microrna基因表達(dá)檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

microrna基因表達(dá)檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

mirna（mirna）是一個(gè)非編碼和內(nèi)源性小型鈉，約為21.25噸（nt）。經(jīng)預(yù)測(cè),人類基因組編碼了超過1000種不同的miRNA。近年來國內(nèi)外研究已經(jīng)在動(dòng)植物體內(nèi)證實(shí)了數(shù)百種miRNA,并確定了少數(shù)miRNA的功能,但大部分miRNA的功能尚不清楚。解決這一問題的首要環(huán)節(jié)是找出各miRNA在組織或細(xì)胞中表達(dá)的組織和時(shí)序特異性。自1993年首次發(fā)現(xiàn)miRNA以來,檢測(cè)其表達(dá)水平的技術(shù)方法迅速發(fā)展,雖然傳統(tǒng)方法如Northern雜交技術(shù)等仍在miRNA表達(dá)檢測(cè)中起著重要作用,但許多針對(duì)miRNA檢測(cè)的新技術(shù)方法不斷涌現(xiàn),為深入研究miRNA提供了更多的幫助。在此,作者對(duì)傳統(tǒng)及最新發(fā)展的miRNA表達(dá)檢測(cè)方法作一簡要綜述,以期對(duì)miRNA研究提供一些思路和啟發(fā)。1mirna的生物合成1993年,Lee等在對(duì)線蟲的研究中發(fā)現(xiàn)了首個(gè)miRNA-lin-4,當(dāng)時(shí)有研究指出lin-4可以抑制lin-14蛋白表達(dá),但機(jī)制不清。直至2000年,發(fā)現(xiàn)第2個(gè)miRNA--let-7及其在人類和果蠅中同源體后,人們逐漸認(rèn)識(shí)到miRNA是一類進(jìn)化保守,在生物進(jìn)化和疾病發(fā)展過程中起著調(diào)控作用的重要分子,通過抑制靶基因的表達(dá)產(chǎn)生基因沉默效應(yīng)。越來越多的miRNA得到鑒定,目前估計(jì)人類miRNA總數(shù)在800種以上,是最初預(yù)測(cè)miRNA種類的3倍以上。miRNA生物合成是一個(gè)復(fù)雜的過程,首先在細(xì)胞核內(nèi)由miRNA基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生pri-miRNA,pri-miRNA經(jīng)Drosha切割作用釋放出長約70nt的莖環(huán)結(jié)構(gòu)—pre-miRNA;pre-miRNA轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)后經(jīng)過酶的修飾作用形成成熟的miRNA。miRNA與RNase、解螺旋酶等活性分子構(gòu)成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNAinducedsilencingcomplex,RISC)。RISC通過特異地錨定在靶mRNA上介導(dǎo)目的mRNA的切割或翻譯抑制,從而調(diào)控目的基因的表達(dá)。2mirna檢測(cè)技術(shù)2.1mirna在細(xì)胞外表達(dá)的研究Northern雜交是檢測(cè)miRNA表達(dá)的一種簡便而可靠方法,不僅用于檢測(cè)miRNA在組織細(xì)胞中的表達(dá)水平,而且結(jié)合RNAmarker,可經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)miRNA的分子大小。1993年始,Northern雜交應(yīng)用于miRNA表達(dá)譜研究,也是首個(gè)用于半定量檢測(cè)miRNA的實(shí)驗(yàn)技術(shù),通過將已知濃度梯度的寡核苷酸參照物與待測(cè)樣品進(jìn)行平行雜交,實(shí)現(xiàn)對(duì)miRNA的半定量檢測(cè)。而后,Northern雜交成為檢測(cè)細(xì)胞中miRNA表達(dá)的常規(guī)研究方法之一。Hayashita等用該技術(shù)比較正常細(xì)胞和肺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)miR-17-92在肺癌中的表達(dá)明顯升高。Sempere等用該技術(shù)檢測(cè)了已知的119個(gè)miRNA表達(dá)譜,發(fā)現(xiàn)一部分在特異組織中表達(dá),一部分無特異性,且在不同組織中表達(dá)水平各異。Northern雜交最大的缺點(diǎn)是對(duì)樣品的需求量較高,需要微克級(jí)樣品才能避免假陰性,有時(shí)樣品量達(dá)到40μg才會(huì)出現(xiàn)明顯雜交信號(hào)。2.2mirna的表達(dá)原位雜交分為細(xì)胞和組織內(nèi)原位雜交,該技術(shù)檢測(cè)miRNA表達(dá),可更直觀的展示出miRNA的時(shí)空表達(dá)模式。