化學(xué)品 非洲爪蟾胚胎甲狀腺活性試驗 征求意見稿

1GB/TXXXXX—XXXX化學(xué)品非洲爪蟾胚胎甲狀腺活性試驗警示——使用本文件的人員應(yīng)有正規(guī)實驗室工作的實際經(jīng)驗。本文件并未指出所有可能的安全問題。使用者有責(zé)任采取適當(dāng)?shù)陌踩徒】荡胧?，并保證符合國家有關(guān)法規(guī)規(guī)定的條件。本文件規(guī)定了化學(xué)品非洲爪蟾胚胎甲狀腺活性試驗的術(shù)語定義、受試物信息、參比物、試驗原理、方法描述、試驗程序、質(zhì)量保證與質(zhì)量控制、數(shù)據(jù)分析與試驗結(jié)果評價。本文件適用于評價化學(xué)品對非洲爪蟾胚胎發(fā)育的內(nèi)分泌干擾作用；適用于篩選具有潛在甲狀腺活性的內(nèi)分泌干擾化學(xué)物質(zhì)或非甲狀腺活性的化學(xué)物質(zhì)。本文件不適用于高揮發(fā)性的化學(xué)物質(zhì)；不適用于在非洲爪蟾胚胎中蓄積的化學(xué)物質(zhì)；不適用于在波長450nm～500nm范圍內(nèi)激發(fā)時發(fā)射波長500nm～550nm范圍熒光的化學(xué)物質(zhì)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T21801化學(xué)品快速生物降解性呼吸計量法試驗GB/T21802化學(xué)品快速生物降解性改進(jìn)的MITI試驗（I）GB/T21803化學(xué)品快速生物降解性DOC消減試驗GB/T21831化學(xué)品快速生物降解性密閉瓶法試驗GB/T21845化學(xué)品水溶解度試驗GB/T21852化學(xué)品分配系數(shù)（正辛醇-水）高效液相色譜法試驗GB/T21853化學(xué)品分配系數(shù)（正辛醇-水）搖瓶法試驗GB/T21855化學(xué)品與pH有關(guān)的水解作用試驗GB/T21856化學(xué)品快速生物降解性二氧化碳產(chǎn)生試驗GB/T21857化學(xué)品快速生物降解性改進(jìn)的OECD篩選試驗GB/T22052用液體蒸汽壓力計測定液體的蒸汽壓力溫度關(guān)系和初始分解溫度的方法GB/T22228工業(yè)用化學(xué)品固體及液體的蒸汽壓在10-1Pa至105Pa范圍內(nèi)的測定靜態(tài)法GB/T22229工業(yè)用化學(xué)品固體及液體的蒸汽壓在10-3Pa至1Pa范圍內(nèi)的測定蒸汽壓平衡法GB/T27850化學(xué)品快速生物降解性通則GB/T27861化學(xué)品魚類急性毒性試驗OECD化學(xué)品測試導(dǎo)則No.104OECD化學(xué)品測試導(dǎo)則No.231OECD化學(xué)品測試導(dǎo)則No.241DevelopmentAssay）蒸氣壓（Vapourpressure）兩棲動物變態(tài)試驗（AmphibianMetamorphosisAssay）兩棲動物幼蟲生長發(fā)育試驗（TheLarvalAmphibianGrowthand2GB/TXXXXX—XXXXOECD化學(xué)品測試導(dǎo)則No.310快速生物降解—密閉瓶二氧化碳法（ReadyBiodegradability-CO2inSealedVessels）OECD化學(xué)品測試導(dǎo)則No.316化學(xué)品在水中的光轉(zhuǎn)化—直接光解試驗（PhototransformationofChemicalsinWater–DirectPhotolysis）3術(shù)語、定義和縮略語下列術(shù)語、定義和縮略語適用于本文件。3.1胚胎eleutheroembryo胚胎生命階段是指卵孵化后、但在胚胎能獨立進(jìn)食外源性食物之前的階段，是胚胎正在發(fā)育的階段。3.2GFPgreenfluorescentprotein綠色熒光蛋白。3.3半數(shù)致死濃度medianlethalconcentration;LC50經(jīng)口單次暴露，經(jīng)過統(tǒng)計計算得出的受試物的濃度，該濃度能引起50%的受試動物死亡。3.4最低可見效應(yīng)濃度thelowestobservedeffectconcentration;LOEC觀察到受試物具有統(tǒng)計學(xué)顯著效應(yīng)的最低試驗濃度(p<0.05)。3.5MS-222tricainemethanesulfonate三卡因甲磺酸酯，CAS編號：886-86-2。3.6最大耐受濃度maximumtoleratedconcentration;MTC導(dǎo)致急性死亡率低于10%的最高試驗濃度。3.7無明顯作用濃度thenoobservedeffectconcentration;NOEC未觀察到作用的濃度,是緊鄰LOEC以下的試驗濃度。3.8PTUpropylthiouracil丙硫氧嘧啶。3.9SEMstandarderrorofthemean3GB/TXXXXX—XXXX平均值的標(biāo)準(zhǔn)差。3.10SMILESsimplifiedmolecularinputlineentryspecification簡化分子輸入行輸入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。3.11運行run本文件中指使用獨立的溶液和非洲爪蟾卵執(zhí)行的實驗。3.12加標(biāo)模式spikedmode在濃度為3.25μg/L三碘甲狀腺原氨酸（T3的條件）下運行的非洲爪蟾胚胎甲狀腺活性試驗的部分。3.13未加標(biāo)模式unspikedmode不存在三碘甲狀腺原氨酸的條件下運行的非洲爪蟾胚胎甲狀腺活性試驗的部分。3.14T3triiodothyronine三碘甲狀腺原氨酸。3.15T4thyroxine甲狀腺素。3.16TRthyroidhormonereceptor甲狀腺激素受體。3.17THthyroidhormones甲狀腺激素，包括T3（三碘甲狀腺原氨酸）和T4（甲狀腺素）。3.18THb/ZIP甲狀腺激素β/ZIP轉(zhuǎn)錄因子。3.19UVCBthyroidhormones未知或可變組成的物質(zhì)、復(fù)合反應(yīng)產(chǎn)物或生物材料。