重組子的篩選與鑒定

NJU重組子的篩選（screening）與鑒定第一節(jié)、有關(guān)概念轉(zhuǎn)化子重組子期望重組子篩選鑒定轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化子：接納有外源DNA分子（載體或重組分子）的受體細(xì)胞。非轉(zhuǎn)化子：未接納外源DNA分子的非轉(zhuǎn)化細(xì)胞。重組子：含有重組DNA分子的轉(zhuǎn)化子。非重組子：僅含有空載體分子的轉(zhuǎn)化子。重組子與非重組子期望重組子與非期望重組子期望重組子：含有外源目的基因的重組子。非期望重組子：攜帶非目的基因的重組子。轉(zhuǎn)化子、重組子、期望重組子關(guān)系轉(zhuǎn)化子重組子期望重組子篩選（screening）一般指從反應(yīng)體系細(xì)胞群中辨別挑選出轉(zhuǎn)化子或重組子的過(guò)程。反應(yīng)體系細(xì)胞的組成：1、不含外源DNA的受體細(xì)胞2、含空載體的細(xì)胞（酶切未切開(kāi)或重新環(huán)化的載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞）3、重組子：（1）含目的重組DNA的細(xì)胞（2）含非目的重組DNA的細(xì)胞鑒定對(duì)篩選出的重組子DNA進(jìn)行進(jìn)一步酶切、測(cè)序等，鑒定是否為目的重組子及重組子DNA序列的正確性等。選擇標(biāo)記基因（selectablemarkergene）指編碼的產(chǎn)物能夠使轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在有選擇劑或營(yíng)養(yǎng)缺乏的情況下很好生長(zhǎng)或表現(xiàn)出其他可視特征的基因。構(gòu)建載體時(shí)，目的基因與選擇標(biāo)記基因在載體上的空間關(guān)系有兩種：1、獨(dú)立存在。用于區(qū)分轉(zhuǎn)化細(xì)胞與未轉(zhuǎn)化細(xì)胞2、目的基因插入選擇標(biāo)記基因編碼區(qū)或其基因調(diào)控部分。用于區(qū)分空載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞與重組載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞報(bào)告基因（reportergene）指載體上攜帶的、表達(dá)產(chǎn)物容易被檢測(cè)且能夠指示外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞與否及表達(dá)水平的基因。構(gòu)建載體時(shí)，一般將報(bào)告基因與目的基因融合，并將報(bào)告基因置于目的基因啟動(dòng)子控制之下，報(bào)告基因與目的基因同步轉(zhuǎn)化與表達(dá)。第二節(jié)、大腸桿菌重組體的篩選一、質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞的篩選（一）抗生素平板結(jié)合插入失活篩選法—根據(jù)標(biāo)記基因是否失活，確定是否有外源基因插入。插入失活篩選法的應(yīng)用兩種情況：雙抗生素抗性基因標(biāo)記載體含一個(gè)抗生素抗性標(biāo)記，一個(gè)lacZ′基因的載體帶雙抗生素抗性標(biāo)記的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌的篩選方法載體攜帶兩個(gè)抗生素抗性基因，外源基因插入其中一個(gè)基因內(nèi)導(dǎo)致其失活，用兩種抗生素平板篩選重組子。第一步：正選擇。在不進(jìn)行插入失活抗性基因的相應(yīng)抗生素平板上轉(zhuǎn)化子可以生長(zhǎng)，非轉(zhuǎn)化子不能生長(zhǎng)，可將轉(zhuǎn)化子直接從平板上挑出來(lái)；第二步：負(fù)選擇。在插入失活抗性基因的相應(yīng)抗生素平板上轉(zhuǎn)化子中的非重組子（未插入外源基因）可以生長(zhǎng)，重組子（插入外源基因）不能生長(zhǎng)，應(yīng)與第一種抗生素板進(jìn)行對(duì)照并在其上挑出含重組子的菌落。例如pBR322質(zhì)粒含有TCr、Ampr兩個(gè)抗藥性基因，外源基因插入失活TCr后，會(huì)有三種不同表現(xiàn)的細(xì)胞:未轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞—

TCsAmps含載體的轉(zhuǎn)化菌落－AmprTcr

含重組體的陽(yáng)性菌落—AmprTcs空載體轉(zhuǎn)化菌落及重組載體轉(zhuǎn)化菌落空載體轉(zhuǎn)化菌落篩選具體做法1、用轉(zhuǎn)化反應(yīng)液涂布含氨芐的LB平板，長(zhǎng)出轉(zhuǎn)化子—Ampr

