擬南芥赤霉素2–氧化酶基因aga2ox1在矮牽牛中的表達(dá)及應(yīng)用

擬南芥赤霉素2–氧化酶基因aga2ox1在矮牽牛中的表達(dá)及應(yīng)用

黃霉素可調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育最顯著的作用是莖的生長(zhǎng)。經(jīng)過多年的深入研究,赤霉素代謝和作用機(jī)理已漸被闡明,在模式植物中與此相關(guān)的大多數(shù)基因已被克隆(Hedden&Phillips,2000;Sakamotoetal.,2004),研究者得以利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)調(diào)控赤霉素的代謝和信號(hào)傳導(dǎo)來培育株形理想的新材料,同時(shí)進(jìn)一步分析赤霉素在不同物種中對(duì)各種性狀的影響(Bhattacharyaetal.,2010)。高等植物赤霉素合成過程中,GA2ox,GA3ox和GA20ox這3個(gè)小基因家族在決定體內(nèi)活性赤霉素的水平中發(fā)揮關(guān)鍵的作用,其中GA3ox和GA20ox家族基因催化合成有生物活性的赤霉素,而GA2ox家族基因是將活性赤霉素轉(zhuǎn)化成無活性的狀態(tài)(Yamaguchi,2008;Han&Zhu,2011)。在降低內(nèi)源赤霉素水平的生理效應(yīng)和創(chuàng)造矮化植物新材料的研究中,GA2ox家族基因最常被使用(Dijkstraetal.,2008;Singhetal.,2010;Zhouetal.,2011;Studzinskaetal.,2012)。研究表明,超量表達(dá)GA2ox家族基因雖然可以獲得矮化的植株,但同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致花變小、花色變淺、開花延遲和不能結(jié)實(shí)等不利性狀(Sakamotoetal.,2003;Ubeda-Tomasetal.,2006)。因此,在基因工程中應(yīng)用該類基因時(shí)有必要對(duì)其表達(dá)的時(shí)空進(jìn)行限制。本研究中通過超量表達(dá)擬南芥赤霉素2–氧化酶基因AtGA2ox1,分析內(nèi)源赤霉素水平降低對(duì)矮牽?；ǖ念伾痛笮〉扔^賞性狀的影響;利用莖特異表達(dá)基因At3g56700的上游啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)擬南芥赤霉素2–氧化酶基因AtGA2ox1在矮牽牛中表達(dá),分析該啟動(dòng)子在觀賞植物的矮化基因工程應(yīng)用的可行性。1材料和方法1.1材料、試種與材料試驗(yàn)于2011年9月至2013年9月于西南大學(xué)花卉研究所進(jìn)行。矮牽牛自交系‘V26’(紫色花)由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)包滿珠教授惠贈(zèng),‘MitchelDiploid’(MD,白色花)系新西蘭DavidLewis博士贈(zèng)送,栽培品種‘地毯紫青’和‘夢(mèng)幻粉紅’購自農(nóng)友種苗(中國)有限公司。擬南芥(Col)由本實(shí)驗(yàn)室保存。植物材料種植于西南大學(xué)試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)大棚,供試的植株同時(shí)種植,相鄰放置,保證其生長(zhǎng)條件一致。大腸桿菌DH5α、農(nóng)桿菌GV3101、植物表達(dá)載體pCAMBIA2301和pGreenⅡ0229由本實(shí)驗(yàn)室保存。pMD19-T購自寶生生物(大連)有限公司。1.2表達(dá)載體的構(gòu)建用CTAB法提取擬南芥幼苗基因組DNA為模板,PCR擴(kuò)增帶內(nèi)含子的AtGA2ox1基因。