4受試物信息4GB/TXXXXX—XXXX4.1在試驗前，應(yīng)掌握受試物的下列必備信息：a)按照GB/T21845的規(guī)定方法測定的水中溶解度；b)按照GB/T22052、GB/T22228、GB/T22229的規(guī)定和見OECD化學(xué)品測試導(dǎo)則No.104的方法測定的蒸氣壓和亨利常數(shù)。4.2可能需要受試物的下列信息：a)結(jié)構(gòu)式；b)純度；c)受試物在水溶液中的定量分析方法；d)按照GB/T21855的方法測定的水解作用；e)按照OECD化學(xué)品測試導(dǎo)則No.316的方法測定的光穩(wěn)定性；f)按照GB/T21852或GB/T21853的方法測定的正辛醇-水分配系數(shù)；g)按照GB/T21801、GB/T21802、GB/T21803、GB/T21831、GB/T21856、GB/T21857、GB/T27850的規(guī)定和見OECD化學(xué)品測試導(dǎo)則No.310的方法測定的快速生物降解性試驗結(jié)果；h)按照GB/T27861的方法測定的魚類的LC50數(shù)據(jù)；i)按照OECD化學(xué)品測試導(dǎo)則No.231、No.241的方法測定的其他兩棲動物的數(shù)據(jù)。4.3測定4.1和4.2中參數(shù)的溫度，應(yīng)在試驗報告中予以說明。5參比物本試驗方法采用三碘甲狀腺原氨酸（T3）、甲狀腺素（T4）為參比物。6試驗原理將6孔板中處于NF45階段轉(zhuǎn)基因THb/ZIPGFP非洲爪蟾（X.laevis）胚胎（以下簡稱“胚胎”）分別置于含有3.25μg/L的T3“加標(biāo)模式”和不含有T3的“未加標(biāo)模式”中。持續(xù)暴露于受試物72h。每項試驗應(yīng)獨立進(jìn)行三次。通過熒光光譜或熒光成像（將熒光信號轉(zhuǎn)換為數(shù)值形式）測量胚胎發(fā)出的GFP熒光。統(tǒng)計分析在加標(biāo)和未加標(biāo)模式下，每個受試物濃度組相比各自對照組胚胎發(fā)出的熒光增加或減少的百分比，判斷受試物是否具有甲狀腺活性。7方法描述7.1試驗條件附錄A列出具體的試驗條件。7.2對照組7.2.1本試驗設(shè)置以下對照組。a)試驗培養(yǎng)液對照組：僅加入試驗培養(yǎng)液的2孔（每孔10個胚胎）。該對照組確定了試驗培養(yǎng)液中的基礎(chǔ)熒光水平。5試驗培養(yǎng)液對照組T3對照組T4對照組受試物：3個濃度+/-T3每組20試驗培養(yǎng)液對照組T3對照組T4對照組受試物：3個濃度+/-T3每組20個胚胎試驗培養(yǎng)液對照組T3對照組T4對照組受試物：3個濃度+/-T3每組20個胚胎3個有效的獨立運行：不同的卵，不同的溶液XETA原始數(shù)據(jù)b)T3對照組：該對照組確定了T3濃度為3.25μg/L時的熒光水平。該濃度相當(dāng)于非洲爪蟾變態(tài)期間的血漿T3激素濃度，是已知能誘導(dǎo)變態(tài)前胚胎的形態(tài)變化和TH靶基因調(diào)控的濃度。該對照組用作無T3共同處理組的陽性對照組和接受T3共同處理組的參比對照。c)T4對照組（飽和對照組）：該對照組確立了實驗中可定量測量的最大熒光水平。該對照作為T3共處理組的陽性對照，與試驗培養(yǎng)液對照組一起確定了實驗的熒光動態(tài)范圍。7.2.2如果使用溶劑，應(yīng)在試驗培養(yǎng)液對照組、T3對照組和T4對照組中加入相同濃度的溶劑（見7.10）。7.3重復(fù)次數(shù)1項試驗由3次獨立、有效的運行組成，每個處理組使用2×10個胚胎（見圖1）。每次運行應(yīng)使用獨立的溶液和卵（見第37段）。3次運行可依次進(jìn)行，也可平行進(jìn)行。通過合并三次運行的數(shù)據(jù)得到每個處理組n=60的熒光值，獲得受試物的原始數(shù)據(jù)。試驗培養(yǎng)液對照組T3對照組T4對照組受試物：3個濃度+/-T3每組20個胚胎將每組20個熒光值合并為每組60個值試驗培養(yǎng)液對照組T3對照組T4對照組受試物：3個濃度+/-T3每組60個胚胎檢查有效性進(jìn)行統(tǒng)計分析圖1方法概述注：本試驗由3次獨立運行組成，共使用540個胚胎。如果之前未對溶劑進(jìn)行本試驗且結(jié)果顯示為陰性（需要增加120個胚胎），則除試驗培養(yǎng)液對照組和T3對照組外，應(yīng)在每次運行中設(shè)置一個溶劑對照組和一個T3溶劑對照7.4熟練程度證明7.4.1熒光定量測量預(yù)實驗為確保對每個胚胎發(fā)出的熒光進(jìn)行準(zhǔn)確的定量測量，應(yīng)通過預(yù)實驗校準(zhǔn)熒光光譜儀，詳見附錄B。也可使用配有適當(dāng)照相機(jī)的熒光顯微鏡成像，對胚胎發(fā)出的熒光進(jìn)行定量測量。在這種情況下，使用T3濃度范圍獲得的熒光誘導(dǎo)幅度應(yīng)符合與熒光光譜儀相同的標(biāo)準(zhǔn)；宜使用與附錄B中熒光光譜儀相同的程序優(yōu)化圖像采集和圖像分析參數(shù)。宜使用配有適當(dāng)攝像頭的熒光顯微鏡，因為這樣可對圖片執(zhí)行質(zhì)量控6GB/TXXXXX—XXXX制步驟，以識別錯位的胚胎或與甲狀腺激活無關(guān)的熒光信號（熒光灰塵或纖維、胚胎中蓄積的受試物熒光、異常熒光模式）。7.4.2能力驗證化學(xué)品在正式使用本試驗方法測受試物之前，實驗室應(yīng)對表1中列出的四種能力驗證化學(xué)品進(jìn)行本試驗，通過得到正確的分類結(jié)果來證明技術(shù)熟練度。表1能力驗證化學(xué)品67-64-17.5儀器設(shè)備除常規(guī)實驗室儀器設(shè)備外，還需要以下設(shè)備：a)實驗室培養(yǎng)箱或適當(dāng)?shù)臏囟群凸庹湛刂蒲b置；b)由化學(xué)惰性材料制成的透明細(xì)胞培養(yǎng)級6孔板；c)經(jīng)熒光定量測量確認(rèn)的圓錐形、底部黑色的96孔板；d)pH計；e)配備光源的體視顯微鏡（用于觀察和分選胚胎）；f)熒光光譜儀（96孔酶標(biāo)儀）或配備用于GFP熒光定量測量的熒光顯微鏡；g)適用于受試物的分析儀器。