電紡復(fù)合纖維膜的制備及其細(xì)胞的體外培養(yǎng)

電紡復(fù)合纖維膜的制備及其細(xì)胞的體外培養(yǎng)

膜是眼睛的透明部分，覆蓋著膜、瞳孔和前室。這是一個(gè)重要的光譜手段。光線通過膜和龔膜后，可以準(zhǔn)確地聚焦在視網(wǎng)膜上形成清晰的圖像。作為眼腈的第一個(gè)屏障，該膜完成了90%以上的光學(xué)功能，在維持視覺方面發(fā)揮著重要作用。然而，由于外部或自身疾病的影響，分子組織容易受到外部或自身疾病的損害，導(dǎo)致虛弱和眼盲。目前,治療角膜盲最有效的方法是角膜移植,但因角膜供體嚴(yán)重缺乏、術(shù)后發(fā)生免疫排斥反應(yīng)和醫(yī)源性散光等問題而受到限制.組織工程角膜技術(shù)的興起為治療各種可導(dǎo)致失明的角膜疾病帶來(lái)了希望.該技術(shù)的基本方法是取少量健康角膜緣組織,經(jīng)體外培養(yǎng)擴(kuò)增后種植于一種生物相容性良好的載體上,在體外形成結(jié)構(gòu)與自體角膜相似的組織工程角膜片,再移植到患者眼表.近20年來(lái),應(yīng)用組織工程技術(shù)構(gòu)建角膜組織的研究取得了很大進(jìn)展[1~5].然而,組織工程角膜支架的制備仍面臨巨大的挑戰(zhàn).基于角膜組織工程技術(shù)的設(shè)想,角膜組織工程支架主要用于模擬細(xì)胞外基質(zhì)、支撐細(xì)胞黏附并為組織形成提供場(chǎng)所.因此,理想的組織工程角膜支架要求其表面有利于角膜細(xì)胞黏附及增殖,形成穩(wěn)定連續(xù)透明的角膜.目前常用的角膜材料有動(dòng)物膠和黏多糖.其中,明膠由膠原蛋白經(jīng)緩和水解制得,其化學(xué)組成與膠原相似,親水性強(qiáng),生物相容性好,有利于保持細(xì)胞活力[5~9].但單純明膠形成的膜質(zhì)較脆,力學(xué)性能欠佳,縫合時(shí)易撕裂,不能滿足移植手術(shù)的縫合要求.人工合成材料如聚乳酸在組織工程中的廣泛應(yīng)用為組織的培養(yǎng)和重建提供了另一種可選擇的載體[5,12,13,14,15,16,17,18],但因疏水性較強(qiáng),不利于細(xì)胞的黏附和增殖,進(jìn)而限制了其應(yīng)用.本文將明膠與聚乳酸進(jìn)行復(fù)合靜電紡絲,可以最大程度地保留明膠分子鏈上的精氨酸(R)-甘氨酸(G)-天冬氨酸(D)(RGD)序列,以增加細(xì)胞的親和力,使材料保持良好的生物相容性;同時(shí)聚乳酸的加入也可以適當(dāng)提高支架材料的機(jī)械強(qiáng)度,通過調(diào)節(jié)明膠與聚乳酸的配比調(diào)控支架的表面性能和力學(xué)性能,使復(fù)合纖維膜更適合細(xì)胞生長(zhǎng)和組織形成,達(dá)到角膜上皮組織體外重建的目的.1實(shí)驗(yàn)部分1.1d-mem/f-12明膠(豬皮A型),Sigma-Aldrich公司;聚乳酸(PLLA,Mw=3.0×105),山東省醫(yī)療器械研究所;六氟異丙醇(HFIP),分析純,上海晶純?cè)噭┯邢薰?D-MEM/F-12,荷蘭Gibco公司;胎牛血清,Hyclone公司;抗角蛋白單克隆抗體,博士德生物公司;Hoechest33342,Sigma-Aldrich公司.其它試劑均為分析純.1.2復(fù)合膜的制備將一定量明膠與聚乳酸先后溶于HFIP中,制成溶質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的混合溶液.明膠與聚乳酸的質(zhì)量比依次為100∶0,85∶15,70∶30,55∶45和40∶60.分別采用JYW-200表面張力儀、SNB-2數(shù)字旋轉(zhuǎn)黏度儀和DDS-12型電導(dǎo)率儀測(cè)試紡絲液的表面張力、黏度和電導(dǎo)率.設(shè)定紡絲電壓15kV,流速0.8mL/h,固定噴絲扣與接收板間距離為18cm,于室溫(25℃)靜電紡絲,制備不同組分配比的明膠/聚乳酸復(fù)合纖維膜.所得纖維膜依據(jù)質(zhì)量配比分別簡(jiǎn)稱為G100P0,G85P15,G70P30,G55P45和G40P60.1.3復(fù)合膜的性能測(cè)試采用傅里葉變換紅外光譜儀(BrukerEQUINO55,德國(guó)Bruker公司)測(cè)定經(jīng)真空干燥處理的復(fù)合膜樣品的紅外吸收光譜.