第一章-蛋白質(zhì)的分離與純化課件

第一章蛋白質(zhì)的分離與純化

蛋白質(zhì)分離純化的一般原則（掌握）

分配層析的基本理論（重點(diǎn)掌握）

蛋白質(zhì)的層析分離技術(shù)離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析等

主要掌握操作要點(diǎn)及操作過程的注意事項(xiàng)

蛋白質(zhì)的電泳分離技術(shù)

不連續(xù)系統(tǒng)原理（重點(diǎn)掌握）

SDS技術(shù)（重點(diǎn)掌握）、IEF（一般了解）

蛋白質(zhì)的濃縮（了解）第一節(jié)

蛋白質(zhì)分離純化的一般原則蛋白質(zhì)純化的一般設(shè)計(jì)原則1.材料的選擇與破碎2.建立蛋白質(zhì)的活性測(cè)定方法3.分離純化應(yīng)遵循分級(jí)分離、先粗后細(xì)的原則4.分離純化條件根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的材料，應(yīng)遵循：目的蛋白含量及生物活性盡可能高材料來源方便、成本低、易操作可溶性及穩(wěn)定性要盡可能好

材料的選擇

注意：不同的生物體、不同生理狀態(tài)、不同組織細(xì)胞的蛋白質(zhì)含量和分布有很大差異

預(yù)處理：將不必要的結(jié)締組織、脂肪組織等在盡可能接近生命狀態(tài)下剔除，處理后應(yīng)立即使用或在冷庫中保存

細(xì)胞的破碎先要將細(xì)胞和組織破碎，使蛋白質(zhì)充分釋放出來

機(jī)械法勻漿：破碎機(jī)體軟組織最常用方法之一組織搗碎：注意維持低溫環(huán)境研磨：破碎單一細(xì)胞的有效方法，主要用于細(xì)菌、酵母等的破碎

物理法

超聲法：輸入高能超聲波可以破碎細(xì)胞，破碎效率取決于聲頻、聲能、處理時(shí)間、細(xì)胞濃度及細(xì)胞類型等在處理少量樣品時(shí)操作簡(jiǎn)便、效率高，液量損失少，適于實(shí)驗(yàn)室使用

注意:超聲波產(chǎn)生自由基團(tuán)和造成的溶液溫度升高，可造成敏感的活性物質(zhì)變性失活，另外噪聲也比較大

反復(fù)凍融法：由于在此過程中易使活性蛋白失活，故適用于提取非常穩(wěn)定的蛋白質(zhì)

冷熱交替法：絕大多數(shù)細(xì)胞被破壞，一般適用于從細(xì)菌或病毒中提取蛋白質(zhì)

低滲裂解：是指無胞壁細(xì)胞在低滲溶液中通過滲透張力作用裂解的方法，常用于紅細(xì)胞的裂解

化學(xué)法

有機(jī)溶劑法：有些有機(jī)溶劑(如苯、甲苯等)可以改變細(xì)胞壁或膜的通透性，使內(nèi)含物有選擇性的滲透出來

表面活性劑(去垢劑)：常用的有十二烷基磺酸鈉、TritonX-100、去氧膽酸鈉等

酶解法：必須根據(jù)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成選擇適當(dāng)?shù)拿柑禺悺⒖焖?、精確、可重復(fù)、經(jīng)濟(jì)總蛋白含量蛋白質(zhì)比活性（specificactivity）得率利用溶解度的差異分離

鹽析法：最經(jīng)典的方法，常用來進(jìn)行粗分離常用中性鹽，主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉等，其中應(yīng)用最廣的是硫酸銨

影響鹽析的因素很多，如pH、溫度、蛋白質(zhì)濃度等都會(huì)影響各種蛋白質(zhì)的鹽析點(diǎn)鹽析硫酸銨沉淀

有機(jī)溶劑沉淀法：有機(jī)溶劑能降低溶液的介電常數(shù)，從而減少氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)的解離，降低蛋白質(zhì)分子表面電荷，使蛋白質(zhì)分子聚集導(dǎo)致溶解度的降低；另外有機(jī)溶劑與水的作用，能破壞蛋白質(zhì)的水化膜，使蛋白質(zhì)在一定濃度的有機(jī)溶劑中沉淀析出

溫度：在一定溫度范圍內(nèi)(0～40℃之間)，大部分球狀蛋白質(zhì)的溶解度隨溫度升高而增加

等電點(diǎn)法：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于等電點(diǎn)pH時(shí)，蛋白質(zhì)的凈電荷為零，由于相鄰蛋白質(zhì)分子之間沒有靜電斥力而趨于凝集(aggregation)和沉淀(precipitation)，它的溶解度達(dá)到最低等電點(diǎn)沉淀