7.6受試生物采用THb/ZIP-GFP轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的雜合子非洲爪蟾（X.laevis）胚胎作為受試生物。這些胚胎應(yīng)由純合子TH/bZIP-GFP非洲爪蟾與野生型非洲爪蟾交配產(chǎn)生。用作受試生物的所有胚胎應(yīng)來自相同批次的受精卵。每一個批次的受精卵都應(yīng)由同一只雄性和同一只雌性繁殖。7.7試驗培養(yǎng)液試驗培養(yǎng)液可選適合非洲爪蟾正常生長和發(fā)育的水，包括玻璃瓶裝礦泉水、泉水、井水和活性炭過濾自來水。應(yīng)進(jìn)行水質(zhì)分析，以篩查可能干擾檢測的潛在污染物（包括重金屬）和化學(xué)品。應(yīng)特別注意銅、氯和氯胺，這些物質(zhì)對胚胎均有毒性。應(yīng)報告水質(zhì)分析結(jié)果。適用于非洲爪蟾的試驗培養(yǎng)液的一些化學(xué)特性見附錄F。7.8測量受試物的潛在熒光將在本試驗中預(yù)期的最高濃度受試物溶液200μL和200μL試驗培養(yǎng)液，分別置于96孔板的兩個孔中，并使用與胚胎熒光相同的定量裝置和設(shè)置對熒光進(jìn)行定量測量。如果識別出熒光化學(xué)物質(zhì)，20例野7GB/TXXXXX—XXXX生型非洲爪蟾胚胎應(yīng)在21℃條件下暴露72h，每天更新至預(yù)期在本試驗中的最高濃度，應(yīng)定量測定，并與僅在相同條件下暴露于試驗培養(yǎng)液的一組20個野生型非洲爪蟾胚胎激發(fā)的熒光進(jìn)行比較。7.9試驗濃度7.9.1確立最大試驗濃度通過受試物在試驗培養(yǎng)液中的溶解度限度、最大耐受濃度（MTC）、誘導(dǎo)胚胎畸形的最大濃度小于10%或最大濃度為100mg/L（以最低值為準(zhǔn)）設(shè)定。如可獲得其他水生生物毒性試驗的數(shù)據(jù)（例如，魚類的LC50，或魚類胚胎、QSAR數(shù)據(jù)或交叉參照法的可能性，或其他兩棲動物物種的數(shù)據(jù)），可通過專家判斷來確定最大試驗濃度。如相關(guān)的急性毒性數(shù)據(jù)不可用，在進(jìn)行正式試驗之前，實驗室應(yīng)對胚胎進(jìn)行預(yù)試驗，探索試驗濃度范圍，以評價可能的毒性。預(yù)試驗應(yīng)包括至少2個試驗濃度，包括選定的最高試驗濃度或估計的MTC。測定的最高濃度的急性死亡率應(yīng)在10%以上。7.9.2試驗濃度設(shè)置至少需要3個試驗濃度和1個試驗培養(yǎng)液對照組（必要時設(shè)置溶劑對照組）。宜用3倍～10倍的濃度間距系數(shù)。7.10配制受試物溶液通常通過稀釋貯備液制備選定濃度的受試物溶液。應(yīng)將各受試物溶液的pH值調(diào)節(jié)至6.5～8.5。應(yīng)通過攪拌、攪拌或超聲等機(jī)械方法或其他適當(dāng)方法將受試物溶解于試驗培養(yǎng)液中制備貯備液。不宜使用溶劑。如果需要溶劑來制備適當(dāng)濃度且均勻的貯備液，則貯備液中溶劑的最高濃度應(yīng)至少低于無明顯作用濃度（NOEC）一個數(shù)量級，并且在任何情況下都不應(yīng)超過100μL/L或100mg/L。如果使用溶劑，所有試驗組和對照組都應(yīng)加入相同濃度的溶劑。如果之前未對溶劑使用本方法進(jìn)行試驗，且顯示為陰性，則應(yīng)同時進(jìn)行溶劑對照和試驗培養(yǎng)液對照以及T3對照和T3溶劑對照試驗。宜在預(yù)試驗中，根據(jù)受試物的理化性質(zhì)和非洲爪蟾的敏感性選擇合適的溶劑?？墒褂枚谆鶃嗧?DMSO)、乙醇、甲醇、丙酮、乙腈。注：盡管可用DMSO，但不應(yīng)優(yōu)先使用，因為其增加了8試驗程序8.1暴露條件將作為受試生物的胚胎置于由惰性材料制成的細(xì)胞培養(yǎng)級6孔板（通?？椎膬?nèi)徑為34mm、高度為20mm）。每個孔加入8mL溶液、10個胚胎。在一次試驗中，每個試驗濃度使用20個胚胎。每個對照組含20個胚胎（見7.2）。如果塑料孔板不適合給定的受試物，則應(yīng)使用玻璃容器（即小直徑培養(yǎng)皿）替。在整個試驗期間，將胚胎置于黑暗、21℃±1℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h±2h。8.2分析測定采用半靜態(tài)更新方法，應(yīng)記錄受試物濃度的穩(wěn)定性。在24h內(nèi)，受試物濃度的變化不宜超過配制濃度的20%。應(yīng)至少在試驗開始時、首個更新周期結(jié)束時（試驗培養(yǎng)液更新前后）和試驗結(jié)束時分析最高和最低試驗濃度?？山邮艿淖铋L更新周期是24h±2h。如果試驗系統(tǒng)中受試物的濃度不能維持在±20%范圍內(nèi)，則可考慮縮短更新時間和/或在開始前用試驗培養(yǎng)液預(yù)處理試驗容器24h，以將吸附導(dǎo)致的受試物損失降至最低。對于不在配制濃度80%～120%范圍內(nèi)的受試物，可使用平均測定濃度。8GB/TXXXXX—XXXX8.3試驗開始和進(jìn)行8.3.1第0d應(yīng)在胚胎發(fā)育至NF45階段時開始暴露（21℃條件下受精后7d；見附錄C）。每次運行應(yīng)使用同一個非洲爪蟾的卵進(jìn)行。由于每次試驗運行三次，因此每次試驗應(yīng)使用三批卵。每次運行使用的所有胚胎均應(yīng)來自同一雌蟾同一次生殖（即，不同雌蟾產(chǎn)的卵不應(yīng)混合）。應(yīng)在雙目解剖顯微鏡下觀察胚胎，并將顯示肉眼可見畸形、異常色素沉著或身體損傷（例如，尾部損傷、水腫、脊柱側(cè)凸）的胚胎從試驗中排除（見附錄G和附錄H）。應(yīng)將原種群的健康且外觀正常的胚胎合并到一個含有適當(dāng)體積試驗培養(yǎng)液的容器中。所選胚胎應(yīng)大小均勻，應(yīng)剔除過大和過小的胚胎。在NF45階段正常和健康胚胎少于80%的非洲爪蟾產(chǎn)的卵不應(yīng)用于試驗。對于發(fā)育階段測定，應(yīng)使用移液管從合并的容器中取出胚胎，并在透明培養(yǎng)皿中分散至一滴稀釋水中。