微小rna在乳腺癌及乳腺良性病變組織中的表達及意義

微小rna在乳腺癌及乳腺良性病變組織中的表達及意義

小葉鈉（mirna）是一個由內(nèi)源性非蛋白質(zhì)組成的內(nèi)源性鈉，長約22個氨基酸。miRNA通過直接剪切靶mRNA,或者通過完全/不完全與靶mRNA3′末端互補結(jié)合,抑制靶mRNA的翻譯,從而參與生命過程中一系列的重要進程,甚至腫瘤發(fā)生。最近多項研究發(fā)現(xiàn),若干miRNA在各種腫瘤組織中的表達水平有不同程度上調(diào)或下調(diào),已成為當前眾多科學家關(guān)注的熱點之一。該領(lǐng)域的研究才剛剛起步,新的發(fā)現(xiàn)與觀點卻層出不窮。miR-145定位于染色體5q32-33,目前尚未發(fā)現(xiàn)miR-145明確的靶基因。既往研究結(jié)果均由miRNA芯片的方法得出,本研究選擇組織芯片為平臺,用原位分子雜交的方法檢測人乳腺癌與乳腺良性病變miR-145表達,并分析其與患者臨床病理特征之間關(guān)系,探討其生物學意義。1材料和方法1.1乳腺癌病例選擇收集安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院病理科2001年4月～2006年4月乳腺病變病理資料較齊全的石蠟標本129例,其中乳腺癌91例,患者均為女性,年齡14～60歲(中位年齡41歲);乳腺良性病變38例(包括21例纖維腺瘤,17例乳腺腺病)。所有患者術(shù)前未做化療、免疫或放射等抗腫瘤治療。按WHO(2003年)乳腺腫瘤分類標準對乳腺癌病例進行病理學分型。所有標本均常規(guī)10%福爾馬林固定,石蠟包埋,4μm厚切片。1.2探針1.4.3原位雜交檢測試劑盒MK1030和寡核甘酸探針稀釋液購自武漢博士德公司;miR-145地高辛標記探針來源于美國UTM.D.AndesonCancerCenter的徐曉春博士實驗室,探針序列5′-AAGGGATTCCTGGGAAAACTGGACAAGGGATTCCTGGGA-AAACTGGACAAGGGATTCCTGGGAAAACTGGAC-3′;DEPC由美國Sigma公司生產(chǎn);DAB顯色試劑盒購自北京中杉公司。1.3樣本選取方法復查HE染色切片,用定位器對代表性組織位點進行標記,每例樣本選3個位點;使用HT-1組織芯片制備儀(遼寧恒泰),制作核心1mm為組織芯片;4μm厚連續(xù)切片,分別作HE染色和miR-145原位雜交檢測。1.4抗地高辛抗體dab操作按試劑盒說明進行。簡要步驟如下:切片中滴加地高辛標記的miRNA探針(1∶400),42℃恒溫雜交16h,生物素化鼠抗地高辛抗體37℃溫浴60min,SABC孵育后DAB顯色。用已知的陽性切片作陽性對照,用探針稀釋液替代探針作陰性對照。1.5染色強度分級標準miR-145以乳腺腺上皮或癌細胞胞質(zhì)中出現(xiàn)明顯的黃色或棕黃色顆粒為陽性染色,采用半定量積分法判斷結(jié)果。染色強度分級:1分,無染色或弱染色;2分,中等強度染色;3分,強染色。陽性細胞數(shù)分級:1分,陽性細胞數(shù)<10%;2分,陽性細胞數(shù)10%～50%;3分,陽性細胞數(shù)>50%。以上兩項分數(shù)相乘所得的積為得分,得1～3分者為弱陽性,>3分為強陽性。強陽性為高表達。1.6統(tǒng)計方法采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學處理。采用χ2檢驗或四格表確切概率法。2結(jié)果2.1mir-賦予的表達分布miR-145陽性信號主要定位于乳腺腺上皮或癌細胞胞質(zhì)中,部分也可見間質(zhì)細胞胞質(zhì)著色。miR-145在乳腺腺病和纖維腺瘤病變組織中呈彌漫性分布,其高表達率為60.5%,小管和導管腺上皮細胞中多呈強表達,肌上皮也有所表達(圖1);在乳腺癌組織中(圖2),miR-145陽性細胞呈散在分布,陽性表達弱,高表達率為31.9%。兩者差異具有顯著性(P<0.05)。2.2mir-賦予多態(tài)性分布的表達乳腺癌miR-145表達與患者臨床病理特征的關(guān)系(表1)。