擴(kuò)增引物根據(jù)At1G78440序列(Biemeltetal.,2004)設(shè)計(jì)為:CTGCAGATCAATGGCGGTATTGTCTAAAC(PstⅠ)和GGATCCTCAATTTAGGAGATTTTTTATAGTC(BamHⅠ)。擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pMD19-T上,測(cè)序驗(yàn)證后用PstⅠ和BamHⅠ酶切。回收目的片段,連接到輔助載體pMF500(王會(huì)平等,2013)上,置于2×35S啟動(dòng)子和35S終止子之間,酶切和測(cè)序驗(yàn)證后命名為pMF501。用EcoRⅠ和SalⅠ酶切pMF501回收表達(dá)盒,連接到pCAMBIA2301的多克隆位點(diǎn),驗(yàn)證后命名pCMF501(圖1)。構(gòu)建莖特異表達(dá)AtGA2ox1基因的載體時(shí),首先將pMF500的表達(dá)框用SacⅠ和HindⅢ切下連接到pGreenⅡ0229,得到載體pGMF500。根據(jù)擬南芥轉(zhuǎn)錄組的研究結(jié)果(Schmidetal.,2005),以擬南芥基因組DNA為模板,PCR擴(kuò)增克隆莖特異表達(dá)基因At3g56700的5′端非編碼區(qū)約2.1kb的序列,用作AtGA2ox1的啟動(dòng)子。擴(kuò)增使用的引物為:GGTACCTTTCCTAGAACAGTCTGAGC(KpnⅠ)和CTGCAGGCCATGGTAGTTACCAACG(PstⅠ)。擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pMD19-T并測(cè)序驗(yàn)證后,以KpnⅠ和PstⅠ酶切回收目的片段,連接到KpnⅠ和PstⅠ酶切pMF501回收的載體片段上,驗(yàn)證后為pMF712。SacⅠ和BamHⅠ酶切pMF712和pGMF500,分別回收表達(dá)框和載體,連接,驗(yàn)證后命名為pGMF712(圖1)。pCMF501和pGMF712質(zhì)粒DNA用電擊法轉(zhuǎn)化導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101。矮牽牛遺傳轉(zhuǎn)化使用葉盤法,具體程序見參考文獻(xiàn)(郭余龍等,2014;Guoetal.,2014)。1.3菌株鑒定及pcr檢測(cè)pCMF501轉(zhuǎn)化‘V26’和‘MD’后,取其抗性植株和對(duì)照植株的葉片浸于GUS染色液中,37℃保溫3~12h,乙醇脫色,觀察染色情況。取T0或T1代抗性植株的莖、葉和花蕾,用RNApreppure植物總RNA提取試劑盒(北京天根)提取總RNA,cDNA第1鏈用PrimeScriptTMRTMasterMix試劑盒(TaKaRa)合成,每次反應(yīng)使用1μg總RNA。半定量分析抗性植株中外源基因AtGA2ox1的表達(dá)時(shí),擴(kuò)增ACTIN內(nèi)參的引物為:AGATCTGGCATCATACCTTCTACA和CCMGCAGCTTCCATRCCAATCA。擴(kuò)增目的基因AtGA2ox1的正向引物為GCATTCTACTTCTATTGCAGC(TL-2),反向引物為TCGTCCTCATTGTCTATC(501R),擴(kuò)增條件為94℃變性5min后,進(jìn)行25個(gè)循環(huán)的94℃變性30s,52℃退火30s,72℃延伸1min擴(kuò)增,最后1個(gè)循環(huán)后72℃延伸10min。熒光定量分析外源基因AtGA2ox1的表達(dá)量時(shí),擴(kuò)增內(nèi)參基因SAND的引物為:CTTACGACGAGTTCAGATGCC和GGTAAGTCCTCAACACGCATG(Mallonaetal.,2010);目標(biāo)基因AtGA2ox1的引物為501-qF2:CACACTTCCTTCTTCTTCAACG和501-qR2:CGTACAACCTCTCGTCCTCAT。