；2、用無(wú)菌牙簽將Ampr的轉(zhuǎn)化子逐一挑在Tc平板上（或用無(wú)菌絲絨布、無(wú)菌濾紙影?。容^兩塊板上的菌落生長(zhǎng)情況，從Amp板上挑選出Tc板上不長(zhǎng)的菌落即為重組子。注意：氨芐平板菌落密度不宜過(guò)大影印平板培養(yǎng)法利用lacZ′基因的插入失活篩選重組子

—藍(lán)白篩選法

載體同時(shí)含氨芐青霉素抗性基因和lacZ′基因，外源基因插在lacZ′基因內(nèi)，受體細(xì)胞為lacZ′基因互補(bǔ)菌。在同時(shí)含氨芐青霉素和藍(lán)白篩選顯色劑（X-gal）的平板上篩選：未轉(zhuǎn)化細(xì)胞不能生長(zhǎng)；空載體轉(zhuǎn)化菌長(zhǎng)成藍(lán)色菌落；重組子長(zhǎng)成白色菌落。例：pUC質(zhì)粒系列、pGEM質(zhì)粒系列、M13噬菌體lacZ基因編碼β-半乳糖苷酶；lacZ′基因編碼β-半乳糖苷酶的N端序列α片段，互補(bǔ)菌染色體上攜帶的缺陷基因編碼C端片斷，兩者互補(bǔ)（α-互補(bǔ)）形成有功能的全酶。藍(lán)白篩選菌落生長(zhǎng)照片X-gal5-Bromo-4-Chloro-3-Indoly--D-Galactoside)，5-溴-4-氯-3-吲哚-

-D-半乳糖苷

-半乳糖苷酶顯色劑：生色底物IPTG及其作用IPTG：即Isopropyl-

-D-thioagalactoside，異丙基-

-D-硫代半乳糖苷作用：乳糖操縱子誘導(dǎo)物，和載體上攜帶的大腸桿菌乳糖操縱子的調(diào)節(jié)基因（LacI）編碼產(chǎn)物—阻遏蛋白結(jié)合，阻止其與操縱基因結(jié)合，使操縱子控制的基因（lacZ等）得以表達(dá)。含LacI的載體：如pUC8，需要誘導(dǎo)物不含LacI的載體：如pUC18/19，不需誘導(dǎo)物研究中通常為何用IPTG而非乳糖作誘導(dǎo)物？乳糖會(huì)被宿主細(xì)胞利用而IPTG不被利用。大腸桿菌乳糖操縱子基因組成IPTG例1:pUC8中l(wèi)acZ′基因的插入失活例二：pGEM-3Z中l(wèi)acZ′基因的插入失活（二）插入表達(dá)篩選載體的選擇標(biāo)記基因前連接一段負(fù)調(diào)控序列，插入失活負(fù)調(diào)控序列后，其下游的篩選標(biāo)記基因才能表達(dá)。如pTR262質(zhì)粒，在Tc（Tet）基因前有來(lái)自噬菌體的cI基因，可編碼cI阻遏蛋白，抑制Tet表達(dá)。cI基因（HindⅢ或BglⅠ位點(diǎn)）插入失活，Tc基因表達(dá)，受體細(xì)胞在Tc板上生長(zhǎng)；未轉(zhuǎn)化細(xì)胞及及空載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞Tc表達(dá)被抑制，在Tc平板上不生長(zhǎng)。二、重組噬菌體DNA轉(zhuǎn)入大腸桿菌后重組子的篩選（一）取代型載體：根據(jù)λ基因組的大小篩選，直接挑取噬菌斑即重組子機(jī)理：空載體太小而不被包裝，不進(jìn)入細(xì)胞；重組λ-DNA可包裝成噬菌體顆粒并感染大腸桿菌產(chǎn)生噬菌斑；未感染菌生長(zhǎng)成菌落。（二）插入型載體空載體及重組載體都可包裝，需要插入失活載體上的標(biāo)記基因篩選。

lacZ′基因插入失活篩選：藍(lán)白篩選cI基因插入失活篩選：cI篩選利用Spi（sensitivetoP2inhibition）表型選擇：Spi篩選選擇標(biāo)記基因1、利用lacZ′基因的插入失活篩選重組噬菌斑

