此外還添加了2ng/mLLIF(Sigma)、2ng/mLSCF(Sigma)和100ng/mL霍亂毒素(Sigma)［13］。肺癌干細胞外科手術(shù)獲得肺癌腫瘤組織塊，沖洗去除表面血細胞后置于含有青霉素/鏈霉素和兩性霉素B的DMEM-F12中過夜以避免污染。20mg/mlII型膠原酶(Gibco-Invitrogen)37°C消化2小時。得到的細胞在無血清培養(yǎng)基中包括DMEM-F12(Gibco-Invitrogen)中添加50mg/ml胰島素,100mg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白,10mg/ml四甲烯二胺，0.03mM亞硒酸鈉，2mM黃體激素，0.6%葡萄糖，5mMHEPES,0.1%碳酸氫鈉，0.4%BSA，谷氨酰胺和抗生素，20mg/mlEGF和10mg/mlbFGF。用未經(jīng)過處理的細胞培養(yǎng)皿降低細胞的貼壁性來支持未分化的腫瘤細胞球的生長［14］。營養(yǎng)液每周換兩次直到形成懸浮細胞球。擴增培養(yǎng)是經(jīng)過機械地消化細胞球在完全新鮮的培養(yǎng)液中傳代單個活小的聚集物。CD133為肺癌干細胞標(biāo)記。卵巢癌小鼠乳腺癌細胞系MOVCAR7和4306在含有4%FBS(MIS-free)DMEM并添加了L-谷氨酰胺，1%青霉素/鏈霉素，1%胰島素■轉(zhuǎn)鐵蛋白■硒ITS(GIBCO)37°C,5%CO2,在T175培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)g。臨床標(biāo)本去除紅細胞后，10%FBSRPMI，1%青霉素/鏈霉素和1%兩性霉素。肝癌干細胞人肝癌細胞系HuH7細胞系中分選得到的SP細胞使用無血清培養(yǎng)基DMEM/Ham'sF-12(Invitrogen)中，作者口6］嘗試了添加干細胞因子SCF(Chemicon),血小板衍生的生長因PDGF(PeproTech),堿性成纖維生長因子bFGF(R&DSystems)和白血病抑制因子LIF(Chemicon)，最終確立了添加20ng/ml重組人LIF,可以有效的培養(yǎng)HuH7細胞系中的腫瘤干細胞。(十)鼻咽癌干細胞人鼻咽癌細胞系CNE-1、CNE-2等分選SP細胞即為鼻咽癌細胞干細胞，將分選后的細鼻咽癌干細胞ultraMEM培養(yǎng)基(cambrex)添加5％FBS，10ng/mlbFGF(sigma)和10ng/mlEGF(sigma)1mmol/LL-谷氨酰胺(sigma)50U/ml青霉素G和50pg/ml鏈霉素［仃】。干細胞培養(yǎng)最初用飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng)，其缺點為操作復(fù)雜，有多種交叉污染的風(fēng)險，目前較少采用。實際上飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng)發(fā)揮著關(guān)鍵作用的是飼養(yǎng)層細胞分泌多種細胞因子，因此，使用無血清培養(yǎng)基中添加一定量的LIF、EGF、bFGF等細胞因子完全可以取代飼養(yǎng)層細胞,抑制干細胞分化并維持其增殖。但是，由于干細胞在體外培養(yǎng)過程中存在自發(fā)分化趨勢，通常認(rèn)為干細胞包括胚胎、骨髓血、臍帶血干細胞以及腫瘤干細胞只能做短期培養(yǎng)，從而限制了干細胞的擴增和研究。AkioSoeda[i8等從臨床腦腫瘤組織中原代培養(yǎng)并建立了一^腦腫瘤干細胞系，腦腫瘤細胞在有血清培養(yǎng)基中貼壁單層培養(yǎng)后換無血清培養(yǎng)基仍可以形成新的細胞球并且移植到免疫缺陷鼠中有致瘤能力。重新形成的細胞球保持了干細胞特性，而且從中分離得到的單個腫瘤干細胞可以形成新的細胞球和腫瘤甚至可以在體外長期培養(yǎng)超過2年時間。這說明了腫瘤干細胞中有部分細胞在非貼壁或貼壁條件下傳代多次后仍然保持了干細胞的特性。胰腺癌、食管癌、頭頸部皮膚癌中腫瘤干細胞也已經(jīng)分離和鑒定但是到目前為止還未見有體外培養(yǎng)的報道。因此，如何建立穩(wěn)定的干細胞的體外培養(yǎng)條件，防止腫瘤干細胞的分化仍然是一個急需解決的問題。(江蘇大學(xué)徐學(xué)靜，錢暉)參考文獻：司徒鎮(zhèn)強，吳軍正主編。細胞培養(yǎng)。