對于階段確定，不宜使用麻醉劑。如果使用了麻醉劑，例如MS-222（三卡因甲磺酸酯），應(yīng)從有經(jīng)驗的實驗室獲得適當(dāng)使用方法，并與試驗結(jié)果一起報告。通常情況下，使用0.1g/L的MS222，并調(diào)節(jié)pH值至7～8。如果對胚胎進(jìn)行麻醉，應(yīng)在相同條件下對三次運行中使用的所有胚胎進(jìn)行麻醉。在此轉(zhuǎn)移過程中，應(yīng)小心處理胚胎，以盡量減少操作壓力并避免任何損傷。通過顯微鏡或適當(dāng)?shù)臄?shù)字成像確定發(fā)育階段。將10個胚胎/孔放入6孔板的試驗培養(yǎng)液液滴中（使用移液管，切掉槍頭，以避免損傷胚胎）。應(yīng)除去試驗培養(yǎng)液，首次加入受試物溶液。應(yīng)注意一次使用一個培養(yǎng)板，以避免胚胎干燥。6孔板設(shè)置示例見附錄I。8.3.2第1d和第2d受試物溶液和對照組溶液應(yīng)在24h和48h±2h更換。檢查各孔是否存在外觀異常的胚胎（損傷、異常游泳行為等）。應(yīng)清除死亡胚胎或顯示肉眼可見畸形（附錄G）或受傷的胚胎，并按8.4對畸形或受傷的胚胎實施安樂死。應(yīng)記錄所有觀察結(jié)果。8.3.3第3d熒光定量測量暴露72h±2h后，定量測量每個胚胎的熒光。胚胎應(yīng)單獨移（即每孔一個胚胎）至黑色96孔板的孔中。應(yīng)先用8mL試驗培養(yǎng)液更新試驗培養(yǎng)液，并除去死亡的胚胎或肉眼可見畸形的胚胎。應(yīng)記錄所有觀察結(jié)果。如果在一個對照組或一個給藥組中發(fā)現(xiàn)累積死亡率>10%或累積畸形率>10%，且試驗濃度不足3個，應(yīng)停止正在進(jìn)行的獨立運行，并確定死亡或異常的來源。然后向孔中加入2mL濃度為1g/L緩沖液MS222，麻醉胚胎。為避免過度麻醉，僅麻醉一次填充一個96孔板所需的胚胎數(shù)量。全麻醉后（2min~5min將胚胎分別置于96孔板的每個孔中。建議將來自6孔板同一孔的胚胎置于96孔板的同一行（即96孔板每行相當(dāng)于6孔板的一個孔）。96孔板示例見附錄J。每個胚胎體都用一個細(xì)的移液管放在背上（來回抽吸培養(yǎng)液將有助于轉(zhuǎn)動移除大部分培養(yǎng)液，同時在胚胎體下維持足夠的水分。將胚胎分別置于孔中，頭部位于孔中心，背面與孔底部接觸。尾巴放在胚胎頭部周圍（正確定位的圖像如附錄K所示）。然后將含有胚胎的96孔板放入熒光光譜或熒光顯微鏡下，使用校準(zhǔn)期間識別的參數(shù)定量測量熒光。注：一旦將胚胎背部朝下放置在微孔底部并去除MS222，為了防止胚胎變干，快速進(jìn)行熒光定量測量非常重要。如果使用熒光光譜代替熒光顯微鏡對信號進(jìn)行定量，則存在無法評估異常熒光模式（8.4試驗終止讀取熒光測量值后，使用擠壓瓶將96孔板的每個孔灌滿MS222(1g/L)緩沖溶液，使胚胎安樂死。按照當(dāng)?shù)貙嶒炇野踩芾淼囊筇幚?6孔板。9質(zhì)量保證與質(zhì)量控制9GB/TXXXXX—XXXX在試驗結(jié)束時滿足以下條件，試驗結(jié)果有效：a)應(yīng)測量試驗培養(yǎng)液對照組和T3對照組之間的熒光誘導(dǎo)具有統(tǒng)計學(xué)顯著性。T3對照組的平均熒光值應(yīng)至少比試驗培養(yǎng)液對照組的平均熒光值高20%；b)T4對照組和試驗培養(yǎng)液對照組的熒光誘導(dǎo)之間應(yīng)具有至少70%的統(tǒng)計學(xué)顯著性；c)測定試驗培養(yǎng)液對照組熒光強(qiáng)度的變異系數(shù)應(yīng)不超過30%；d)每次更新時，暴露溶液的初始pH值應(yīng)在6.5～8.5之間；e)各對照組胚胎的死亡率不超過10%；f)各對照組中畸形胚胎的百分比不應(yīng)超過10%。10數(shù)據(jù)分析與試驗結(jié)果評價10.1數(shù)據(jù)分析注意事項在對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析之前，應(yīng)從數(shù)據(jù)中刪除已知為空的孔的熒光測量值。在統(tǒng)計分析之前，可通過省略在每次運行中每個對照組和每組T3加標(biāo)和未加標(biāo)試驗濃度的最高和最低10%的熒光值（即省略每組20個值的兩個最高值和兩個最低值）進(jìn)行修剪。該微調(diào)旨在從多個事件中刪除XETA中出現(xiàn)的數(shù)值，包括錯誤分類的胚胎（異常大小或色素沉著）、96孔板中錯誤放置的胚胎（倒置或側(cè)向放置）、麻醉后死亡的胚胎和不含胚胎的孔。或者，如果使用熒光顯微鏡進(jìn)行熒光定量測量，在進(jìn)行統(tǒng)計分析之前，應(yīng)使用圖像質(zhì)量控制代替10%修剪，以去除與這些事件對應(yīng)的值。如適用，應(yīng)說明圖像質(zhì)量控制后從分析中移除的圖像數(shù)量。將3次獨立運行的數(shù)據(jù)合并，以獲得各濃度和對照組的42個（最差情況）至60個熒光值。如果首次在試驗中使用了溶劑，應(yīng)通過比較溶劑對照組和試驗培養(yǎng)液對照組的統(tǒng)計學(xué)差異來評價溶劑的潛在影響。如果試驗培養(yǎng)液對照和溶劑對照組之間無統(tǒng)計學(xué)顯著性差異，則應(yīng)使用合并的試驗培養(yǎng)液和溶劑對照組。對于三次運行的合并液，如果檢測到試驗培養(yǎng)液對照組和溶劑對照組之間的統(tǒng)計學(xué)顯著性差異大于12%，表明試驗受到影響。考慮單獨運行，以確定溶劑在三次運行中是否具有可復(fù)現(xiàn)效應(yīng)。如果是，表明試驗受到影響，應(yīng)考慮使用新批次溶劑或其他溶劑重新進(jìn)行試驗。如果僅有一次或兩次運行受到影響，則應(yīng)考慮變更溶劑批次，進(jìn)行新的運行。10.2統(tǒng)計分析采用單側(cè)假設(shè)檢驗(p<0.05)研究了與對照組相比對受試物熒光的影響。宜進(jìn)行逐步下降趨勢檢驗，以確定對照組和不同受試物濃度之間是否存在顯著差異(p<0.05)。