如含有l(wèi)acZ′基因的M13噬菌體及多種λ噬菌體載體（λ

gt11）重組噬菌斑無(wú)色透明，非重組噬菌斑呈藍(lán)色，未轉(zhuǎn)化細(xì)胞長(zhǎng)出菌落2、λ噬菌體的cI基因的插入失活篩選

——cI篩選法

原理：cI基因編碼的阻遏蛋白可使感染了λ噬菌體的大腸桿菌進(jìn)入溶原化狀態(tài)；

cI基因的插入失活使感染了λ噬菌體的大腸桿菌由溶原狀態(tài)進(jìn)入溶菌狀態(tài)。重組噬菌斑：無(wú)色透明非重組噬菌斑：渾濁未轉(zhuǎn)化菌：正常菌落Polylinker插入不影響lacZ′基因表達(dá)單酶切時(shí)有這種情況噬菌斑2、cI基因插入失活篩選例：λgt10

－BNNl02（C600hflA）系統(tǒng)C600hflA是一種hflA突變菌；cI基因正常表達(dá)的噬菌體在其中溶原生長(zhǎng)，不形成噬菌斑；

但cI基因插入失活的重組噬菌體卻能形成噬菌斑（YoungandDavis1983a）。hfL：highfrequencelysogenization

3、spi-篩選用目的基因取代λ噬菌體取代型載體上含有redgam（整合基因）的填充片段后，使噬菌體由red+gam+轉(zhuǎn)變?yōu)閞ed-gam-，感染P2噬菌體溶源菌后使細(xì)菌由溶原生長(zhǎng)轉(zhuǎn)換為溶菌生長(zhǎng)。

利用這種特性進(jìn)行的篩選稱為spi-篩選。填充片段內(nèi)含有red及gam基因的載體如EMBL3和EMBL4red+gam+噬菌體可在P2噬菌體溶源菌中呈溶原生長(zhǎng)，被定為SPi+

（sensitivetoP2inhibition，對(duì)P2介入敏感）red-gam-噬菌體在P2溶源菌中則呈溶菌生長(zhǎng)，定為Spi-。三、雜交篩選菌落或噬菌斑雜交篩選第三節(jié)、轉(zhuǎn)化/重組酵母菌的篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷互補(bǔ)基因顯性標(biāo)記基因一、利用營(yíng)養(yǎng)缺陷互補(bǔ)基因的篩選方法原理：受體細(xì)胞為某種營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株，即不能合成某種營(yíng)養(yǎng)成分，在缺乏該營(yíng)養(yǎng)成分的培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)；攜帶相應(yīng)營(yíng)養(yǎng)成分合成基因的載體轉(zhuǎn)化受體菌后，使細(xì)胞在選擇培養(yǎng)基（不含某種相應(yīng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基）中能夠生長(zhǎng)，而未被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞不能生長(zhǎng)。酵母常用營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記基因第一類：氨基酸合成基因：組氨酸合成酶基因HIS4色氨酸合成酶基因TRP1亮氨酸合成酶基因LEU2精氨酸合成酶基因ARG4第二類：核苷酸合成基因：尿嘧啶合成酶基因（URA3）例：含HIS的載體

分泌型表達(dá)載體主要有：pPIc9，pPIc9k，pHIL-S1，pPIcza，pYAM75P6；胞內(nèi)表達(dá)的載體主要有：pHIL-D2，pA0815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ，pGAPZa等組氨醇脫氫酶基因（histidinoldehydrogenasegene，his4）缺失的畢赤酵母主要有三類：GS115、SMDI168、KM71均不能合成組氨酸載體需攜帶his4，轉(zhuǎn)染后的陽(yáng)性重組子可以用不含組氨酸的平板進(jìn)行篩選含URA3的載體及其相應(yīng)的受體細(xì)胞載體：酵母菌的Yep系列載體：含Amp、Tc和URA3（尿嘧啶）標(biāo)記基因受體細(xì)胞：EGY48菌株Amp、Tc抗性基因用于在大腸桿菌中篩選重組子URA3標(biāo)記基因用于酵母轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選二、酵母常用顯性標(biāo)記基因1、氨基糖苷類藥物磷酸轉(zhuǎn)移酶基因：Neo（neomycin）。2、博來(lái)霉素抗性基因：Zeo（Zeocin）。如pFLD1載體、（一）Neo選擇系統(tǒng)Neo基因編碼氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，可以滅活氨基糖甙類抗生素，是新霉素（neomycin）、新霉素衍生物G418、卡那霉素等抗生素的抗藥基因。（二）Zeo選擇系統(tǒng)Zeo是編碼博來(lái)霉素抗性產(chǎn)物的基因。博來(lái)霉素（bleomycin）是一種光譜抗腫瘤藥。三、酵母其他顯性標(biāo)記基因1、藍(lán)白篩選基因：LacZ基因2、

