waters液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的原理應(yīng)用0002

液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用的原理及應(yīng)用

002中心實(shí)驗(yàn)室樣品的預(yù)處理常用方法a）超濾b）溶劑萃?。}c）固相萃取d）灌注（Perfusion）凈化／去鹽e）色譜分離反相色譜分離親和技術(shù)分離f）甲醇或乙腈沉淀蛋白g）酸水解，酶解h）衍生化化合物鑒別全掃描方式（Q1掃描）全掃描數(shù)據(jù)采集可以得到化合物的準(zhǔn)分子離子，從而可判斷出化合物的分子量，用于鑒別是否有未知物，并確認(rèn)一些判斷不清的化合物，如合成化合物的質(zhì)量及結(jié)構(gòu)。

子離子分析（MS/MS）

子離子，用于結(jié)構(gòu)判斷(得到化合物的二級(jí)譜圖即碎片離子)和選擇離子對(duì)作多種反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）。子離子譜圖與錐體電壓斷裂譜圖（源內(nèi)CID）可能十分相似，所不同的是子離子質(zhì)譜圖已知只有一種質(zhì)量通過(guò)MS1，因此也已知所有碎片離子都是由我們所選定的母離子所產(chǎn)生的，所以我們更相信由MS/MS產(chǎn)生的譜圖的純度。用大氣壓電離質(zhì)譜儀可以得到分子量信息正離子方式常出現(xiàn)如下離子:-Na22Da.higherthanM+H-K38Da.higherthanM+H-Li6Da.higherthanM+H-NH417Da.higherthanM+H-ACN40Da.higherthanM+H2M+H,2M+Na等負(fù)離子方式常出現(xiàn)如下離子:-TFA114Da.higherthenM-H(113and227background)-Acetate60Da.higherthenM-H-Formic46Da.higherthenM-H-Cl36Da.higherthanM-H

影響分子量測(cè)定的因素1）pH的影響：正離子方式pH要低些，負(fù)離子方式pH要高些，除對(duì)離子化有影響外，還影響LC的峰形。2）氣流和溫度：當(dāng)水含量高及流量大時(shí)要相應(yīng)增加。3）溶劑和緩沖液流量：流速適當(dāng)高可以提高出峰的靈敏度。4）溶劑和緩沖液的類型：通常正離子用甲醇好，負(fù)離子乙腈好些5）選擇合適的液相色譜類型：正相、反相、選擇合適的色譜柱6）合適的電壓：DP電壓高時(shí)，樣品在源內(nèi)分解或碎裂；高DP電壓時(shí)回使多電荷離子比例低，多聚體也減少7）樣品結(jié)構(gòu)和性質(zhì)8）雜質(zhì)的影響：溶劑的純度、水的純凈程度等。當(dāng)成分復(fù)雜，雜質(zhì)太多時(shí)，競(jìng)爭(zhēng)使被測(cè)物離子化不好，同時(shí)使LC分離不好9）樣品濃度不夠，有時(shí)需要濃縮分子量測(cè)定中的誤判

溶劑中的雜質(zhì)來(lái)自于塑料添加劑的峰樣品容器不干凈，常見表面活性劑的峰進(jìn)樣系統(tǒng)污染樣品在源內(nèi)碎裂，形成碎片離子LC-MS中常見的本底離子m/z50-150,溶劑離子，[(H2O)nH+

，n=3-112]m/z102,H+乙腈

+乙酸,C4H7NO2H+,102.0549m/z149,管路中鄰苯二甲酸酯的酸酐,C8H4O3H+,149.0233m/z288,2mm離心管的產(chǎn)生的特征離子m/z279,管路中鄰苯二甲酸二丁酯

C16H22O4H+,279.1591m/z316,2mm離心管的產(chǎn)生的特征離子m/z384,瓶的光穩(wěn)定劑產(chǎn)生的離子m/z391,管路中鄰苯二甲酸二辛酯,C24H38O4H+,391.2843m/z413,鄰苯二甲酸二辛酯+鈉,C24H38O4Na+,413.2668m/z538,乙酸+氧

