基礎(chǔ)微生物實驗板書

實驗一顯微鏡的構(gòu)造和使用方法與細(xì)菌的革蘭氏染色1．實驗?zāi)康呐c要求（1）了解普通光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造、學(xué)會顯微鏡使用和維護(hù)方法；（2）掌握細(xì)菌涂片技術(shù)、革蘭染色方法及其原理；（3）熟悉細(xì)菌基本形態(tài)。2.實驗內(nèi)容（一）普通光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造

分光學(xué)和機(jī)械兩大部分。光學(xué)部分包括接目鏡、接物鏡、集光器、光源等；機(jī)械部分有鏡筒、鏡臂、鏡座、旋轉(zhuǎn)器、載物臺、光圈、傾斜關(guān)節(jié)、調(diào)節(jié)螺旋、次臺等。（二）油鏡使用的基本原理油鏡頭的晶片細(xì)小，進(jìn)入鏡中的光亮亦較少，其視野較用高倍鏡時暗。當(dāng)油鏡和標(biāo)本間介質(zhì)為空氣時，因空氣與玻璃的折射率不同，會有一部分光線被折射而不能進(jìn)入油鏡內(nèi)，使視野更暗，若在鏡頭與標(biāo)本之間放上與玻璃的折射率相同的油類，如香柏油等，則光線不發(fā)生折射，從而增加視野的照明度。（三）顯微鏡的使用方法1.觀察前的準(zhǔn)備

2、低倍鏡觀察

3、高倍鏡觀察

4、油鏡觀察

5、用低倍鏡和高倍鏡觀察酵母標(biāo)本片，油鏡觀察球菌、桿菌、螺旋菌的染色標(biāo)本片。（四）簡單染色法與革蘭氏染色法（1）觀察細(xì)菌的基本步驟：先用低倍鏡再用高倍鏡（2）革蘭氏染色法操作：涂片→干燥→固定→草酸銨結(jié)晶紫出染（1min）→水洗→碘液媒染（1min）→水洗→95%乙醇脫色（30s）→水洗→沙黃復(fù)染（1min）→水洗→濾紙吸干→油鏡檢查4．注意事項（1）細(xì)菌制片時不宜涂厚。（2）嚴(yán)格保證脫色和染色時間。（3）使用顯微鏡注意保護(hù)鏡頭。思考題1、繪出你所觀察到的細(xì)菌形態(tài)圖。2、觀察細(xì)菌時為何使用油鏡？它與普通物鏡在使用方法上有何不同？3、光學(xué)顯微鏡的目鏡與物鏡的常用放大倍數(shù)？顯微鏡的放大倍數(shù)越高，分辨力越高嗎？為什么?舉例說明。1、繪出你所做的革蘭氏染色制片中細(xì)菌的形態(tài)圖，并標(biāo)明總放大倍數(shù)及染色反應(yīng)結(jié)果。2、詳敘革蘭氏染色的原理及操作方法，染色時應(yīng)注意哪些問題？實驗二培養(yǎng)基的制備1．實驗?zāi)康呐c要求（1）掌握一般培養(yǎng)制備原理及原則，并學(xué)會配制一般普通培養(yǎng)基操作過程；（2）學(xué)習(xí)微生物實驗室常用滅菌設(shè)備的使用方法；（3）學(xué)習(xí)玻璃器皿的包扎方法。2．實驗內(nèi)容提要（1）液體培養(yǎng)基的制備（2）固體培養(yǎng)基的制備（3）微生物實驗室常用滅菌設(shè)備的使用方法和滅菌方法（4）玻璃器皿的包扎方法（5）棉塞的制作方法3．實驗操作要點1配料→溫水溶解→校正pH值→煮沸→加瓊脂融化→過濾→分裝→加蓋棉塞→包扎→滅菌→無菌檢查（液體培養(yǎng)基的制備時不加瓊脂）2微生物實驗室常用滅菌設(shè)備的使用（一）

