蛋白質(zhì)生化技術(shù)

蛋白質(zhì)生化技術(shù)南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院ProteinBiochemistryLabNankaiUniversity葉麗虹SELDI蛋白指紋技術(shù)GSTPull-Down報(bào)告基因系統(tǒng)PTDs蛋白質(zhì)芯片-飛行質(zhì)譜系統(tǒng)及其

在分子生物學(xué)中的應(yīng)用背景介紹

蛋白指紋質(zhì)譜技術(shù)（SELDI，SurfaceEnhancedLaserDesorption/Ionization，表面增強(qiáng)激光解吸技術(shù)）是2002年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的核心技術(shù)，具有快速、簡單和靈敏等優(yōu)點(diǎn),它不僅可在腫瘤診斷中用于發(fā)現(xiàn)標(biāo)志物、觀察治療效果,還可用于研究蛋白質(zhì)的修飾、相互作用、信號傳導(dǎo)和酶促調(diào)節(jié)等,從而實(shí)現(xiàn)在蛋白質(zhì)水平的大規(guī)模功能研究。傳統(tǒng)蛋白組學(xué)研究（2D-MS）的局限性由于外加電場下的PH梯度不穩(wěn)定，重復(fù)性差加樣量小，分離的蛋白質(zhì)很難鑒定可分析的蛋白質(zhì)最多約1500種，難以檢出蛋白質(zhì)中占很大比例的低豐度蛋白質(zhì)對于分離跨膜蛋白仍是技術(shù)難點(diǎn)電泳膠上的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)很大部分包含一種以上蛋白，以依次鑒定單個(gè)蛋白斑點(diǎn)為基礎(chǔ)，限制了檢測通量消耗時(shí)間長，一次電泳要5小時(shí)以上對技術(shù)水平要求高，不能完全自動(dòng)化染色轉(zhuǎn)移等環(huán)節(jié)操作技術(shù)條件要求高，耗時(shí)，不適應(yīng)于大規(guī)模篩查和臨床檢測SELDI技術(shù)的優(yōu)勢直接用粗生物樣品（血清、尿、體液）進(jìn)行分析同時(shí)快速發(fā)現(xiàn)多個(gè)生物標(biāo)記物微量樣品(asfewas2000cellsforLCMsamples)高通量的驗(yàn)證能力（with1000sofsamplesamonth）發(fā)現(xiàn)低豐度蛋白質(zhì)測定疏水蛋白質(zhì):與“雙相電泳加飛行質(zhì)譜”相比，除了有相似功能外，并可增加測定疏水蛋白質(zhì)在同一系統(tǒng)中集發(fā)現(xiàn)和檢測為一體特異性高：利用單克隆抗體芯片，可鑒定未知抗原/蛋白質(zhì)，以減少測定蛋白質(zhì)序列的工作量可以定量：利用單克隆抗體芯片，由于結(jié)合至芯片上的抗體是定量的，故可以測定抗原量，但一般飛行質(zhì)譜不用于定量分析功能廣：

I.利用單克隆抗體芯片,可替代WesternBlotII.利用單克隆抗體芯片,可互補(bǔ)流式細(xì)胞儀不足的功能，如將細(xì)胞溶解，可測定細(xì)胞內(nèi)的抗原,而且靈敏度遠(yuǎn)高于流式細(xì)胞儀系統(tǒng)介紹

SELDI技術(shù)的蛋白質(zhì)芯片－飛行時(shí)間質(zhì)譜儀器由三部分組成：蛋白質(zhì)芯片閱讀器（ProteinChipReader）飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測系列（PBSIIC系列）分析軟件（ProteinChip軟件）。操作流程示意圖生物初樣品（血清/細(xì)胞裂解液）：蛋白質(zhì)通過親合作用結(jié)合到芯片的化學(xué)或生物位點(diǎn)上；清洗蛋白質(zhì)芯片：用水洗去非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)和緩沖液中的雜質(zhì)，以消除干擾；加能量吸收分子EAM（EnergyAbsorbMolecule）or“Matrix”：芯片經(jīng)室溫干燥后，加能量吸收分子EAM到每個(gè)點(diǎn)上，使其與蛋白質(zhì)結(jié)成混合晶體，以促進(jìn)蛋白質(zhì)在飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測中的解吸附和離子化SELDI蛋白質(zhì)芯片的制備123飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測激光解吸電離的方法將保留在芯片上的蛋白質(zhì)解離出來電離的蛋白質(zhì)可以通過飛行時(shí)間質(zhì)譜被精確地測定出它們的質(zhì)量ProteinChipReader工作草圖ProteinChip