+鐵（噴霧管）,Fe3O(O2CCH3)6,537.8793

分子量測(cè)定失敗的原因

a）流動(dòng)相不合適b）不揮發(fā)性鹽的影響c）成分復(fù)雜，雜質(zhì)太多d)樣品濃度不夠e）pH值不合適f）樣品在源內(nèi)分解或碎裂目標(biāo)化合物分析（1）選擇離子監(jiān)測(cè)（SIM）

SIM用于檢測(cè)已知或目標(biāo)化合物，比全掃描方式能得到更高的靈敏度。這種數(shù)據(jù)采集的方式一般用在定量目標(biāo)化合物之前，而且往往需要已知化合物的性質(zhì)。若幾種目標(biāo)化合物用同樣的數(shù)據(jù)采集方式監(jiān)測(cè)，那么可以同時(shí)測(cè)定幾種離子.目標(biāo)化合物分析（1）選擇離子監(jiān)測(cè)（SIM）

SIM用于檢測(cè)已知或目標(biāo)化合物，比全掃描方式能得到更高的靈敏度。這種數(shù)據(jù)采集的方式一般用在定量目標(biāo)化合物之前，而且往往需要已知化合物的性質(zhì)。若幾種目標(biāo)化合物用同樣的數(shù)據(jù)采集方式監(jiān)測(cè)，那么可以同時(shí)測(cè)定幾種離子.（3）母離子掃描母離子分析可用來(lái)鑒定和確認(rèn)類型已知的化合物，盡管它們的母離子的質(zhì)量可以不同，但在分裂過(guò)程中會(huì)生成共同的子離子，這種掃描功能在藥物代謝研究中十分重要。

(4)中性丟失掃描

中性丟失掃描分析可用來(lái)鑒定和確認(rèn)類型已知的化合物，例如新生兒遺傳疾病篩查中某些檢測(cè)項(xiàng)目。也可以幫助進(jìn)行未知物結(jié)構(gòu)判斷，例如有中性丟失18Da的意味著-H2O，28-CO，30-HCOH，32-CH3OH，44-CO2等等。各種掃描方式的原理解釋：Q1FullScan(Start–Stop)(Q1全掃描)Q1alwaysusedassingleMSanalyzerUsedprimarilyforident.ofprecursorionSIM-SelectedIonMonitoring(選擇離子監(jiān)測(cè))UsedtooptimizeanalyzerforspecificionsSIMusedforquantitativeanalysesQ1SIMusedto“optimize”precursorionMaximizesignalinpreparationforMS/MSProductIonScan(子離子掃描)Afteridentification,theprecursorionissentintothecollisioncellandfragmentedbyCIDQ1isfixed,Q3sweepsagivenmassrangeUsedforstructuralelucidationFirststeptodevelopingquantitativemethodm3+scannedm1+fixedExampleofProductIonSpectrumEphedrine,MW=165PrecursorIonScan(母離子掃描)Q1sweepsagivenmassrange,Q3isfixedUsedtodeterminethe“origin”ofparticularproduction(s)createdinthecollisioncellFrequentlyusedfordrugmetaboliteidentification(commonproductionobservedinthemetabolites)m3+fixedm1+scannedExampleofPrecursorIonSpectrum600900120015001800m/z,amu587.5745.6895.6802.4633.4520.31105.01704.4600900120015001800m/z,amu3.0e66.0e69.0e61.2e7Intensity,cps608.3520.3802.4600900120015001800m/z,amu3.0e46.0e49.0e4Intensity,cpsPrecursorsof86(Ile/Leu)Q1Scan745.6FragmentationWhenanIonfragmentsthefollowingformulasapply:Positivemode(Parent)+