手提式高壓蒸汽滅菌器

（二）

干熱滅菌箱（三）紫外線滅菌室

4．注意事項（1）配制培養(yǎng)基要注意操作程序，尤其需先校正pH值，后加瓊脂。（2）濕熱滅菌時，高壓鍋要注意排盡空氣；滅菌后壓力降至0以下才能打開滅菌鍋。（3）干熱滅菌時，105℃關(guān)閉氣門；滅菌后溫度降至60℃以下才能打開艙門。思考題1．配制普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基300-500ml，操作高壓蒸汽滅菌全過程，滅菌后擺斜面和倒平板，制成斜面培養(yǎng)基和平板培養(yǎng)基。2．包扎平皿、吸管，制作試管和三角瓶棉塞，并進(jìn)行干熱滅菌。3．培養(yǎng)基制備的原則及種類？如何調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的PH值？調(diào)節(jié)是應(yīng)注意哪些問題？4．高壓蒸汽滅菌之前，為什么要放盡器內(nèi)冷空氣？滅菌后，壓力未降至零時為何不能開蓋？5．高壓蒸汽滅菌為什么比干熱滅菌所用溫度低，卻又相同滅菌效果？實驗三.微生物的分離培養(yǎng)與純培養(yǎng)1．實驗?zāi)康呐c要求學(xué)習(xí)和掌握微生物各種分離方法及其純粹培養(yǎng)方法。2．實驗內(nèi)容提要（1）平板劃線分離；（2）可疑菌落的鏡檢和純培養(yǎng)。3．實驗內(nèi)容（1）平板劃線分離；此法為細(xì)菌和酵母菌最常用分離培養(yǎng)法。平板劃線凡是甚多，隨個人習(xí)慣而異，其目的均是使檢樣作適當(dāng)?shù)南♂?，以求獲得獨立菌落（既由一個菌繁殖而形成的孤立群落），防止發(fā)育成菌苔（既由兩個或兩個以上菌體繁殖而成的群落），以便于觀察菌落性狀，漿目的菌分離與純培養(yǎng)。（2）可疑菌落的鏡檢和純培養(yǎng)。1.菌落性狀的觀察及選擇2.平板接種斜面純培養(yǎng)法4．注意事項（1）平板劃線分離時，待測樣品應(yīng)適當(dāng)稀釋，使細(xì)胞分散容易得到單菌落。（2）平板劃線分離操作時，勿劃破培養(yǎng)基表面。（3）挑取中等大小一半可疑菌落鏡檢，另一半進(jìn)行純培養(yǎng)。5、作業(yè)與思考題1.采用平板劃線分離法和平板接種斜面法，從大腸桿菌和四聯(lián)球菌（或微球菌）的混合菌液中，分離純化出大腸桿菌。所用分離培養(yǎng)基為普通營養(yǎng)瓊脂。2.同上述操作，從被雜菌污染的酸奶發(fā)酵劑中分離純化出保加利亞桿菌或嗜熱鏈球菌。所用分離培養(yǎng)基為乳清瓊脂培養(yǎng)基。3.將所分離的目的菌菌落進(jìn)行革蘭氏染色并繪出細(xì)胞形態(tài)圖與描述菌落特征。4.詳述平板劃線分離操作過程和斜面接種方法。如果接種后經(jīng)培養(yǎng)未長出菌落或菌苔，是何原因？5.一般微生物的接種方法有幾種？用途？實驗四生理生化反應(yīng)試驗1.實驗?zāi)康呐c要求根據(jù)細(xì)菌在培養(yǎng)基中生理生化特點，學(xué)會鑒定細(xì)菌。2.實驗內(nèi)容（1）糖類發(fā)酵試驗；（2）甲基紅試驗；（3）維培二氏試驗；（4）吲哚試驗；（5）檸檬酸鹽試驗；（6）H2S產(chǎn)生試驗。3.實驗操作要點取樣→平板劃線分離→可疑菌落鏡檢→純培養(yǎng)→半固體培養(yǎng)基的穿刺培養(yǎng)（或固體斜面培養(yǎng)）4.注意事項（1）在糖類發(fā)酵試驗時，穿刺培養(yǎng)注意穿刺線不能完全穿透培養(yǎng)基。（2）甲基紅實驗時，不要過多滴加甲基紅指示劑，以免出現(xiàn)假陽性反應(yīng)。（3）緩慢滴加吲哚試劑，防止出現(xiàn)假陰性。5.結(jié)果與思考題1.將實驗結(jié)果填于表6-1中。附：（1）糖發(fā)酵試驗結(jié)果記錄：“+”——產(chǎn)酸；“”——產(chǎn)酸、產(chǎn)氣“”——陰性。