西安：世界圖書出版公司，2004.CoxCV,EvelyRS,OakhillA,PamphilonDH,GouldenNJ,BlairA.Characterizationofacutelymphoblasticleukemiaprogenitorcells.Blood,2004,104(9):2919-2925.DontuG,AbdallahWM,FoleyJM,JacksonKW,ClarkeMF,KawamuraMJ,WichaMS」nvitropropagationandtranscriptionalprofilingofhumanmammarystem/progenitorcells.GenesDev,2003,17(10):1253-1270.PontiD,CostaA,ZaffaroniN,PratesiG,PetrangoliniG,CoradiniD,PilottiS,PierottiMA,DaidoneMG.IsolationandInvitroPropagationofTumorigenicBreastCancerCellswithStem/ProgenitorCellProperties.CancerRes,2005,65(13):5506-5511.PhillipsTM,McBrideWH,PajonkF-TheResponseofCD24/low/CD44+BreastCancer-InitiatingCellstoRadiationJNatlCancerInst,2006,98(24):1777-1785.SinghSK,ClarkeID,TerasakiM,BonnVE,HawkinsC,SquireJ,DirksPB」dentificationofaCancerStemCellinHumanBrainTumors.CancerRes,2003,63(18):5821-5828.SinghSK,HawkinsC,ClarkeID,SquireJA,BayaniJ,HideT,HenkelmanRM,CusimanoMD,DirksPB」dentificationofhumanbraintumourinitiatingcells.Nature,2004,432(7015):396-401.KondoT,SetoguchiT,TagaT.Persisteneeofasmallsubpopulationofcancerstem-likecellsintheC6gliomacellline.ProcNatlAcadSciUSA,2004,101(3):781-786.GhodsAJ,IrvinD,LiuG,YuanX,AbdulkadirIR,TuniciP,KondaB,Wachsmann-HogiuS,BlackKL,YuJS.SpheresIsolatedfrom9LGliosarcomaRatCellLinePossessChemoresistantandAggressiveCancerStem-LikeCells.StemCells,2007,25(7):1645-1653.FangD,NguyenTK,LeishearK,FinkoR,KulpAN,HotzS,VanBellePA,XuX,ElderDE,HerlynM.ATumorigenicSubpopulationwithStemCellPropertiesinMelanomas.CancerRes,2005,65(20):9328-9337.DouJ,PanM,WenP,LiY,TangQ,ChuL,ZhaoF,JiangC,HuW,HuK,GuN.IsolationandIdentificationofCancerStem-LikeCellsfromMurineMelanomaCellLines.CellMolImmunol,2007,4(6):467-472.Ricci-VitianiL,LombardiDG,PilozziE,BiffoniM,TodaroM,PeschleC,DeMariaR.Identificationandexpansionofhumancolon-cancer-initiatingcells.Nature,2007,445(7123):111-115.CollinsAT,BerryPA,HydeC,StowerMJ,MaitlandNJ.ProspectiveIdentificationofTumorigenicProstateCancerStemCells.CancerRes,2005,65(23):10946-10951.EramoA,LottiF,SetteG,PilozziE,BiffoniM,DiVirgilioA,ConticelloC,RucoL,PeschleC,DeMariaR.Identificationandexpansionofth