軟件化學(xué)表面芯片

分為疏水、親水、陽離子、陰離子和金屬離子螯合芯片五種，用于檢測未知蛋白，獲取指紋圖譜?；瘜W(xué)表面芯片可以直接用粗生物樣品（血清、尿樣、體液）進(jìn)行分析，能同時(shí)快速發(fā)現(xiàn)多個(gè)生物標(biāo)記物，測定疏水蛋白質(zhì)特別是膜蛋白。芯片的種類生物表面芯片

生物表面芯片分為抗體－抗原、受體－配體和DNA－蛋白質(zhì)芯片等種類，可顯示與之相結(jié)合的抗原或者配體的不同分子量亞型，這種芯片的特異性高，可以定量。

蛋白質(zhì)芯片系統(tǒng)提供了一個(gè)單一、快速和特異的平臺，成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的多個(gè)領(lǐng)域的強(qiáng)大平臺。能夠用于下列研究：生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)、表達(dá)差異繪圖、作用差異繪圖、抗體抗原作用、DNA與蛋白的相互作用、蛋白鑒定和多肽作圖、蛋白質(zhì)純化、表位作圖、糖基化分析、磷酸化/信號傳導(dǎo)途徑分析、蛋白與蛋白之間作用、受體配體作用、毒性標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)、臨床數(shù)據(jù)分析等。在發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物上的優(yōu)勢抓住了疾病的本質(zhì)，絕大多數(shù)疾病都有特異的生物標(biāo)志物（Bio-marker），在SELDI技術(shù)中質(zhì)譜的峰值是對這些生物標(biāo)志物最直接的反映。有一套靈敏的檢測系統(tǒng)來檢測和識別這些微量的生物標(biāo)志物。發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物

能夠?qū)υS多不同的樣品進(jìn)行比較分析，軟件功能強(qiáng)大，分析獲得的譜圖可以多種形式表示，并應(yīng)用疊加合成等手段篩選出特別的差異峰，從而確定生物標(biāo)志物，該方法迅速便捷。蛋白質(zhì)純化

提供了便捷的蛋白質(zhì)純化方法，能夠優(yōu)化最佳色譜條件（如PH值、洗脫條件），對目的蛋白質(zhì)進(jìn)行有效的分離。蛋白質(zhì)鑒定從蛋白質(zhì)芯片對結(jié)合的蛋白質(zhì)進(jìn)行消化，或者事先對蛋白質(zhì)混合物進(jìn)行蛋白酶切處理，再結(jié)合到蛋白質(zhì)芯片。結(jié)合質(zhì)譜分析，能夠得到消化片段的分子量，從數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索就能夠獲得相應(yīng)蛋白質(zhì)的序列信息。分子間作用預(yù)先對芯片的點(diǎn)進(jìn)行處理，偶聯(lián)抗體或者其他蛋白（或者其他的誘餌分子），制備定制芯片。將待檢測包含可能結(jié)合分子的溶液與芯片進(jìn)行雜交，洗脫后對結(jié)合上的綁定蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜分析，獲得結(jié)合蛋白質(zhì)的相關(guān)信息。轉(zhuǎn)錄后修飾

能夠確定樣品中特定分子量的蛋白質(zhì)，而這些蛋白質(zhì)的各種修飾對分子量的改變導(dǎo)致了獲得相應(yīng)峰的位移，從而精確表述蛋白質(zhì)的修飾狀況。臨床應(yīng)用

蛋白質(zhì)指紋質(zhì)譜技術(shù)目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多種疾病，如癌癥、老年病、傳染性疾病、心血管病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床診斷，其中應(yīng)用于癌癥的最多，被認(rèn)為是分子醫(yī)學(xué)的一場革新，極大的提高了各種疾病的診斷率。疾病的診斷、療效監(jiān)測和預(yù)后判斷