分析在CFX96PCR儀上進(jìn)行,每個(gè)qRT-PCR總體積為10μL,包含0.5μLcDNA,正反向引物各0.5μL(10μmol·L-1),5μL2×SsoFastTMEvaGreen?Supermix(Bio-Rad)。擴(kuò)增條件為:95℃預(yù)變性30s;95℃變性5s,60℃退火并延伸5s,39個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過Bio-RadManagerTM(Version1.1)軟件進(jìn)行采集和分析,用2-??CT法獲得目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量。1.4冠層社會(huì)計(jì)劃花冠面積的測(cè)量:在花開放后花冠達(dá)最大直徑時(shí)(氣溫低于28℃時(shí)4d,高于28℃時(shí)3d)將花剪下,放到架子上,花冠自然展平,從垂直于花冠平面的角度拍照,拍照時(shí)在花冠旁邊放一刻度尺。拍照后用ImageJ軟件計(jì)算花冠所占的面積,記為花冠面積?；ò晟媳砥ぜ?xì)胞觀察:將花冠中部切成0.5cm×0.5cm見方的小塊,用導(dǎo)電膠粘在樣品支架上,放到HITACHIS-3000N掃描電鏡樣品室的冷凍臺(tái)上,在–20℃,15kV的條件下進(jìn)行冷凍掃描觀察、拍照。每個(gè)材料觀察5朵花。用ImageJ軟件進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),計(jì)算每個(gè)細(xì)胞所占面積。測(cè)量第1個(gè)花蕾的高度在植株主莖至少有5朵花開放后進(jìn)行,將植株拔出后,測(cè)量子葉節(jié)到第1朵花(蕾)著生處的長(zhǎng)度。測(cè)量花序的節(jié)間長(zhǎng)度時(shí),先測(cè)量每花序枝上所有充分伸長(zhǎng)的節(jié)間的總長(zhǎng)度,再除以節(jié)間數(shù)記為該花序枝的節(jié)間長(zhǎng)度,每個(gè)株系隨機(jī)選取約30個(gè)花序枝進(jìn)行測(cè)量。1.5提取樣品中葉綠素含量的測(cè)定取材的前1d將所有已開放的花去除,第2天取完全展開的花冠,用1%的鹽酸甲醇溶液提取花色素苷。提取時(shí)先將花冠稱質(zhì)量,然后按每100mg樣品10mL提取液的比例加入提取液。4℃條件下慢速振蕩提取48h后,提取液用分光光度計(jì)(TU-1901,北京普析通用)測(cè)定530nm和657nm的吸光度,計(jì)算A530–0.25×A657值以表示提取液中花色素苷的相對(duì)含量,同時(shí)校正葉綠素及其降解產(chǎn)物存在對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響(Weiss&Halevy,1989)。每個(gè)株系測(cè)定15朵花。1.6%丙酮水溶液參考Nishijima等(2006)用細(xì)胞分裂素處理矮牽?；ɡ贂r(shí)的方法。將赤霉素和多效唑(購自Sigma公司)溶解于50%丙酮水溶液中配成濃度為100μmol·L-1的溶液?；ɡ匍L(zhǎng)度2mm時(shí)開始處理,每?jī)商焯幚?次,每次將5μL溶液滴到花蕾頂部,直到花朵開放。對(duì)照用50%丙酮水溶液處理。每處理至少15朵花。2結(jié)果與分析2.1基因基因的基因組化和發(fā)育通過表達(dá)赤霉素2–氧化酶基因來降低植物內(nèi)源赤霉素水平的研究中,目前有多個(gè)物種的基因可供選用。因?yàn)锳tGA2ox1在單子葉植物百喜草(Agharkaretal.,2007)和雙子葉植物煙草(Biemeltetal.,2004)中異源表達(dá)都有較好的效果,故本研究選用該基因。經(jīng)卡那霉素篩選和GUS染色,將17個(gè)GUS染色陽性的‘V26’矮牽?？剐灾晗狄圃院筇崛NA進(jìn)行PCR驗(yàn)證,都檢測(cè)到外源AtGA2ox1基因。