銅離子抗性蛋白基因：CUP1基因。編碼一種銅離子螯合蛋白，適合銅離子敏感菌（如釀酒酵母）的篩選。3、赭石突變抑制基因：sup4利用赭石突變抑制基因sup4篩選重組酵母菌酵母菌AB1380（與YAC載體配套）的胸腺嘧啶合成酶基因帶有一個(gè)赭石突變ade2-1，使其在基本培養(yǎng)基上形成紅色菌落，但在缺少某種營(yíng)養(yǎng)素的選擇培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)。當(dāng)帶有赭石突變抑制基因sup4

的空載體存在于細(xì)胞中時(shí)，可抑制ade2-1基因的突變效應(yīng)，該酵母菌在選擇培養(yǎng)基上形成正常的白色菌落；

sup4被外源基因插入失活后重組子呈紅色。YAC載體帶有trp1、

leu2和his3、ura3以及sup4密碼子改變成UAA的無(wú)義突變又叫赭石突變第四節(jié)、轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞篩選一、哺乳動(dòng)物細(xì)胞常用的選擇標(biāo)記基因1、新霉素抗性基因：neo（neomycin）2、博來(lái)霉素抗性基因：zeocin3、黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因：gpt黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（XGPRT）基因（ecogpt）選擇系統(tǒng)

由大腸桿菌Ecogpt

基因編碼的黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（XGPRT）是一種核苷酸代謝酶，能夠把黃嘌呤轉(zhuǎn)變?yōu)辄S苷酸（XMP），并最終形成鳥(niǎo)苷酸（GMP）。霉酚酸能抑制次黃嘌呤核苷酸脫氫酶的作用而阻斷嘌呤核苷酸的經(jīng)典合成途徑。攜帶gpt的載體轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞后，使受體細(xì)胞在含霉酚酸的HAT培養(yǎng)基中啟動(dòng)核苷酸合成替代途徑，利用培養(yǎng)基中補(bǔ)加的黃嘌呤合成GMP，得以存活。合成GMP的不同途徑

正常途徑（經(jīng)典途徑）IMPXMPGMP（次黃苷酸）霉酚酸（×）（黃苷酸）（鳥(niǎo)苷酸）替代途徑

黃嘌呤

XMPGMP

XGPRT（＋）HGPRT基因選擇系統(tǒng)組成1、受體細(xì)胞：普通哺乳動(dòng)物細(xì)胞2、載體：含有g(shù)pt基因的載體，如pAG4622（人-鼠嵌合輕鏈表達(dá)載體）

，pSV2gpt（人-鼠嵌合重鏈表達(dá)載體）3、培養(yǎng)基：篩選XPGRT活性缺陷細(xì)胞的HAT選擇培養(yǎng)基組成如下：霉酚酸黃嘌呤（合成鳥(niǎo)苷酸GMP）腺嘌呤胸苷（合成胸腺嘧啶）透析除去鳥(niǎo)嘌呤的血清胸苷合成中的主要抑制劑fluorouracil（五氟脲嘧啶）methotrexate（氨甲蝶呤或甲氨蝶呤）aminopterin（氨基喋呤）二、哺乳動(dòng)物細(xì)胞常用報(bào)告基因β-半乳糖苷酶基因綠色熒光蛋白基因（greenfluorescentprotein，GFP）熒光素酶基因（luciferase，Luc）三、哺乳動(dòng)物細(xì)胞其他選擇標(biāo)記基因1、二氫葉酸還原酶基因：dfhr2、胸苷激酶基因：tk二氫葉酸還原酶基因（dfhr）選擇系統(tǒng)二氫葉酸還原酶（dihydrofolatereductase，DHFR）可將二氫葉酸還原成四氫葉酸，后者提供核苷從頭合成的甲基。Dfhr-的突變不生長(zhǎng)體受體細(xì)胞不含外源核苷的常規(guī)培養(yǎng)基dfhr＋的重組D