其他試驗結(jié)果：“+”——陽性反應(yīng)；“-”陰性反應(yīng)。2.細(xì)菌的生化反應(yīng)試驗意義何在？要對一個未知菌進(jìn)行分類鑒定，通常要做哪幾方面工作？3.吲哚是怎樣產(chǎn)生的？做吲哚試驗可用什么樣的合成培養(yǎng)基代替蛋白胨水？4.如果NO2反應(yīng)也是陰性的，這種細(xì)菌有無硝酸鹽還原力？5.M·R反應(yīng)、V-P反應(yīng)、吲哚試驗的反應(yīng)物、產(chǎn)物、結(jié)果？6.吲哚（Indol）試驗，V-P試驗，檸檬酸鹽（Citrate）利用試驗，甲基紅（M·R）試驗，又簡稱什么試驗。7.利用石蕊牛乳試驗，可以觀察到試驗菌的哪些特性？實驗五霉菌的小室載片培養(yǎng)1.實驗?zāi)康呐c要求掌握霉菌的小室載片培養(yǎng)法，以便更好地觀察基個體形態(tài)。2.實驗內(nèi)容提要霉菌的小室載片培養(yǎng)方法3.實驗操作要點載玻片→滴一滴培養(yǎng)基→接種→蓋上蓋玻片→置于小室培養(yǎng)。4.注意事項（1）小室培養(yǎng)注意壓片時用力均勻，避免培養(yǎng)基移動。（2）接種注意將霉菌接種于培養(yǎng)基的周圍。（3）注意保持小室的濕度。5實驗作業(yè)1.采用試管斜面培養(yǎng)與平板培養(yǎng)法培養(yǎng)根霉、毛霉、黑曲霉、青霉。2.采用小室載片培養(yǎng)法培養(yǎng)黑曲霉、青霉，并詳述小室載片培養(yǎng)法的操作過程。所用分離培養(yǎng)基為乳清瓊脂培養(yǎng)基。3.將所分離的目的菌落進(jìn)行革蘭氏染色并繪出細(xì)胞形態(tài)圖與描述菌落特征。4.詳述平板劃線分離操作過程和斜面接種方法。如果接種后經(jīng)培養(yǎng)未能長出菌落或菌苔，是何原因？5.一般微生物的接種方法有幾種？用途？實驗六食品中常見菌類的觀察1.實驗?zāi)康呐c要求觀察并描繪食品中常見微生物的菌落形態(tài)和菌體形態(tài)。2.實驗內(nèi)容提要（1）細(xì)菌的菌體形態(tài)和菌落觀察；（2）水浸片法觀察酵母菌的菌體形態(tài)；（3）霉菌和酵母菌菌落形態(tài)觀察。3.實驗操作要點（1）細(xì)菌的革蘭氏染色，觀察菌體形態(tài)。（2）水浸片法：載玻片→滴一滴生理鹽水→接菌→蓋上蓋玻片→鏡檢（3）細(xì)菌及酵母菌菌落形態(tài)描述包括：大小、顏色、隆起度、邊緣、光澤、透明度、表面形狀、形狀、質(zhì)地、味道等（4）霉菌菌落形態(tài)觀察描述包括：大小、顏色、組織狀態(tài)4.注意事項（1）仔細(xì)觀察并詳細(xì)描述菌落特征；（2）水浸片法加蓋玻片時注意防止氣泡產(chǎn)生。5.結(jié)果與思考題1.描述所觀察細(xì)菌的菌落特征，并繪圖說明其個體形態(tài)特征。2.繪圖說明你所觀察的酵母菌的個體形態(tài)特征？水浸制片時應(yīng)注意什么？3.根據(jù)觀察結(jié)果繪圖說明根霉，毛霉，曲霉（低倍鏡下），青霉（高倍鏡G）個體形態(tài)特征，并標(biāo)明結(jié)構(gòu)名稱。4.描述上述四類霉菌的菌落特征。5.列表說明青霉屬與曲霉屬，毛霉屬與根霉屬在形態(tài)上的異同。6.你如何根據(jù)顯微鏡下觀察結(jié)果及菌落形態(tài)區(qū)分上述四類霉菌。7.你觀察到的青霉與曲霉，毛霉與根霉的菌絲有無隔膜？它們各屬于真菌類的哪一綱？實驗七細(xì)菌的平板菌落總數(shù)測定1.實驗?zāi)康呐c要求學(xué)習(xí)并掌握稀釋傾注法檢驗菌落總數(shù)的程序和方法。2.實驗內(nèi)容提要奶粉樣品菌落總數(shù)的測定。3.實驗操作要點無菌稱樣→系列稀釋→加樣→倒平板→恒溫培養(yǎng)→計數(shù)→報告4.注意事項（1）稱取樣品時注意無菌操作