生物：5.3《血紅蛋白的提取和分離》課件(新人教版選修1)

血紅蛋白含有四條肽鏈,每條肽鏈環(huán)繞一個亞鐵血紅素基團(tuán)，此基團(tuán)可攜帶一分子氧或一分子二氧化碳，血紅蛋白因含有血紅素而呈紅色。課題3血紅蛋白的提取和分離專題5DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)一、基礎(chǔ)知識:學(xué)生活動1:1、分離生物大分子的基本思路是什么？2、不同蛋白質(zhì)的特性在哪些方面存在差異？3、本課題我們將利用血紅蛋白與雜質(zhì)蛋白哪方面的差異進(jìn)行提純？4、為什么不用雞的血紅細(xì)胞而用人的血紅細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料？5、用什么方法分離相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)？一、基礎(chǔ)知識--蛋白質(zhì)提取和分離原理

蛋白質(zhì)提取與分離的依據(jù)－－蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)：形狀、大小、電荷性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)、親和力等千差萬別。提取分離方法凝膠色譜法

凝膠電泳法

（1）原理：（2）材料大分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動快；小分子穿過多孔凝膠顆粒的內(nèi)部，路程長，流動慢。多孔性的多糖類化合物，如葡聚糖、瓊脂糖。

(一)凝膠色譜法（3）分離過程

混合物上柱洗脫大分子流動快小分子流動慢收集大分子收集小分子

洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質(zhì)分子的差速流動。

(一)凝膠色譜法(一)凝膠色譜法㈠凝膠色譜法（分配色譜法）：1、什么是凝膠？2、什么是凝膠色譜法？學(xué)生活動2:3、凝膠色譜法的原理是什么？4、請用自己的話總結(jié)出凝膠色譜法分離相對分子質(zhì)量不同蛋白質(zhì)的具體過程。1、什么是緩沖液？2、緩沖液的作用是什么？學(xué)生活動3:3、緩沖液是如何配制的？你所學(xué)過的人體血液的緩沖物質(zhì)有哪些？4、本實(shí)驗(yàn)加的是什么緩沖液？為何要加緩沖液？（二）、緩沖溶液由弱酸和相應(yīng)的強(qiáng)堿弱酸鹽組成。如H2CO3/NaHCO3，醋酸/醋酸鈉，NaH2PO4/Na2HPO4等緩沖溶液－－洗脫劑組成：配制：作用：調(diào)節(jié)緩沖劑的比例，可配制不同pH的緩沖液。抵制外界酸堿對溶液pH的干擾而保持pH穩(wěn)定。（二）、緩沖溶液1、什么是電泳？2、影響電泳遷移速度的因素有哪些？學(xué)生活動4:4、電泳分離各種分子的原理是什么？

（三）、電泳3、如何消除電荷對電泳遷移速度的影響？5、請描述電泳的過程？2．凝膠電泳法：（1）原理：不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)、電量、形狀和大小不同，在電場中受到的作用力大小、方向、阻力不同，導(dǎo)致不同蛋白質(zhì)在電場中的運(yùn)動方向和運(yùn)動速度不同。

影響蛋白質(zhì)分子運(yùn)動速度的因素(三)電泳1.電泳的概念指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程.影響蛋白質(zhì)分子運(yùn)動速度的因素

決定運(yùn)動方向形成庫侖力形成阻力決定運(yùn)動速率電荷性質(zhì)電荷量分子形狀分子大小√√√√√√√在一定pH下，使蛋白質(zhì)基團(tuán)帶上正電或負(fù)電；加入帶負(fù)電荷多的SDS，形成“蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物”，使蛋白質(zhì)遷移速率僅取決于分子大小。（2）分離方法：（3）分離過程：

瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。(三)電泳電泳檢測結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳二、實(shí)驗(yàn)操作蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：（1）樣品處理：包括洗滌紅細(xì)胞；血紅蛋白釋放；離心分離等操作收集到的血紅蛋白溶液。（2）粗分離：透析除去分子較小的雜質(zhì)。（3）純化：通過凝膠色譜法將分子量較大的雜質(zhì)蛋白質(zhì)除去。（4）純度鑒定：通過聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定。（一）樣品處理1、紅細(xì)胞的洗滌：目的是去除雜蛋白。要加入檸檬酸鈉防止血液凝固；離心將血液分層，用膠頭吸管吸出黃色血漿；用生理鹽水洗滌。2、血紅蛋白的釋放：在蒸餾水和甲苯作用下，紅細(xì)胞破裂釋放3、分離血紅蛋白溶液：離心分層；濾紙過濾去除脂溶性沉淀層；分液漏斗分出紅色透明液體。4、透析：裝入透析袋并置于磷酸緩沖液中（PH為7.0）透析。樣品處理粗分離純化純度鑒定血液組成成分

1.洗滌紅細(xì)胞

2.釋放血紅蛋白

3.分離血紅蛋白

4.透析血紅蛋白二、實(shí)驗(yàn)操作血液組成成分閱讀思考：血液由______和________兩部分組成。血細(xì)胞中________細(xì)胞數(shù)量最多，紅細(xì)胞的含量最高的有機(jī)化合物是_____________。該化合物是由_____________和____________構(gòu)成的，其中每個亞基中都含有一個能與O2和CO2結(jié)合的___________基團(tuán)。血漿血細(xì)胞紅細(xì)胞血紅蛋白2條α-肽鏈2條β-肽鏈

亞鐵血紅素課題3血紅蛋白的提取與分離返回1.洗滌紅細(xì)胞閱讀思考：洗滌的目的是什么？洗滌過程：血液100mL3g檸檬酸鈉低速離心2min紅細(xì)胞血漿吸出血漿紅細(xì)胞5倍體積生理鹽水?dāng)嚢?0min重復(fù)洗滌3次，直至上清液沒有黃色課題3血紅蛋白的提取與分離采集得到雞血初次離心后的結(jié)果3次洗滌后的結(jié)果返回2.釋放血紅蛋白閱讀思考：釋放血紅蛋白過程中，在洗滌好的紅細(xì)胞加入了哪些物質(zhì)？為了加速釋放過程，采取了什么措施？①目的分析：②蒸餾水的作用是______________________________。③加入甲苯的作用是____________________________。④充分?jǐn)嚢璧哪康氖莀___________________________。使紅細(xì)胞大量吸水脹裂溶解紅細(xì)胞的細(xì)胞膜加速紅細(xì)胞的破裂課題3血紅蛋白的提取與分離(2)血紅蛋白的釋放：

加蒸餾水到原血液體積，再加40％體積的甲苯，置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?0分鐘（加速細(xì)胞破裂）,細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。磁力攪拌器返回3.分離血紅蛋白分離過程紅細(xì)胞混合液高速離心10min離心管濾紙過濾脂類物質(zhì)燒杯課題3血紅蛋白的提取與分離(3)分離血紅蛋白溶液：①過程：將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以2000r/min的速度離心10min。②試管中溶液層次：第1層（最上層）：甲苯層（無色透明）；第2層（中上層）：脂溶性物質(zhì)沉淀層（白色薄層固體）；第3層（中下層）：血紅蛋白的水溶液層（紅色透明液體）；第4層（最下層）：雜質(zhì)沉淀層（暗紅色）。③分離：用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。甲苯層（無色透明）白色薄層固體紅色透明液體雜質(zhì)沉淀層（暗紅色）試管中溶液層次返回課題3血紅蛋白的提取與分離4.透析血紅蛋白20mmol/L磷酸緩沖液1mL1mL利用透析袋透析透析過程返回課題3血紅蛋白的提取與分離純化－－凝膠色譜操作1.凝膠色譜柱的制作：2.凝膠色譜柱的裝填：教材圖5－193.樣品的加入和洗脫（二）凝膠色譜操作（1）凝膠色譜柱的制作：①取長40厘米，內(nèi)徑1.6厘米的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。②底塞的制作：打孔→