應(yīng)使用Williams檢驗或Dunnett檢驗進(jìn)行比較，以確定任何統(tǒng)計學(xué)差異（可行的統(tǒng)計分析方法見附錄10.3判定邏輯為本試驗方法開發(fā)了判定邏輯，以在測定結(jié)果的執(zhí)行和解釋中提供邏輯幫助（見圖2中的流程圖）。該判定邏輯基于匯總用于統(tǒng)計分析的3次有效運行（見圖1）。如果在T3加標(biāo)和/或未加標(biāo)模式下，至少一個試驗濃度（包括最高濃度）具有活性，則認(rèn)為受試物的試驗結(jié)果為陽性。a)在未加標(biāo)模式下，活性濃度定義為相對于受試物培養(yǎng)液對照組具有統(tǒng)計學(xué)顯著性熒光增加幅度不小于12%的濃度。b)在T3加標(biāo)模式下，活性濃度定義為相對于T3對照組，具有統(tǒng)計學(xué)顯著性的熒光增加或降低幅度不小于12%的濃度。否是是是考慮其他試驗方法是有甲狀腺活性是有甲狀腺活性GB/TXXXXX—XXXX否是是是考慮其他試驗方法是有甲狀腺活性是有甲狀腺活性c)根據(jù)把握度分析確定12%閾值，發(fā)現(xiàn)所有濃度-響應(yīng)模擬形狀的把握度均超過80%。兩個驗證階段的結(jié)果確認(rèn)了該閾值的充分性，結(jié)果表明，使用非活性參比物處理的胚胎組沒有超過12%的統(tǒng)計學(xué)顯著變化。受試物激發(fā)熒光在GFP波長范圍內(nèi)且有生物蓄積性否進(jìn)行XETA試驗，合并三個有效的運行且進(jìn)行統(tǒng)計分析有效有效是在未加標(biāo)模式下統(tǒng)計學(xué)顯著的熒光降低>12%否重復(fù)XETA試驗考慮用更低濃度重復(fù)XETA試驗，或進(jìn)行其他試驗在未加標(biāo)模式下觀察到至少一個試驗濃度且包括最高試驗濃度，具有統(tǒng)計學(xué)顯著性的熒光增加>12%否在加標(biāo)模式下觀察到至少一個試驗濃度且光增加或降低>12%否在加標(biāo)模式下觀察到至少一個試驗濃度不包括最高試驗濃度；或在加標(biāo)或不加標(biāo)模式下缺少與濃度相關(guān)的效應(yīng)變化，具有統(tǒng)計學(xué)顯著性的熒光增加或降低>12%檢查3個獨立運行的劑性，并考慮改變濃度范圍重復(fù)XETA試驗否XETAXETA試驗結(jié)果無甲狀腺活性圖2解釋試驗結(jié)果的判定邏輯如果發(fā)現(xiàn)多個試驗濃度具有活性，但不遵循濃度-響應(yīng)關(guān)系，或者如果發(fā)現(xiàn)一個或多個試驗濃度具有活性，但最高試驗濃度不具有活性，應(yīng)通過比較三次運行的結(jié)果確認(rèn)該結(jié)果的復(fù)現(xiàn)性。如果結(jié)果不可復(fù)現(xiàn)，則應(yīng)采用另一個劑量范圍重復(fù)試驗，以確認(rèn)結(jié)果（見圖2的流程圖）。如果結(jié)果可復(fù)現(xiàn)，則認(rèn)為受試物具有甲狀腺活性。預(yù)計在未加標(biāo)模式下不會出現(xiàn)熒光下降，因為在此發(fā)育階段，胚胎不合成其自身的TH。如果在未加標(biāo)模式下觀察到統(tǒng)計學(xué)顯著的熒光下降>12%，則表明受試物通過與甲狀腺無關(guān)的方式減少了GFP的合GB/TXXXXX—XXXX成，本試驗方法不適用于該受試物，或者是所用胚胎或試驗條件的潛在問題，需要進(jìn)一步研究。應(yīng)考慮單獨運行，以確定三次運行中是否存在統(tǒng)計學(xué)顯著性熒光下降，然后使用最佳專業(yè)判斷來決定按哪種方式重復(fù)：僅使用一批新胚胎進(jìn)行一次運行；或使用較低濃度范圍的完整試驗；或進(jìn)行其他的甲狀腺活性試驗。10.4試驗報告試驗報告應(yīng)包括以下內(nèi)容：a)受試物和參比物：.單一組分的物質(zhì)：物理狀態(tài)、水溶解性及相關(guān)的物理化學(xué)特性；化學(xué)標(biāo)識，如IUPAC名稱或CAS名稱、CAS號、SMILES號或InChI號、通用名、結(jié)構(gòu)式、純度、雜質(zhì)含量以及實用的信息（如有機(jī)碳含量，如適用）；生物降解信息（如可用）；.多組分的物質(zhì)、UVCBs（成分未知或組分多變、復(fù)雜反應(yīng)產(chǎn)物或生物材料）和混合物：通過化學(xué)鑒別獲得盡可能多的特性信息，各組分相關(guān)理化特性；.關(guān)于在450nm和500nm波長處無熒光發(fā)射的結(jié)果；以及關(guān)于在這些波長范圍有熒光的物質(zhì)在胚胎中無蓄積的結(jié)果。b)胚胎：.學(xué)名、轉(zhuǎn)基因品系、供應(yīng)商或來源、培養(yǎng)條件。c)試驗條件：.試驗培養(yǎng)液特性的詳細(xì)信息（礦泉水或泉水的參考資料，自來水處理的描述。例如，活性炭過濾）和進(jìn)行的任何測定；.貯備液的制備方法和更新頻率（使用時應(yīng)給出溶劑及其濃度）；.用于暴露和熒光定量測量的6孔板和96孔板的品牌和參考資料；.用于定量測量的熒光光譜或熒光顯微鏡的參考資料和設(shè)置。對于后一種情況，還應(yīng)提供用于圖像分析的方法。d)試驗結(jié)果：50或MTC的任何初步研究結(jié)果；.配制試驗濃度和所有化學(xué)分析結(jié)果，以確定試驗容器中受試物的濃度；測定的暴露濃度作為適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計平均值（例如算術(shù)平均值、時間加權(quán)平均值等）如適用；還應(yīng)報告分析方法的回收率和定量限；.每次運行中死亡和畸形胚胎的數(shù)量及其發(fā)生日期；.熒光定量測量的原始數(shù)據(jù)（例如，單個熒光原始數(shù)據(jù)）；.數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析和處理方法，包括使用的統(tǒng)計檢驗以及是否和為什么進(jìn)行任何數(shù)據(jù)收集。.所有組胚胎的存活和畸形均符合有效性標(biāo)準(zhǔn)的證據(jù)；.每個實驗組的熒光平均值，包括所有對照組和受試物濃度及其SEM（平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差）均應(yīng)通過圖形表示和表格呈現(xiàn)；.