噬菌體展示技術(shù)

1噬菌體展示系統(tǒng)

Phageondisplay2

噬菌體展示原理–噬菌體展示定義、分類–簡介噬菌體及淘選過程?噬菌體展示應(yīng)用?淘選過程中常見問題及解決方案噬菌體展示系統(tǒng)

Phageondisplay3

Smith在1985年首次證實外源DNA可以插入絲狀噬菌體基因III中，并與pIII蛋白融合展示。噬菌體表面展示技術(shù)：是一種將外源多肽或蛋白質(zhì)的DNA序列插入到噬菌體外殼蛋白的一個結(jié)構(gòu)基因的適當(dāng)位置上,外源基因?qū)㈦S著外殼蛋白的表達而表達,從而使多肽或蛋白以與外殼蛋白融合表達的形式展示在噬菌體表面。

什么是噬菌體表面展示技術(shù)4

根據(jù)噬菌體不同：溫和噬菌體---M13烈性噬菌體---T7根據(jù)文庫不同：肽庫CDNA文庫抗體庫噬菌體展示系統(tǒng)的分類5M13噬菌體的組成和結(jié)構(gòu)絲狀噬菌體：M13。單鏈DNA病毒,6407bp?；蚪M編碼11種蛋白質(zhì)，其中5種為結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。與展示密切相關(guān)的有pIII、pVIII兩種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。DNA在細菌內(nèi)滾環(huán)復(fù)制，細菌不被裂解，但生長速度減慢，并且分泌大量噬菌體顆粒。6M13噬菌體的生命周期PIII蛋白結(jié)合于E.Coli的F纖毛細菌的Tol蛋白復(fù)合體解聚噬菌體的外殼蛋白，ssDNA轉(zhuǎn)運至胞漿病毒ssDNA進入細菌的胞漿合成dsDNA以dsDNA為模版合成所有的病毒蛋白，且通過滾環(huán)復(fù)制合成組裝病毒所需的ssDNA。第一代噬菌體在感染10分鐘后出現(xiàn)在培養(yǎng)液中感染后1小時內(nèi)平均每個細胞分泌1000個噬菌體7次要外殼蛋白pIII406aa組成，5個拷貝，位于噬菌體的尾部。由三個功能區(qū)組成：N1穿膜區(qū)：作用于E.coli細胞膜上的TolA蛋白；與噬菌體的入侵有關(guān)。N2受體結(jié)合區(qū)：負責(zé)結(jié)合F菌毛。CT疏水區(qū)：組裝前黏附在細菌內(nèi)膜上；與噬菌體組裝終止有關(guān)。G1、G2:甘氨酸片段，在感染過程中，增加各個功能域之間的靈活性8主要外殼蛋白pVIII每子個病毒含約2700個拷貝，約10%能有效地融合外源多肽。以pIII融合子方式表達的是單價的，而以pVIII融合子方式表達的則是多價的。這種多價pVIII展示所增加的親和力有利于篩選到親和力非常低的配體，而單價pIII展示則將篩選限制在具有較高親和力的配體上。9pIII展示和pVIII展示的區(qū)別pVIII展示的多肽比較小，如果太大會影響噬菌體殼蛋白的組裝。pIII只要不影響感染，可以展示更大的多肽及蛋白。絲狀噬菌體展示系統(tǒng)一般是在外殼蛋白pIII或pVIII的N端融合表達外源多肽及蛋白。pVIII展示pIII展示多價展示單價展示篩選到的分子親和力相對低親和力高高拷貝數(shù)增加了抗原性應(yīng)用于肽庫主要應(yīng)用于抗體庫10噬菌體展示技術(shù)流程11噬菌體抗體庫的構(gòu)建建庫：[例子]12噬菌體質(zhì)粒-phagemid噬菌體質(zhì)粒特征：攜帶有欲在噬菌體上融合展示的外源蛋白基因和pIII基因，沒有其他噬菌體基因。有包裝序列信號。（packingsignal）有供篩選的抗生素標(biāo)記基因。Helperphage：提供噬菌體質(zhì)粒復(fù)制、合成ssDNA和病毒包裝所需要的所有蛋白和酶。1314篩選的方法－親和淘選

直接包被淘選法：直接將靶分子包被在固相表面優(yōu)點：簡單直接。缺點：偶爾會導(dǎo)致配體結(jié)合位點難以進入

可能是由于分子的立體封阻

或者是靶分子表面的部分變性而引起液相