這些植株呈現(xiàn)程度不同的矮化,開花時(shí)間較對(duì)照有不同程度的延后,有一個(gè)株系(VL25)在移栽后8個(gè)月尚未開花,與前人報(bào)道的超量表達(dá)赤霉素2–氧化酶基因轉(zhuǎn)基因植株的表型一致(Schomburgetal.,2003;Biemeltetal.,2004)。轉(zhuǎn)基因植株的花冠(圖2)出現(xiàn)不同程度的變小,與預(yù)期結(jié)果一致;但花色未出現(xiàn)明顯變化,與預(yù)期結(jié)果不同。對(duì)照和抗性植株的花序提取RNA,進(jìn)行RT-PCR分析表明,所檢測(cè)的抗性植株中AtGA2ox1均有表達(dá)(圖3)。為了進(jìn)一步了解花冠變化的情況,取4個(gè)株系對(duì)花冠面積和花色素苷的含量進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果(表1)顯示轉(zhuǎn)基因植株花冠面積明顯變小、但花色素苷的含量與對(duì)照植株差別不大,與肉眼觀察結(jié)果一致。轉(zhuǎn)基因株系間花冠面積的差異與外源基因表達(dá)量差異的變化趨勢(shì)一致(表1,圖3)。矮牽牛研究中,‘MD’自交系是一個(gè)較‘V26’更為常用的材料,并且其花瓣發(fā)育進(jìn)程中的細(xì)胞分裂和膨大的模式已有詳細(xì)的分析(Realeetal.,2002)。pCMF501轉(zhuǎn)化‘MD’后,獲得10個(gè)花冠有不同程度地變小的轉(zhuǎn)基因株系,半定量分析顯示這些植株的花蕾中均有外源AtGA2ox1的表達(dá)。對(duì)其中的ML9株系進(jìn)行的分析表明,其花冠面積明顯變小,ML9為(11.7±1.5)cm2,而‘MD’對(duì)照為(17.5±1.9)cm2(圖4);外源基因在其莖、葉和花中的表達(dá)量相似(圖5)。用赤霉素對(duì)ML9的花蕾進(jìn)行處理后,花冠的面積能夠恢復(fù)甚至超過野生型MD花冠的面積(圖4),說明外源赤霉素可以補(bǔ)償AtGA2ox1對(duì)矮牽?；ü诎l(fā)育的影響。2.2合成抑制劑多效唑?qū)诓闹谐嗝顾氐恼{(diào)節(jié)由于AtGA2ox1在‘V26’中的過量表達(dá)沒有改變花的顏色,與預(yù)期的結(jié)果存在差異。進(jìn)一步利用赤霉素合成抑制劑多效唑?qū)Α甐26’、‘地毯紫青’和‘夢(mèng)幻粉紅’的花蕾進(jìn)行處理,以調(diào)節(jié)花蕾中內(nèi)源GA水平,對(duì)赤霉素影響花冠大小和顏色的結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。觀察表明,經(jīng)多效唑處理的花蕾開花后花冠明顯變小,但花的顏色沒有明顯的變化(圖6),與表達(dá)AtGA2ox1降低內(nèi)源GA含量對(duì)花的大小和顏色的影響是一致的。2.3織物上表皮細(xì)胞的形態(tài)觀察通常認(rèn)為赤霉素主要影響植物細(xì)胞的膨大。為了觀察AtGA2ox1表達(dá)對(duì)花瓣細(xì)胞發(fā)育的影響,對(duì)‘V26’及其轉(zhuǎn)基因植株VL27和‘MD’及其轉(zhuǎn)基因植株ML9的花瓣上表皮細(xì)胞進(jìn)行了掃描電鏡觀察,結(jié)果(圖7)顯示,矮牽?；ò晟媳砥ぜ?xì)胞呈乳突狀,細(xì)胞的膨大并不均勻一致,而是大小相間排列的。轉(zhuǎn)AtGA2ox1的植株花瓣上表皮細(xì)胞的形狀沒有明顯變化,但明顯變小,與預(yù)期的結(jié)果一致。每個(gè)材料取5朵花進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì),花瓣中部上表皮每個(gè)細(xì)胞所占面積為:V26(4.3±0.2)×103μm2,VL27(3.6±0.3)×103μm2,MD(4.4±0.5)×103μm2,ML9(2.9±0.4)×103μm2。