根據(jù)分子量的不同分離

透析(dialysis)和超濾(ultrafiltration)：是利用蛋白質(zhì)分子不能通過半透膜的性質(zhì)，使蛋白質(zhì)和其它小分子物質(zhì)如無機(jī)鹽、單糖、水等分開

平衡離心法：根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小、形狀不同進(jìn)行分離的技術(shù)

凝膠過濾(gelfiltration)：又稱分子篩層析(molecularsievechromatography)，這是根據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì)混合物的最有效方法之一透析過程

根據(jù)電荷的不同分離電泳區(qū)帶電泳：如醋酸纖維薄膜電泳，PAGE等

等電聚焦(isoelectricfocusing,IEF)

：具有更高分辨率的電泳技術(shù)

毛細(xì)管電泳(capillaryelectrophoresis,CE)：在細(xì)孔管或毛細(xì)管中進(jìn)行電泳分離。柱效高、分析時(shí)間短，所用樣品量及試劑消耗少，操作模式多，可以進(jìn)行在線檢測(cè)和自動(dòng)化

Agilent3DCE毛細(xì)管電泳系統(tǒng)離子交換層析

親和層析親和層析法可在溫和條件下操作，純化過程簡(jiǎn)單、快速、分辨率高，對(duì)分離含量少且性質(zhì)不穩(wěn)定的生物活性物質(zhì)極為有效注意：應(yīng)該盡量減少純化步驟，縮短操作時(shí)間

目的：避免目的蛋白的變性，保證其生物活性

緩沖液(buffer)

鹽、金屬離子和螯合劑

還原劑

去垢劑

(detergent)

蛋白酶抑制劑

蛋白質(zhì)的環(huán)境因素第二節(jié)層析的基本理論1906年M.Tswett

AdsorptionChromatography1941年MartinandSynge

PartitionChromatography

PlatetheoryRatetheory

假設(shè)有兩種互不混溶的溶劑S和M，將A物質(zhì)溶于一定量的S溶劑中，再加入一定量的M溶劑

A物質(zhì)在兩相中相互擴(kuò)散

A物質(zhì)在兩相中達(dá)到了平衡(在同一時(shí)間內(nèi)，進(jìn)出兩相的A物質(zhì)的分子數(shù)完全相等)時(shí)，其分配系數(shù)為常數(shù)

一、分配定律CAS

分配定律表明：

一定的條件下，一定的物質(zhì)其K值不變

條件改變其K值隨之改變

K值大于1，物質(zhì)在S相中的濃度大于其在M相中濃度CAM=K二、分配層析的機(jī)理

假設(shè)有兩種物質(zhì)，在一定的條件下，它們的分配系數(shù)K不同，則通過一根分配層析柱可以將它們分離。為了便于討論，我們做如下幾個(gè)假設(shè)：（1）層析柱可分成許多層，M是流動(dòng)相，S是固定相，M和S是互不混溶（2）分配層析柱中，每一層左右相通，層與層之間互不相通，也就是說在層析柱中只有橫向擴(kuò)散而無縱向擴(kuò)散

分配層析柱理論塔板示意圖（3）在分配層析柱中，溶質(zhì)在兩相中達(dá)到分配平衡的速度很快，并且A物質(zhì)的存在不影響B(tài)物質(zhì)的分配性質(zhì)，反之亦然（4）在該溶劑系統(tǒng)中，A和B兩物質(zhì)的分配系數(shù)分別設(shè)為：KA=CASCAM=1KB=CBSCBM=1/3

如果在層析開始時(shí)，在第一層的S相中同時(shí)加入A和B兩種物質(zhì)，加入的量均為1。根據(jù)分配定律，M加入后，在兩相中立刻進(jìn)行分配，并且很快達(dá)到分配平衡。第一次分配前后A和B物質(zhì)在S和M相中的量為：A和B物質(zhì)在層析柱中1.分配10次；2.分配20次；3.分配30次二者之間總是存在著一定的偏差，這是因?yàn)椋簩游鲋锌偸腔蚨嗷蛏俚卮嬖谥v向擴(kuò)散層析過程不可能在絕對(duì)分配平衡的情況下進(jìn)行

理論曲線和實(shí)際洗脫曲線是否相符？因此，通常實(shí)際的洗脫曲線都比理論曲線低而寬

Martin和Synge計(jì)算了硅膠柱的理論塔板數(shù)，求得一個(gè)理論塔板的高度為0.002厘米

Verzele計(jì)算為0.02厘米

1厘米的層析柱最少有50個(gè)理論塔板，那么，在一根20厘米的層析柱上最少可以進(jìn)行1000

次分配。

一根分配層析柱上到底能進(jìn)行多少次分配？塔板理論的要點(diǎn)：

分配層析柱象分餾柱一樣可以分成很多層，每層為一理論塔板，其高度為理論塔板高度。在一定的條件下，一根分配層析柱的理論塔板數(shù)是一定的在分配層析柱中，物質(zhì)只有橫向擴(kuò)散，沒有縱向擴(kuò)散，而且在兩相間達(dá)到分配平衡的速度很快體系中其他物質(zhì)的存在不影響待分離物質(zhì)的分配。待分離物質(zhì)的存在也不影響其他物質(zhì)的分配在分配層析柱上，物質(zhì)在各個(gè)理論塔板中的含量可通過計(jì)算求得三、塔板理論第三節(jié)蛋白質(zhì)的層析分離