復(fù)合膜噴金后用掃描電子顯微鏡(JEOLJSM6700F,日本電子公司)觀察樣品形貌,并利用Photoshop軟件統(tǒng)計(jì)纖維的平均直徑和直徑分布.采用毛細(xì)管流動(dòng)孔徑分析儀(CFP-1100-AEHXL,PMI公司)測(cè)試復(fù)合膜的孔隙率.在25℃,65%濕度的條件下,以去離子水為介質(zhì),采用接觸角測(cè)定儀(JC2000C2,上海中晨數(shù)字技術(shù)設(shè)備有限公司)測(cè)定復(fù)合膜的表面接觸角,取5次測(cè)定的平均值.將復(fù)合膜樣品切成直徑為15mm的圓片,浸入PBS緩沖液中達(dá)到溶脹平衡,48h后取出,用濾紙小心吸干樣品表面的水分,測(cè)得濕重W1,然后將濕膜于105℃干燥至恒量,置于干燥器中冷卻后,測(cè)得干重W2.膜片的平衡含水量(SR)根據(jù)SR=[(W1-W2)/W1]×100%計(jì)算.將干態(tài)下的復(fù)合膜樣品分別切割成50mm×4mm的啞鈴型樣條,通過微型電子拉力機(jī)[HZ(08)X-06,上海黑子儀器有限公司]測(cè)試復(fù)合膜片的拉伸曲線,并求算抗張強(qiáng)度、彈性模量和斷裂伸長(zhǎng)率.每個(gè)樣品的實(shí)際測(cè)試長(zhǎng)度為17.5mm,拉伸速度為10mm/min,每組平行測(cè)試3個(gè)樣條.將復(fù)合膜樣品在磷酸鹽緩沖液(PBS)中浸泡達(dá)到溶脹平衡,測(cè)試濕態(tài)復(fù)合膜的力學(xué)性能.1.4細(xì)胞培養(yǎng)和表征將復(fù)合膜圓片浸泡在體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇溶液中,在紫外燈下滅菌30min后,用無(wú)菌的Hank’s平衡鹽溶液浸泡洗滌3次,浸入DMEM-F12不完全培養(yǎng)基中,于4℃過夜.次日,將膜片分別移至24孔和96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔加入500和200μL角膜上皮細(xì)胞懸液(密度為1×105Cell/cm2),置于37℃和5%(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的樣品用于常規(guī)噻唑藍(lán)四氮唑溴化物(MTT)比色法測(cè)試,在酶標(biāo)儀(ThermoMultiskanMK3,荷蘭雷勃公司)上測(cè)定490nm處的光吸收值.將24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的樣品培養(yǎng)72h后在倒置相差顯微鏡(WilovertAFL20,德國(guó)Hund公司)下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況;用多聚甲醛固定后進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記,于激光共聚焦顯微鏡(OlympusFV-1000,日本奧林巴斯公司)下觀察細(xì)胞的角蛋白表達(dá).2結(jié)果與討論2.1明膠/聚乳酸配比對(duì)纖維直徑和復(fù)合纖維膜表觀的影響一系列不同配比的明膠/聚乳酸復(fù)合電紡纖維膜的電子顯微鏡照片如圖1所示.可以看出,在相同條件下,各配比所得纖維表面光滑且平直.由圖1(F)的透射電子顯微鏡照片可見,復(fù)合纖維兩相分布均勻,纖維搭接處直徑未發(fā)生變化,證實(shí)纖維支架為通孔結(jié)構(gòu),有利于細(xì)胞長(zhǎng)入支架內(nèi)部,同時(shí)保證了細(xì)胞生長(zhǎng)所需要的物質(zhì)交換.當(dāng)聚乳酸相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0,15%,30%,45%和60%時(shí),平均纖維直徑分別為(1269±67.79),(1299±63.06),(1259±59.20),(1069±55.16)和(921.8±50.13)nm.相對(duì)于純明膠纖維,聚乳酸的加入有效降低了復(fù)合纖維的平均直徑,并且直徑分布也逐漸變窄.這是因?yàn)殡娂徖w維形貌不僅與紡絲條件有關(guān),還與聚合物溶液的物理性質(zhì)直接相關(guān).圖2為混合溶液的表面張力和黏度隨明膠/聚乳酸配比的變化曲線.插圖為純明膠溶液的表面張力曲線.由圖2可見,聚乳酸的加入顯著降低了紡絲溶液的表面張力,增大了黏度.