在加標(biāo)和未加標(biāo)模式下，每個濃度的熒光測量值相對于各自對照組的熒光測量值增加或減少百分比；.在適當(dāng)情況下，溶劑潛在影響的評價結(jié)果：溶劑對照組和試驗培養(yǎng)液對照組的統(tǒng)計學(xué)比較（如果納入本研究）或既往研究顯示XETA中溶劑為陰性的結(jié)果；GB/TXXXXX—XXXX.其他觀察或檢測到的生物學(xué)效應(yīng)：報告觀察到或檢測到的任何其他生物學(xué)效應(yīng)（例如，異常行為、畸形或異常色素沉著）；.對本試驗方法偏離或驗收標(biāo)準(zhǔn)偏離的解釋，以及對試驗結(jié)果潛在后果的考慮；.在適當(dāng)情況下，對加標(biāo)和未加標(biāo)模式下發(fā)現(xiàn)的活性濃度列表進(jìn)行討論；.提供本試驗中受試物是否具有甲狀腺活性或無活性的結(jié)論。GB/TXXXXX—XXXXA（資料性）試驗條件概述表A.1試驗條件概述允許X.laevis正常生長和發(fā)育的水（參見第23段）），pH6.5～8.5，所有對照組死亡率≤10%，所有對照組畸形≤10%GB/TXXXXX—XXXX（資料性）校準(zhǔn)：最佳熒光光譜設(shè)置的確定B.1校準(zhǔn)目標(biāo)校準(zhǔn)的目標(biāo)是確保在簡單條件下使用設(shè)備可達(dá)到最佳響應(yīng)幅度。在測試受試物之前，確保熒光讀取器允許使用T3獲得適當(dāng)?shù)膭討B(tài)濃度響應(yīng)。B.2校準(zhǔn)的步驟校準(zhǔn)需要兩個步驟：a)尋找熒光光譜的最佳設(shè)置，以在T3濃度為3.25μg/L時，獲得令人滿意的GFP誘導(dǎo)幅度；b)將這些設(shè)置應(yīng)用于T3的三個濃度響應(yīng)實驗的定量測量，以檢查使用逐漸增加的T3濃度的誘導(dǎo)幅度和引起可檢測到GFP響應(yīng)可檢測濃度的最低T3濃度的誘導(dǎo)幅度。B.3尋找熒光光譜的最佳設(shè)置B.3.1開始實驗前開始實驗前需要：a)確定可在所選熒光光譜儀型號上設(shè)置的參數(shù)；b)根據(jù)實驗室間確認(rèn)期間使用的設(shè)置組合選擇一個首選組合或/和之前使用所選熒光光譜儀進(jìn)行的任何實驗?？紤]到設(shè)置應(yīng)導(dǎo)致96孔板讀數(shù)時間小于30min；c)確定要首先優(yōu)化的參數(shù)。B.3.2制備T3貯備液和T4貯備液B.3.2.1制備T3（6.51g/L）貯備液。a)該貯備液可在-20℃條件下儲存1年。b)稱取100mgT3，置于稱量皿中，輕輕倒入20mL容量瓶中。c)用4.47mL濃度為1mol/L氫氧化鈉溶液沖洗稱量盤，并輕輕加至20mL容量瓶中。d)用攪拌棒輕輕混合1小時；確保溶液澄清。e)移取4.1mL該溶液，置于新的20mL容量瓶中；加入9.9mL超純水。f)用攪拌棒攪拌1小時。g)在0.5mL微量離心管中制備足量的30μL等分試樣，放入冰柜儲存。h)將剩余溶液放入多個1.5mL試管中。i)保存：-20℃保存1年。B.3.2.2制備T4（0.8g/L）貯備液。a)稱取40mgT4，置于稱量皿中，輕輕倒入50mL容量瓶中。b)用50mL超純水沖洗稱量盤，輕輕加入容量瓶中。GB/TXXXXX—XXXXc)加入0.1mL濃度為1mol/L的NaOH溶液。d)用攪拌棒輕輕混合1小時；確保溶液澄清。e)制備1mL等分試樣，并在-20℃下最多儲存6個月。B.3.3制備以下溶液a)暴露培養(yǎng)液將1L試驗培養(yǎng)液置于1L玻璃瓶中。b)暴露培養(yǎng)液+T3（3.25μg/L）將1L試驗培養(yǎng)液置于1L玻璃瓶中。加入1mL濃度為3.25mg/L的T3溶液。c)暴露培養(yǎng)液+T4（10mg/L）制備300mL濃度為10mg/L的T4溶液：1)將296.25mL試驗培養(yǎng)液置于500mL瓶中；2)加入3.75mL濃度為0.8g/L的T4貯備液；3)通過搖瓶混合；4)4℃避光保存。B.3.4操作按照試驗方法中的描述，暴露72h，包括5組20個對照組、5組T3對照組和5組T4對照組胚胎（6孔板中，每孔10個胚胎），每天更新。72h后，用MS-222麻醉胚胎，并將各胚胎置于96孔板的單獨孔中，確保所有胚胎麻醉時間均不超過45min。用第一組參數(shù)設(shè)置的熒光光譜儀定量測熒光。通過適當(dāng)調(diào)整設(shè)置（一次一個參數(shù)）優(yōu)化熒光定量測量。同一胚胎麻醉時間不得超過45min。麻醉時間過長將導(dǎo)致胚胎死亡、熒光偽影。45min后繼續(xù)校準(zhǔn)，麻醉三組新胚胎并加載新的96孔板。采集數(shù)據(jù)后，計算各組平均熒光值和變異系數(shù)(CV)。按公式（B.1）計算T3組熒光誘導(dǎo)百分率：RFUT3=（mRFUT3-mRFUC）×100%/mRFUC…（B.1）式中：RFU——相對熒光單位；RFUT3——按相對熒光單位計算的T3組誘導(dǎo)百分比；mRFUT3——按相對熒光單位計算的T3組平均熒光值；mRFUC——按相對熒光單位計算的對照組平均熒光值。按公式（B.2）計算T4組熒光誘導(dǎo)百分率：RFUT4=（mRFUT4-mRFUC）×100%/mRFUC…（B.2）式中：RFUT4——按相對熒光單位計算的T4組誘導(dǎo)百分比；mRFUT4——按相對熒光單位計算的T4組平均熒光值；mRFUC——按相對熒光單位計算的對照組平均熒光值。B.3.5每個參數(shù)應(yīng)優(yōu)化為GB/TXXXXX—XXXXa)獲得對照組和T3對照組之間以及T3對照組和T4對照組之間的熒光誘導(dǎo)，接近驗證期間觀察到的熒光誘導(dǎo)。b)對照組和T3對照組之間的熒光誘導(dǎo)范圍為30%～75%，平均值為45%。c)對照組和T4對照組之間的熒光誘導(dǎo)范圍為70%～190%，平均值為105%。d)確保T4對照組未達(dá)到熒光光譜儀飽和度。e)96孔板的總讀取時間小于30min，宜為20min。B.4使用遞增濃度的T3測定熒光誘導(dǎo)幅度和LOECB.4.1改試驗應(yīng)用三批獨立的卵重復(fù)三次。