腫瘤：前列腺癌乳腺癌卵巢癌膀胱癌白血病肺癌腦癌大腸癌其它疾病：急性腎功能衰竭急性心力衰竭,動(dòng)脈硬化癥暴露在空氣中的毒素神經(jīng)精神病學(xué)：早老性癡呆憂郁癥精神分裂癥巴金森氏Huntington’s傳染?。篐IV鼠疫桿菌Yersiniapestis分支桿菌Mycobacterium柄細(xì)菌Caulobacter鏈球菌Streptococcus肉毒中毒Botulism盶病毒Prions黑死病病毒Yersinia臨床診斷腫瘤肝癌甲胎蛋白AFP91%89%

肺癌NSE82%95%

胃癌癌胚抗原CEA91%94%

前列腺癌PSA83%97%

乳腺癌癌抗原CA15393%91%

卵巢癌癌抗原CA12599%99%

腸癌癌胚抗原CEA83%92%

胰腺癌CA19982%85%

膀胱癌尿液檢測93%87%鼻咽癌92%97%食道癌84%91%喉癌97%97%腫瘤傳統(tǒng)標(biāo)志物靈敏度特異性SELDI腫瘤蛋白指紋發(fā)病機(jī)理研究

著名的艾滋病學(xué)家何大一教授借助SELDI技術(shù)，在3個(gè)月內(nèi)所定了α-defensin1，2，3三種蛋白對艾滋病有抑制作用，這是正常人體內(nèi)沒有的蛋白質(zhì)，這一發(fā)現(xiàn)使研制艾滋病蛋白抑制劑一直成為可能。乙肝病毒感染-肝硬化-肝癌是導(dǎo)致乙肝患者最終死亡的發(fā)病三步曲，通過SELDI，檢測乙肝病毒攜帶者、肝硬化及肝癌病人的血清蛋白，發(fā)現(xiàn)三種疾病的質(zhì)譜峰，檢測其它樣品時(shí)靈敏度為80%，特異性為81.8%，這種手段無創(chuàng)傷，并且可以不間斷的跟蹤檢測，為正確治療提供科學(xué)可靠的技術(shù)依據(jù)。其他應(yīng)用新藥開發(fā)與藥理學(xué)研究，藥物毒性實(shí)驗(yàn)等，利用SELDI技術(shù)可以準(zhǔn)確的側(cè)到藥物中的特異基因，活性基因與滅活基因。對臨床用藥具有很好的有指導(dǎo)作用?；A(chǔ)理論研究：蛋白質(zhì)的純化，蛋白質(zhì)的鑒定，蛋白質(zhì)功能的研究，已知樣品中某種功能蛋白，可通過該技術(shù)尋找功能蛋白。蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用研究，如有已知抗體、受體酶，可用該技術(shù)獲得其靶蛋白（抗原、配體和底物），形成DNA或者RNA結(jié)合蛋白的研究，確定抗原決定簇，蛋白質(zhì)磷酸化，糖基化研究，用于尋找與疾病有關(guān)的磷酸化，蛋白及新型生物標(biāo)志物的開發(fā)與應(yīng)用等。GSTPull-Down（谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶沉淀試驗(yàn)）方法尋找結(jié)合蛋白ProteinBiochemistryLabNankaiUniversity背景蛋白質(zhì)間相互作用的研究作為了解蛋白質(zhì)生物功能的重要手段之一，在功能基因組學(xué)研究中極為重要。蛋白質(zhì)間相互作用存在于機(jī)體每個(gè)細(xì)胞的生命活動(dòng)過程中。生物學(xué)中的許多現(xiàn)象如細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和癌變等均受蛋白質(zhì)間相互作用的調(diào)控。ProteinBiochemistryLabNankaiUniversity簡介GSTPull-down技術(shù)是近年來發(fā)展的一種敏感性及特異性均較高的體外鑒定兩蛋白之間相互作用的重要方法1991年由Kaelin的研究組最早應(yīng)用GSTPull-down技術(shù)在混合蛋白溶液尋找到結(jié)合蛋白利用谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（glutathioneS-transferase，GST）融合蛋白對谷胱甘肽偶聯(lián)球珠的親和性，從可能含有相互作用蛋白的溶液中純化相互作用的蛋白ProteinBiochemistryLabNankaiUniversity實(shí)驗(yàn)步驟原核表達(dá)并純化GST融合的已知蛋白。同時(shí)，應(yīng)用放射性同位素（35S）對細(xì)胞裂解物進(jìn)行標(biāo)記。將GST融合蛋白與標(biāo)記好的細(xì)胞裂解物混合，同時(shí)加入谷胱甘肽偶聯(lián)球珠，溫浴使得融合蛋白的GST能夠與球珠結(jié)合。