這有利于獲得具有更小直徑的纖維.表1為明膠/聚乳酸混合溶液的電導(dǎo)率和復(fù)合纖維膜的表面性質(zhì).由表1可見,聚乳酸的加入減小了紡絲溶液的電導(dǎo)率.因此,在相同靜電場(chǎng)作用下,由于其靜電誘導(dǎo)作用減弱,可誘導(dǎo)的靜電荷減少,所得纖維直徑趨于均一.由表1還可見,聚乳酸含量升高,纖維直徑減小且趨于均一,孔隙率也隨之減小,使得纖維膜的接觸角增大,平均含水量降低.聚乳酸含量不高于50%時(shí),纖維膜的孔隙率高于60%,平衡含水量高于68%,纖維膜作為組織工程支架有利于細(xì)胞生長(zhǎng).2.2對(duì)稱變形吸收峰圖3為不同配比的復(fù)合纖維膜的紅外譜圖.由圖3可以看出,復(fù)合膜和明膠膜在1650,1540和1243cm-1處都存在吸收峰,分別對(duì)應(yīng)于酰胺Ⅰ帶C＝O伸縮振動(dòng)吸收峰、酰胺Ⅱ帶N—H對(duì)稱變形吸收峰和C—N伸縮振動(dòng)吸收峰;復(fù)合膜和聚乳酸均在1756,1183和1085cm-1處都存在吸收峰,這是由C—O—C伸縮振動(dòng)所引起的.由圖3可見,隨著聚乳酸含量的增加,歸屬于聚乳酸分子的特征峰逐漸加強(qiáng),明膠分子的特征峰逐漸減弱.此外,在復(fù)合膜的紅外譜圖中,歸屬于明膠的N—H和OH—O伸縮振動(dòng)峰由3379cm-1處藍(lán)移至3276cm-1,證實(shí)了分子間存在較弱的氫鍵作用,有利于明膠和聚乳酸在纖維中的均勻分布.2.3復(fù)合膜的拉伸性能對(duì)明膠/聚乳酸復(fù)合纖維膜進(jìn)行拉伸測(cè)試,結(jié)果示于圖4(A)和表2.相對(duì)于明膠膜,復(fù)合膜的彈性模量和拉伸強(qiáng)度均顯著提高,斷裂伸長(zhǎng)率也有所提高;且聚乳酸含量越高,拉伸強(qiáng)度越大.由此可見,聚乳酸的加入可以有效提高復(fù)合膜的拉伸性能.為了考察纖維膜作為組織工程支架用于角膜移植的應(yīng)用性能,進(jìn)一步測(cè)定了水平衡狀態(tài)下濕膜的拉伸性能.由圖4(B)可見,聚乳酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%時(shí),纖維膜呈現(xiàn)斷裂脆性.聚乳酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于15%時(shí),纖維膜呈現(xiàn)韌性斷裂,與天然人角膜具有相近的拉伸強(qiáng)度[(3.81±0.40)MPa],可以滿足移植時(shí)的縫合要求.因此,在細(xì)胞相容性實(shí)驗(yàn)中,主要采用G70P30,G55P45和G40P60三種復(fù)合膜.此外,比較各拉伸性能參數(shù)(表2)可知,濕膜具有較低的彈性模量和拉伸強(qiáng)度,但其斷裂伸長(zhǎng)率則大大提高.這是水溶脹平衡后纖維膜中水合作用的結(jié)果.2.4mtt檢測(cè)纖維膜的密度通過兔角膜上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)評(píng)價(jià)了復(fù)合膜的細(xì)胞相容性.采用倒置相差顯微鏡觀察角膜上皮細(xì)胞在纖維膜表面的分布情況(圖5).結(jié)果表明,G70P30和G55P45膜表面的細(xì)胞密度較大,而在G40P60膜表面的細(xì)胞黏附最少.采用免疫熒光染色對(duì)細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察(圖6).可見,在G70P30膜上生長(zhǎng)的細(xì)胞伸展良好,細(xì)胞密度最大;G55P45膜次之;而在G40P60膜上生長(zhǎng)的細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,細(xì)胞密度最小.由此可見,G70P30膜細(xì)胞相容性最好.這是由于以明膠為基材所制備的纖維膜表面含有較多來(lái)源于明膠分子的RGD序列,有利于細(xì)胞的黏附.故明膠含量越高,細(xì)胞相容性越好.MTT檢測(cè)結(jié)果(圖7)表明,在培養(yǎng)初期,纖維膜的OD值均低于對(duì)照組;但培養(yǎng)5d后,各組OD值均有不同程度升高,其中,G70P30膜的細(xì)胞增殖最為顯著,此結(jié)果與上述免疫熒光檢測(cè)結(jié)果一致.培養(yǎng)9d后,對(duì)照組OD值維持不變,而纖維膜的OD值仍呈上升