80年代后期可在福爾馬林固定、石蠟包埋的組織中進(jìn)行原位雜交,近年來擴(kuò)展到細(xì)胞及亞細(xì)胞水平進(jìn)行miRNA的檢測(cè)。該技術(shù)不僅可以檢測(cè)不同細(xì)胞系單個(gè)細(xì)胞中的miRNA表達(dá),還可在不經(jīng)分類和分離的情況下,比較不同細(xì)胞系中miRNA的表達(dá)水平。Wienholds等首次將LNA探針(lockednucleicacid-modifiedprobe,LNA)用于原位雜交技術(shù),檢測(cè)了斑馬魚(Zebrafish)100余種miRNA的空間表達(dá)模式。他們用相同的技術(shù)觀察了115種在脊椎動(dòng)物中表達(dá)保守的miRNA表達(dá)譜,又用基因芯片技術(shù)檢測(cè)了相同的miRNA在斑馬魚胚胎不同發(fā)育階段的表達(dá)譜,并將二者加以對(duì)比。隨后Kloosterman等對(duì)該技術(shù)的重要參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,使之逐漸成為分析miRNA表達(dá)組織和時(shí)序特異性的有力工具。2.3mirna在腫瘤臨床治療中的應(yīng)用基因芯片技術(shù)可以高通量的檢測(cè)基因表達(dá)譜。最初的miRNA基因芯片,是將反義DNA探針點(diǎn)在尼龍膜上,然后以5′端放射性標(biāo)記的miRNA樣品雜交,再經(jīng)放射自顯影獲得信號(hào)。至今,很多研究應(yīng)用該技術(shù)建立了不同物種不同組織中miRNA的表達(dá)譜,亦有研究比較了正常組織和和疾病組織中miRNA表達(dá)譜的差異。Liu等用芯片技術(shù)檢測(cè)了miRNA在不同腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)譜,均經(jīng)Northern雜交、RT-PCR證實(shí)。Calin等用該技術(shù)比較了哺乳動(dòng)物中B細(xì)胞淋巴瘤和正常組織中miRNA的表達(dá)譜,為miRNA在腫瘤臨床診治中的應(yīng)用提出了新思路。Murakami等用該技術(shù)比較肝癌組織和鄰近非腫瘤組織miRNAs表達(dá)譜,發(fā)現(xiàn)miR-18和miR-224在肝癌組織中的表達(dá)明顯上調(diào),而miR-199a、miR-195a、miR-200a和miR-125a在肝癌組織中的表達(dá)明顯下降。在芯片的基礎(chǔ)上,Nelson等提出一種稱為RAKE(RNA-primed,array-basedKlenow)的方法,在特定的細(xì)胞中同時(shí)檢測(cè)所有miRNA的表達(dá)譜,并且能夠檢測(cè)出福爾馬林固定、石蠟包埋組織中的miRNA表達(dá)譜,使分析保存標(biāo)本中的miRNA表達(dá)譜成為可能。盡管基因芯片技術(shù)敏感度有了很大提高,且可用于多個(gè)miRNA同時(shí)檢測(cè),但仍有不足:基因芯片的制作和檢測(cè)需要昂貴的儀器設(shè)備;結(jié)果是半定量的,重復(fù)性較差;不能同時(shí)優(yōu)化所有待測(cè)miRNA的雜交環(huán)境,因而不能區(qū)分高度類似的miRNA,等等。鎖定的核苷酸修飾探針(lockednucleicacid-modifiedprobe)在基因芯片技術(shù)的應(yīng)用,可能會(huì)進(jìn)一步較精確地區(qū)分高同源性miRNA的表達(dá)差異。2.4反轉(zhuǎn)移聚合酶鏈反應(yīng)rt-pcr2.4.1實(shí)時(shí)熒光定量和定量檢測(cè)mirna表達(dá)RT-PCR作為半定量或定量檢測(cè)miRNA表達(dá)的常用實(shí)驗(yàn)方法,在研究miRNA表達(dá)的過程中不斷得到改進(jìn)。半定量RT-PCR是常用的一種簡潔、快速、特異的相對(duì)定量的RNA檢測(cè)技術(shù),只能測(cè)定miRNA的相對(duì)含量,有研究用該技術(shù)成功對(duì)比了待測(cè)和對(duì)照樣本之間特異miRNA的表達(dá)差異。Akao等用該技術(shù)研究發(fā)現(xiàn),miR-143、miR-145和miRlet-7在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平明顯低于相應(yīng)的正常組織。后來有研究對(duì)半定量RT-PCR加以改進(jìn):(1)RNA加尾RT-PCR:RNA加尾RT-PCR是在傳統(tǒng)RT-PCR的基礎(chǔ)上發(fā)展而來,可用于半定量或定量檢測(cè)miRNA的表達(dá),結(jié)果與Northern雜交一致。