通過離心方法收集GST融合蛋白以及與其結(jié)合的可能的蛋白分子。在收集到的混合物中加入谷胱甘肽或者直接煮沸，使得目的的混合物能夠從球珠上洗脫下來，溶解在SDS上樣緩沖液中。將獲得的混合物進(jìn)行SDS電泳，進(jìn)行放射自顯影或者蛋白染色，進(jìn)而轉(zhuǎn)膜進(jìn)行Westernblotting實(shí)驗(yàn)鑒定。還可應(yīng)用質(zhì)譜的方法對找到的結(jié)合蛋白進(jìn)行分析，確定未知蛋白的氨基酸組成，從而找到與已知蛋白結(jié)合的因子。ProteinBiochemistryLabNankaiUniversity應(yīng)用確定融合蛋白與未知蛋白間新的相互作用證實(shí)融合蛋白與已知蛋白質(zhì)間可能的相互作用ProteinBiochemistryLabNankaiUniversityGSTPull-Down檢測蛋白的作用原核表達(dá)的已知蛋白細(xì)胞裂解液中的未知蛋白質(zhì)應(yīng)用cDNA文庫，進(jìn)行體外翻譯的蛋白質(zhì)文庫中的未知蛋白半定量檢測蛋白與蛋白的親和作用ProteinBiochemistryLabNankaiUniversityGSTProteinXGST35S-labledcelllysate(glutathione-sepharosebeads)(glutathione-sepharosebeads)35S-labledcelllysateGSTProteinXGSTGSTInteractat40CMicrofugetocollectcomplexesProteinBiochemistryLabNankaiUniversity實(shí)驗(yàn)步驟123autoradiographAnalyzebySDSLane1.MarkerLane2.GST-proteinXLane3.GSTGSTGSTProteinXProteinBiochemistryLabNankaiUniversity實(shí)驗(yàn)步驟prepareproteinextractfrombrainmixandincubateexpressGST-fusionproteininE.colipGEXGSTgeneXProteinBiochemistryLabNankaiUniversityProteinBiochemistryLabNankaiUniversityGST-fusionproteinGSTaloneGSTpulldown驗(yàn)證兩種已知蛋白質(zhì)的相互作用舉例inputGSTY-GFP+++X-GSTY-GFPX-GFP+++GSTinput105kDAnti-GFPAnti-GFPY-GSTX-GFPProteinBiochemistryLabNankaiUniversity報(bào)告基因系統(tǒng)gene；luciferase；greenfluorescentprotein報(bào)告基因(reportgene)是指一組編碼易被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因，將其與目的基因融合表達(dá)后，可通過報(bào)告基因產(chǎn)物的表達(dá)來“報(bào)告”目的基因的表達(dá)調(diào)控。這項(xiàng)技術(shù)靈敏度高、檢測簡便可靠、適于大規(guī)模生產(chǎn)，因而在監(jiān)測細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，基因表達(dá)和藥物篩選等方面得到廣泛應(yīng)用。一般的報(bào)告基因需要滿足以下幾個(gè)條件：(1)基因被克隆并且已知全序列；(2)宿主不存在報(bào)告基因產(chǎn)物或者不存在類似的內(nèi)源性物質(zhì)；(3)表達(dá)產(chǎn)物易被檢測；(4)報(bào)告分子的分析結(jié)果應(yīng)具有很寬的線形圍，以便分析啟動(dòng)子活性的幅度變化?；(5)報(bào)告基因在細(xì)胞或動(dòng)物內(nèi)表達(dá)對其正常的生理作用或活性沒有影響?，F(xiàn)主要以目前應(yīng)用最廣泛的報(bào)告基因熒光素酶和綠色熒光蛋白為例，綜述報(bào)告基因的新近應(yīng)用研究進(jìn)展。1熒光素酶(1uciferase，luc)luc是能催化熒光素或者脂肪醛氧化發(fā)光的一類酶的總稱。根據(jù)來源不同主要分為細(xì)菌熒光素酶(bacter