miR-145的高表達率隨腋淋巴結(jié)受累及其受累數(shù)目的增多而升高,差異有顯著性(P<0.01)。隨臨床分期的增高,miR-145高表達率有升高的趨勢(P<0.05)。c-erbB-2高表達,miR-145高表達率亦高(P<0.01)。隨著組織學分級的升高,miR-145高表達率也有一定的升高的趨勢,但各組間差異無顯著性(P>0.05)。3mir-賦予患者成熟障礙miRNA是一類內(nèi)源性非蛋白質(zhì)編碼的RNA分子,廣泛分布在病毒、植物到高等哺乳動物中。多數(shù)的miRNA具有高度保守性、時序性、組織細胞特異性,受到發(fā)育和空間的調(diào)控,并參與細胞的分化、增殖、死亡。目前,miRNA已知的功能是在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達,主要作為基因表達的負調(diào)控因子。大量研究證明,miRNA與多種腫瘤的存在密切相關(guān),它的作用靶點可為抑癌基因,定位于擴增區(qū),使其表達上調(diào),則發(fā)揮抑癌基因樣作用;其靶點也可為癌基因,當癌基因mRNA表達水平升高時,miRNA則發(fā)揮阻止細胞的惡性轉(zhuǎn)化的作用。研究表明,在結(jié)腸直腸腫瘤中,成熟miR-145水平顯著下降,但在正常組織和腫瘤中檢測到這些miRNAs的發(fā)夾結(jié)構(gòu)前體轉(zhuǎn)錄體的數(shù)目差別不大,表明miR-145在腫瘤形成過程中存在成熟障礙。目前的研究顯示miR-145在乳腺癌、結(jié)腸癌和淋巴瘤細胞中表達都是下調(diào)的。本研究通過原位分子雜交的方法,檢測91例人乳腺癌與38例乳腺良性病變miR-145表達,而Iorio等利用基因芯片技術(shù)對乳腺癌中的多種miRNA進行了研究,我們的結(jié)果與他們的一致,即:miR-145在乳腺癌組織中低表達。然而,他們并沒有明確miR-145與乳腺癌病理特征之間的關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)miR-145與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及c-erbB-2表達呈顯著性相關(guān)。這些特征都與腫瘤的發(fā)展以及不良生物學行為密切相關(guān),其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和c-erbB-2更是患者預后不良的重要標志,提示乳腺癌組織中miR-145的高表達可能預示患者的不良預后。在本研究中,乳腺癌組和乳腺良性病變組的年齡分布經(jīng)χ2檢驗,差異有顯著性(P<0.01),乳腺良性病變組的平均年齡(39.7歲)小于乳腺癌組(50.0歲),不能排除年齡對miR-145表達的影響。雖然認為多數(shù)miRNA具有時序性,但miR-145表達量有可能隨著年齡的增長而逐漸降低有待進一步證實,同時,由于miR-145充當了抑癌基因的角色,那么miR-145時序性表達下降是否是造成了乳腺癌的發(fā)病率增高原因之一呢?這引起了我們的興趣,將在下一步的實驗中進一步探討。目前尚未發(fā)現(xiàn)miR-145明確的靶基因,潛在靶序列可能有:參與信號傳導途徑的基因、參與基因表達的染色質(zhì)調(diào)控基因、參與蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄和代謝過程的基因及參與RNAs和蛋白質(zhì)加工處理的基因等均可能為miR-145的潛在靶基因。Shi等發(fā)現(xiàn)miR-145通過作用胰島素受體底物-1來抑制結(jié)腸癌細胞的生長,我們的結(jié)果顯示miR-145與c-erbB-2表達呈正相關(guān),而癌基因c-erbB-2與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展又有著密切的關(guān)系,那么miR-145是否與癌基因c-erbB-2