試驗濃度分別為：0mg/L（未處理對照組）、26μg/L、13μg/L、6.5μg/L、3.25μg/L、2μg/L、1.5μg/L、1μg/L、0.65μg/L。B.4.2溶液制備B.4.2.1從-20℃下取出一等份濃度為6.51g/L(10-2mol/L)的T3貯備液，先制備濃度為0.65g/L的T3中間溶液，然后制備濃度為3.25mg/L的T3溶液。a）制備濃度為0.65g/L的T3中間溶液250μL：1）將225μL試驗培養(yǎng)液置于1.5mL移液槍中；2）加入25μL6.51g/L的T3溶液；3）攪勻。b)制備濃度為3.25mg/L的T3溶液20mL：1)將19.9mL試驗培養(yǎng)液置于50mL試管中；2)加入100μL濃度為0.65g/L的T3溶液；3)攪勻。B.4.2.2按表B.1制備相應(yīng)濃度的T3試驗溶液。表B.1T3試驗溶液的制備2T3_1165mLT3_1將稀釋液在4℃下避光貯存。使用稀釋液進(jìn)行暴露和兩次更新。B.4.2.3如下操作制備T4溶液a)將60mL試驗培養(yǎng)液置于100mL瓶中。b)取出并丟棄0.75mL。c)加入0.75mL濃度為0.8g/L的T4貯備液。d)攪拌混合液。e)4℃避光儲存。GB/TXXXXX—XXXXB.4.3暴露和更新B.4.3.1暴露按照B.4.2.2描述制備T3試驗溶液。a)用切掉吸頭的塑料移液管（避免損傷胚胎）將分選好的胚胎放入6孔板的試驗培養(yǎng)液中，每孔10個胚胎（注意僅包括外觀健康、大小和著色均一的胚胎）。b)使用塑料移液管小心吸取試驗培養(yǎng)液，開始暴露。用8mL適當(dāng)溶液替換試驗培養(yǎng)液。B.4.3.2更新在24h和48±1h更換試驗培養(yǎng)液。a)從冰箱中取出相關(guān)貯備液，并在21℃±1℃下放置至少1小時，然后進(jìn)行更新。b)取出任何死亡或異常的胚胎。c)用3mL移液器小心吸取約90%培養(yǎng)液。d)用8mL適當(dāng)?shù)母氯芤汗嘌b各孔。e)將微孔板置于21℃±1℃黑暗培養(yǎng)箱中。B.4.4測量熒光72h±2h后，按照試驗方法中所述麻醉并將胚胎置于96孔板中，并測量熒光。按照試驗方法中的描述進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析，以獲得LOEC。B.5解釋結(jié)果對于上述實驗，結(jié)果應(yīng)顯示：a)對照組和T3對照組之間以及T3對照組和T4對照組之間的熒光誘導(dǎo)與驗證期間觀察到的熒光誘導(dǎo)接近（見B.3.5）；b)在T4對照組中，熒光光譜儀從未達(dá)到飽和；c)T3的LOEC應(yīng)為3.25μg/L或更低。如果結(jié)果不符合這三點，則應(yīng)改進(jìn)熒光光譜儀設(shè)置。GB/TXXXXX—XXXX（資料性）NF45和NF47期胚胎C.1NF45期胚胎圖C.1NF45期胚胎背視圖圖C.2NF45期胚胎腹視圖圖C.3NF45期胚胎側(cè)視圖GB/TXXXXX—XXXX圖C.4繪制的NF45期胚胎腹視圖C.2NF47期胚胎在NF47階段，胚胎的腸螺旋達(dá)到2.5圈到3.5圈，腹部出現(xiàn)黃色素細(xì)胞，后肢芽明顯。圖C.5顯示腹部出現(xiàn)黃色素細(xì)胞，圖C.6顯示腸螺旋。圖C.5NF47期胚胎側(cè)視圖圖C.6NF47期胚胎腹視圖圖C.7繪制的NF47期胚胎側(cè)視圖圖C.8繪制的NF47期胚胎腹視圖GB/TXXXXX—XXXX（資料性）接收胚胎：馴化和批次驗收D.1接收胚胎胚胎應(yīng)在試驗開始前3天內(nèi)接受，以進(jìn)行適當(dāng)恢復(fù)和適應(yīng)。僅當(dāng)從接收批次至開始暴露之間出現(xiàn)的死胚或異常胚胎少于20%時，方可接受該批次。D.2試驗開始前3天接收胚胎的指南a)不要混合來自不同非洲爪蟾卵的胚胎。b)對胚胎進(jìn)行分選以除去死亡和異常胚胎，這些胚胎的比例應(yīng)小于20%，否則該批次不應(yīng)用于試驗。c)僅將同一蟾卵的存活胚胎和正常健康胚胎轉(zhuǎn)移到含有試驗培養(yǎng)液的10L水族箱中。d)每10L水族箱的最大密度是800個胚胎。e)在21℃±1℃（避光）條件下孵育胚胎。f)上述步驟后，實驗開始前不得更新水族箱中的培養(yǎng)液。GB/TXXXXX—XXXX（資料性）E.1培育胚胎需要的材料包括：a)雙目顯微鏡；b)漂白劑溶液(100%)；c)慶大霉素溶液；d)2%半胱氨酸溶液，pH值7.5～8；e)(des-gly,D-ala,pro-NHEt)亮氨酸釋放激素醋酸鹽（LHRH醋酸鹽），-20℃儲存;f)人絨毛膜促性腺激素(HCG)，4℃保存；g)0.1倍Marc改良林格氏（MMR）溶液+慶大霉素50μg/L；h)注射器，5mL和1mL；i)注射器針頭（粉紅色針頭），G181?;j)注射器針頭（橙色針頭），G255/8；k)250mL燒杯，用于盛放卵（囊胚期）。E.2樣品育種計劃表E.1樣品育種計劃（實驗開始前一周的星期一開始育種）星期一里），//E.3育種所需溶液的制備E.3.1制備MMR(20倍)貯備液2L將234g氯化鈉、6g氯化鉀、3.8g氯化鎂、11.76g氯化鈣、48gHEPES粉末置于2L玻璃瓶中，加入蒸餾水QSP2L，用1mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.5～8，在4℃條件下至多儲存2個月。GB/TXXXXX—XXXXE.3.2從MMR(20倍)貯備液制備0.1倍MMR溶液10L將50mLMMR(20倍)貯備液倒入10L容器中，用蒸餾水定容至10L，用1mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.5～8，使用期間室溫儲存（最多2星期）。E.3.3制備0.1倍MMR溶液+濃度為50μg/L的慶大霉素溶液取2mL濃度為50mg/L的慶大霉素溶液，置于2L容量瓶中，加入0.1倍MMR溶液至2L，用封口膜蓋住容量瓶，翻轉(zhuǎn)數(shù)次混合，使用期間室溫儲存（最多2星期）。E.3.4制備2%的半胱氨酸溶液（pH值7.5～8）稱取2g半胱氨酸，加入0.1倍MMR溶液90mL。