該技術(shù)有以下優(yōu)點(diǎn):可在較短時(shí)間內(nèi)獲得結(jié)果;高通量,可同時(shí)檢測(cè)多種miRNA的表達(dá);與Northern雜交相比,僅需少量RNA,且不用放射性同位素標(biāo)記;可同時(shí)檢測(cè)到成熟miRNA及其對(duì)應(yīng)的pre-miRNA;操作過程簡單。該技術(shù)檢測(cè)miRNA表達(dá)時(shí)需注意以下問題:有的miRNA和其他miRNA具有同源區(qū)域,它們的引物序列就是miRNA基因序列5′端的一部分,因而要確保引物3′端的不同;退火溫度是保證高度特異擴(kuò)增的關(guān)鍵因素,有研究提出,較高的退火溫度(60℃~61℃)可提高反應(yīng)的特異性;與用總RNA相比,使用從低分子量RNA中富集的miRNA可提高該技術(shù)的敏感性。Fu等用該技術(shù)檢測(cè)了miR-19b、miR-27a等miRNA,結(jié)果與northern-blot雜交一致。(2)引物延伸RT-PCR:引物延伸RT-PCR既可檢測(cè)成熟的miRNA,也可檢測(cè)單個(gè)miRNA和siRNA。Zeng等通過引物延伸并用放射性帶移法(radioactiveband-shiftassay)檢測(cè)了成熟miR-30、miR-21的表達(dá)水平。后經(jīng)改進(jìn)把引物延伸用于實(shí)時(shí)RT-PCR定量檢測(cè)miRNA的表達(dá),包括以下步驟:用加尾的特異引物把miRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,在cDNA的一端引入1個(gè)結(jié)合位點(diǎn)延長長度;實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。2.4.2采用loop實(shí)時(shí)定量rt-pcr技術(shù)檢測(cè)mirna表達(dá)實(shí)時(shí)定量RT-PCR可用于檢測(cè)miRNA在腫瘤中的表達(dá)水平。Schmittgen等用實(shí)時(shí)定量RT-PCR成功檢測(cè)到23種miRNA前體在人類6種不同癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平。2005年,Jiang等用該技術(shù)檢測(cè)222種miRNA在不同腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)在一些腫瘤中確有特異性的miRNA存在。Lee等用同樣的方法發(fā)現(xiàn)miR-221、miR-376和miR-301在胰腺癌中顯著高表達(dá)。但是傳統(tǒng)實(shí)時(shí)定量RT-PCR只能檢測(cè)到miRNA前體,為了解決這一問題,后來的研究者提出了Step-loop實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)。Step-loop實(shí)時(shí)定量RT-PCR是一項(xiàng)高特異度、敏感度的檢測(cè)miRNA表達(dá)的實(shí)驗(yàn)技術(shù),包括設(shè)計(jì)具有莖環(huán)(stem-loop)結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄引物和用miRNA熒光標(biāo)記的特異分子探針進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR2個(gè)關(guān)鍵步驟。該技術(shù)有以下優(yōu)點(diǎn):高度特異性,特異的Step-loop反轉(zhuǎn)錄引物和探針確保反應(yīng)不受其前體及基因組DNA污染等因素的干擾,對(duì)序列高度同源的miRNA也可精確區(qū)分;超寬的定量線性范圍和高度的檢測(cè)靈敏度,從幾個(gè)拷貝到幾萬個(gè)拷貝,定量線性范圍跨越7個(gè)數(shù)量級(jí);樣品消耗少,僅需1~10ng的總RNA;適用范圍廣,總RNA、細(xì)胞裂解物以及純化的RNA都可用于miRNA的定量檢測(cè),也可用于其他小分子RNA的檢測(cè),如siRNA。但是該技術(shù)需要較昂貴的實(shí)驗(yàn)材料及儀器。Zhang等用該技術(shù)檢測(cè)32例胃癌標(biāo)本中miR-let-7a的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)其在14例的癌組織中比相應(yīng)正常組織的表達(dá)水平明顯降低。Chen等亦用同樣的方法比較了5種miRNA在小鼠7種不同組織的表達(dá)差異。Shi等把RNA加尾和引物延伸用于實(shí)時(shí)定量RT-PCR,成功檢測(cè)了植物中miRNA表達(dá)。張旗等用同樣的方法對(duì)15種miRNA在大鼠心、肝和大腦皮層的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè),驗(yàn)證了該技術(shù)的可靠性。3mirna在基因組織檢測(cè)中的