層析柱泵系統(tǒng)（緩沖液）檢測(cè)器（記錄儀）部分收集器液相層析的基本裝置一、離子交換層析

(ionexchangechromatography)

原理：利用生物大分子與具有相反電荷的離子交換劑之間相互作用不同而進(jìn)行的分離

類型：陰離子交換劑(anion-exchangechromatography)

陽離子交換劑(cation-exchangechromatography)

樣品的準(zhǔn)備劑型的選擇離子交換劑的預(yù)處理裝柱(樣品體積的2-5倍）

柱效應(yīng)的標(biāo)定上樣洗脫

操作要點(diǎn)：

分步洗脫法(stepwiseelution)

梯度洗脫法(gradientelution)

目的蛋白的鑒定與回收離子交換劑的再生與儲(chǔ)存離子交換層析

原理：

利用分子篩效應(yīng)分離提純具有生物活性的生物大分子物質(zhì)二、凝膠過濾層析(gelfiltrationchromatography)

凝膠的種類：

瓊脂糖凝膠(Sepharose)

交聯(lián)葡聚糖凝膠(Sephadex)

聚丙烯酰胺基葡聚糖凝膠(Sephacryl)樣品的準(zhǔn)備凝膠的選擇與處理裝柱（L:W=50-100:1）

柱填充的檢測(cè)

上樣（1%-5%)洗脫

目的蛋白的鑒定與回收層析柱再生與儲(chǔ)存操作要點(diǎn)：

凝膠過濾層析的應(yīng)用：

脫鹽蛋白質(zhì)分離相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定凝膠過濾用途蛋白質(zhì)純化蛋白質(zhì)純化后脫鹽蛋白質(zhì)分子量測(cè)定研究蛋白質(zhì)寡聚體

原理：利用生物大分子與其特異性配基的專一性識(shí)別和可逆性結(jié)合而建立起來的分離方法

三、親和層析

(affinitychromatography)改變大分子物質(zhì)與配體之間的親和力改變pH梯度

洗脫：親和層析四、其它層析技術(shù)高效液相層析

(HPLC)疏水作用層析

(hydrophobicinteractionchromatography)反相層析

(reversedphasechromatography)第四節(jié)蛋白質(zhì)的電泳分析一、定義(electrophoresis)

帶電質(zhì)點(diǎn)或顆粒在電場(chǎng)作用下向著與其電性相反的方向運(yùn)動(dòng)需要說明以下幾點(diǎn)：

帶電質(zhì)點(diǎn)可以是帶電的膠體顆粒、離子、甚至一些非極性的物質(zhì)，只要其顆粒在膠體大小范圍，在電場(chǎng)中也能向其相反方向運(yùn)動(dòng)

帶電質(zhì)點(diǎn)的凈電荷與遷移率有關(guān)，帶電性質(zhì)決定其運(yùn)動(dòng)方向

生物體內(nèi)的小分子，氨基酸、多肽、嘌呤、嘧啶及超過小分子的病毒、細(xì)胞器在電場(chǎng)中都能向與其電性相反的方向運(yùn)動(dòng)三、電泳的分類在溶液中進(jìn)行的沒有支持介質(zhì)的電泳，也稱移動(dòng)界面電泳(movingboundaryelectrophoresis)自由電泳

(freeelectrophoresis)區(qū)帶電泳(zoneelectrophoresis)

將應(yīng)用支持介質(zhì)的電泳稱為區(qū)帶電泳另一涵義：它表示在一個(gè)電場(chǎng)的作用下，在某一種支持介質(zhì)上，能將一種混合物分離成若干條區(qū)帶(若干組分)的電泳過程

是帶電的物質(zhì)，都可采用某種電泳技術(shù)，分離成不同位置的區(qū)帶，對(duì)區(qū)帶可進(jìn)行定性或定量分析樣品用量少設(shè)備簡(jiǎn)單可在室溫進(jìn)行操作簡(jiǎn)便，消耗時(shí)間不多不同類型的電泳，有不同的用途改進(jìn)或找到更好的支持介質(zhì)，就有可能大大提高分辨率

區(qū)帶電泳只所以發(fā)展如此迅速，是由其本身的優(yōu)點(diǎn)決定的：

任意物質(zhì)質(zhì)點(diǎn)，由于