用10mol/L的NaOH溶液，隨后用1mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.5～7.7。加入0.1倍MMR溶液至100mL，僅在使用當(dāng)天制備。E.3.5制備促性腺激素釋放激素GnRH（LHRH醋酸鹽）溶液從-20℃冰柜中取出LHRH醋酸鹽粉末(GnRH)試管，用720μL無菌水將5mg粉末直接重懸在試管中（得到濃度6.94μg/μL的貯備液）。在1mL無菌水中加入6μL貯備液，或者在15mL無菌水中加入90μL貯備液（需要較大體積時），得到最終濃度41.64μg/mL的溶液。在1.5mL無菌移液槍中去1mL等分試樣。等分試樣在-20℃貯存。E.3.6制備人絨毛膜促性腺激素(HCG)溶液采購一瓶5000單位的HCG粉末。用無菌注射器取0.9%的氯化鈉溶液5mL，注入HCG瓶中，使?jié)舛鹊玫綕舛葹?個單位/μL的HCG溶液。手動攪拌混勻。未使用的溶液可在4℃條件下最多貯存2周。E.4育種程序E.4.1星期一：注射激素誘導(dǎo)雄性和雌性成年非洲爪蟾交配。E.4.1.1雄性非洲爪蟾可注射GnRH或HCG。E.用GnRH（LHRH醋酸鹽）注射雄性非洲爪蟾1)：a)從-20℃冰柜中取出一等份GnRH(41.64μg/mL)，并在室溫下解凍；b)為了減小痛苦，把非洲爪蟾蒙住眼睛固定；c)使用25號（橙色）針頭和裝有0.120mL解凍GnRH溶液的1mL注射器，進(jìn)行背部皮下注射。為了確保注射量完全保留在爪蟾體內(nèi)，應(yīng)將注射針頭平行于后肢上部插入皮下，然后在皮下穿過側(cè)線器官到達(dá)背側(cè)淋巴囊。然后進(jìn)行注射，很容易看到注射可能在淋巴囊的皮膚下形成氣泡。然后小心取出針頭后，氣泡將停留，直至通過淋巴系統(tǒng)吸收，注入液沒有滲出，因為側(cè)線系統(tǒng)緊貼下方的肌肉組織，從而防止注入液損失。E.用HCG注射雄性非洲爪蟾：a)使用1mL注射器和25號（橙色）針頭，吸取10個單位～25個單位的HCG（根據(jù)供試爪蟾的大?。?；b)將非洲爪蟾固定在長方形工作臺的濕紙巾上，并按下圖所示遮住眼睛；c)在背部淋巴囊水平進(jìn)行背部皮下注射。按照E.關(guān)于注射的說明進(jìn)行相同操作。/index/Details.stGB/TXXXXX—XXXXE.4.1.2用HCG注射雌性非洲爪蟾：a)使用1mL注射器和25號（橙色）針頭，吸取500個單位～700個單位的HCG（取決于非洲爪蟾的大?。?；b)固定好非洲爪蟾，遮住它的眼睛；c)在背部淋巴囊水平進(jìn)行背部皮下注射。按照E.關(guān)于注射的說明進(jìn)行相同操作。E.4.2星期二（分選和孵育）E.4.2.1收獲卵并使其脫膠。a)收集卵，放在250mL燒杯中，除去過量水分。b)加入足量的2%半胱氨酸溶液覆蓋卵，通過旋轉(zhuǎn)燒杯2min或3min將卵與半胱氨酸混合，直至卵解離。重要的是注意不要離開半胱氨酸太久，否則會影響生存。注：這一步很關(guān)鍵，應(yīng)小心操作。半胱氨酸溶液應(yīng)升溫到21℃左右。溫度影響半胱氨酸處理的有效性，如c)向燒杯中加入0.1倍的MMR溶液（幾乎至頂部），停止半胱氨酸的作用。d)將液體緩慢倒入漂白溶液燒杯中，取出液體，并用0.1倍MMR再次沖洗3次。e)從燒杯中輕輕倒入，將胚胎放入帶注釋的100mL大培養(yǎng)皿中。E.4.2.2對胚胎進(jìn)行分選（死亡與存活），大多數(shù)胚胎應(yīng)處于囊胚期。a)將培養(yǎng)皿置于雙目顯微鏡下，用移液管將每個受精卵分離到一個新的100mL培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中含有0.1倍MMR溶液與濃度為50μg/L的慶大霉素溶液。b)標(biāo)記培養(yǎng)皿：行號、交配日期、每個培養(yǎng)皿的卵子數(shù)。在21℃±1℃下避光孵育培養(yǎng)皿。E.4.3星期三（分選和更換培養(yǎng)液）a)從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)皿。b)按照前一天的做法，使用切斷尖端的移液管對胚胎進(jìn)行分選，取出死亡的胚胎。c)更新一半培養(yǎng)液，并補(bǔ)充0.1倍MMR溶液與濃度為50μg/L的慶大霉素溶液。d)將培養(yǎng)皿置于21℃條件下，在21℃±1℃下避光孵育。E.4.4星期四：（準(zhǔn)備實驗或運送至另一個實驗室）E.4.4.1選項1：繼續(xù)培養(yǎng)直至實驗開始。a)向1個水族箱加入0.1倍MMR溶液到四分之一。b)用行號、繁殖日期標(biāo)記該水族箱。c)在不混合卵的情況下將胚胎輕輕倒入水族箱，每升最多放置200個胚胎。d)將該水族箱置于21℃培養(yǎng)箱中，在黑暗中度過周末。E.4.4.2選項2：將胚胎運輸至另一個實驗室。a)運輸所需材料：——無菌100mL容器（例如，帶螺旋蓋的組織培養(yǎng)瓶）；——切斷尖端的移液管；——移液管(50mL)；——移液管輔助工具。b)在100mL容器（包括瓶蓋和瓶身）上添加標(biāo)記：GB/TXXXXX—XXXX——行的名稱；——繁殖日期；——每個容器的胚胎數(shù)量。c)向容器中加入50mL試驗培養(yǎng)液。d)將100個活胚胎放入容器中。e)僅在準(zhǔn)備發(fā)送時封閉容器。f)將容器置于可密封的冷凍袋中。g)封閉袋子。h)將容器放入聚苯乙烯盒中，并牢固固定在盒內(nèi)，使其不會移動。i)小心地蓋好盒子，并用膠帶固定。j)連夜送往接收方實驗室。GB/TXXXXX—XXXX（資料性）可接受稀釋水的部分化學(xué)特性堿度（以CaCO3計）：10mg/LCaCO3～250mg/L硬度：75mg/L～150mg/LpH值：6.5～8.5鹽度：0.4mg/L非離子氨(NH3)<0.02mg/L亞硝酸鹽(NO2-)<1mg/L硝酸鹽(NO3-)<50mg/L溶解氧>80%飽和度二氧化碳<5mg/L總有機(jī)磷農(nóng)藥<50ng/L總有機(jī)氯農(nóng)藥+多氯聯(lián)苯<50ng/L總有機(jī)氯<25ng/L鋁、砷、鉻、鈷、銅、鐵、鉛、鎳、鋅分別<1μg/L鎘，汞，銀，分