2.4轉(zhuǎn)基因矮化植株的鑒定35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)AtGA2ox1表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株雖然實(shí)現(xiàn)了矮化,但花明顯變小,同時(shí)開花時(shí)間延遲,這對(duì)觀花植物是不利的。因此,克隆了擬南芥莖特異表達(dá)基因At3g56700的啟動(dòng)子,構(gòu)建載體pGMF712(圖1),以使AtGA2ox1在莖中特異表達(dá)。經(jīng)過BASTA篩選,獲得田間抗除草劑的獨(dú)立轉(zhuǎn)化系33個(gè)。觀察發(fā)現(xiàn),抗性植株中有7個(gè)株系與對(duì)照差異不明顯;6個(gè)株系矮化非常明顯,開花明顯延遲,花冠變小;其余20個(gè)株系不同程度地矮化,開花時(shí)間和花冠大小也受一定程度的影響。說明轉(zhuǎn)基因矮牽牛植株中AtGA2ox1的表達(dá)受插入位點(diǎn)的影響。隨機(jī)選取了9個(gè)T0代抗性株系,進(jìn)行外源AtGA2ox1的表達(dá)分析,結(jié)果表明均有表達(dá)。所有觀察的轉(zhuǎn)基因植株均能正常結(jié)實(shí),果實(shí)和種子發(fā)育未受影響。為了分析轉(zhuǎn)基因植株后代的表型,利用未轉(zhuǎn)基因的MD材料作父本與轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行雜交,收獲種子,播種發(fā)芽后,在三葉期噴施BASTA進(jìn)行鑒定。根據(jù)T0代植株和T1幼苗的表型,以及T1代抗性植株的分離情況,選擇6個(gè)抗性呈1︰1分離的株系對(duì)株型進(jìn)行進(jìn)一步的分析。結(jié)果(表2)顯示,轉(zhuǎn)基因株系‘712-31’和‘712-33’表型變化輕微,株形與未轉(zhuǎn)基因?qū)φ詹町惒幻黠@;轉(zhuǎn)基因株系‘712-10’和‘712-26’植株明顯矮化,開花時(shí)間明顯延遲(長(zhǎng)日照,重慶5—9月),花冠變小(表2,圖8);轉(zhuǎn)基因株系‘712-15’和‘712-27’介于前兩者之間,植株矮化明顯,花冠略為變小(表2,圖8)。對(duì)表型不同的3個(gè)株系的莖、葉和花中外源基因的表達(dá)情況進(jìn)行了分析,結(jié)果(圖9)顯示,3個(gè)株系莖中的表達(dá)量均高于葉和花,說明At3g56700基因的上游啟動(dòng)子在矮牽牛中仍具有驅(qū)動(dòng)外源基因在莖中優(yōu)勢(shì)表達(dá)的特性。3預(yù)調(diào)劑用量對(duì)植物矮化的影響花的顏色和大小是重要的觀賞性狀。研究表明,赤霉素在矮牽?；ü谏L(zhǎng)和著色過程中發(fā)揮促進(jìn)作用。矮牽牛的花去除雄蕊后,花冠的生長(zhǎng)和著色都受到影響,但補(bǔ)充赤霉素能部分替代雄蕊在花冠發(fā)育中的作用(Weiss&Halevy,1989);在離體培養(yǎng)條件下,赤霉素能促進(jìn)矮牽?；ò曛蜕L(zhǎng)(Weiss&Halevy,1989),促進(jìn)查爾酮合成酶基因(CHS)的轉(zhuǎn)錄(Weissetal.,1992),對(duì)查爾酮異構(gòu)酶基因(CHI)、二氫葉酸還原酶基因(DFR)和鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶基因(RT)也有相似的促進(jìn)作用(Weissetal.,1995)。根據(jù)這些研究結(jié)果,最初推測(cè)表達(dá)外源GA2–氧化酶的轉(zhuǎn)基因植株花的顏色會(huì)因活性赤霉素的濃度降低而變淺。但試驗(yàn)結(jié)果顯示,所有開花的‘V26’轉(zhuǎn)基因植株中花的顏色都沒有明顯的變化(表1,圖2),同時(shí),使用赤霉素合成抑制劑多效唑處理花蕾導(dǎo)致花冠明顯變小,但顏色沒有明顯的變化(圖6)。這可能是由于矮牽?；ò曛?/p>