A++BNeutralNegativemode(Parent)-

A-+BNeutralNeutralLossScan(中性丟失掃描)Q1&Q3bothscanagivenmassrangebutwithaconstantdifferencebetweenrangesscannedSpectrumindicateswhichionsloseaneutralspeciesequaltoQ1-Q3differenceComplementtoPrecursorIonScanNeutral“gain”indicatesamultiplychargedprecursorionwasfragmentedΔmm1+scannedm3+scannedMultipleReactionMonitoring(MRM)PrecursorionfixedProductionfixedFragmentation(CAD)Manyprecursortoproductionpairscanbemonitored(A-B,A’-B’,etc.)MRMisthebestwaytomaximizesignalintensityofproductionsMRMusedprimarilyforquantitationWhyLC/MS/MSforQuantitation?RetentionTime

RetentionTimeIntensityIntensityPrecursorionfixedProductionfixedFragmentation(CAD)IncreasedSensitivity&Specificity儀器介紹:4000QTRAPTM四極桿-四極桿-線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜儀是美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司最新推出的、具有革新性設(shè)計(jì)的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀。它把四極桿-線性離子阱質(zhì)譜技術(shù)首次結(jié)合在一起，既保留了串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀的優(yōu)點(diǎn)如母離子掃描（PS）、中性丟失掃描（NL）、MRM定量功能，又克服了傳統(tǒng)3D離子阱質(zhì)譜儀的缺點(diǎn)如低質(zhì)量截止點(diǎn)（1/3效應(yīng)）、“空間電荷效應(yīng)”、碰撞效率低、定量性能差等。它是一臺(tái)集優(yōu)異定性功能與定量功能于一體的質(zhì)譜儀，廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)（組）研究、藥物開發(fā)、藥物代謝、有機(jī)化學(xué)、環(huán)境分析、毒物分析、食品檢驗(yàn)、商品檢測(cè)、衛(wèi)生防疫、煙草品質(zhì)改良等眾多領(lǐng)域。q0Q1q2Q3線性離子阱：超大的離子容量：消除了傳統(tǒng)離子阱的“空間電荷效應(yīng)”低質(zhì)量截止(1/3效應(yīng))低碰撞效率（離子缺失）多電荷增強(qiáng)掃描功能：有效消除單電荷離子的干擾，只檢測(cè)多電荷離子，更適合檢測(cè)微量的肽或蛋白質(zhì)?MS3功能：MS3功能和串聯(lián)四極桿碰撞方式，只需進(jìn)行最少的實(shí)驗(yàn)卻提供最充分的結(jié)構(gòu)信息?動(dòng)態(tài)線性范圍寬保留3Q質(zhì)譜儀的優(yōu)異MRM定量性能，能夠檢測(cè)復(fù)雜基質(zhì)中的微量雜質(zhì)QTRAP實(shí)現(xiàn)MSn功能以利血平為例:第一步做母離子609的MS2譜，由于碰撞能量較高，既有一次碰撞碎片又有多次碰撞碎片，且無(wú)1/3質(zhì)量CUTOFF現(xiàn)象，故從低質(zhì)量端到高質(zhì)量端產(chǎn)生碎片很多。每個(gè)碎片均可做MS/MS/MS，從中確證下一級(jí)的碎片歸屬，進(jìn)而推斷分子結(jié)構(gòu)。例如M/Z236和M/Z195是由M/Z448產(chǎn)生，M/Z365和M/Z174是由M/Z397產(chǎn)生。M/Z365,M/Z236和M/Z195還可繼續(xù)打碎。RESERPINE-MS/MSRESERPINE-MS/MS/MS（448）RESERPINE-MS/MS/MS（397）RESERPINE-MS/MS/MS（365）RESERPINE-MS/MS/MS（195）LC-MS技術(shù)的應(yīng)用以大氣壓電離為接口的LC-MS技術(shù)已經(jīng)在藥物、化工、臨床醫(yī)學(xué)、分子生物學(xué)等許多領(lǐng)域中獲得廣泛的應(yīng)用具體應(yīng)用領(lǐng)域醫(yī)藥學(xué)：藥物代謝、藥物動(dòng)力學(xué)、雜質(zhì)分析、天然產(chǎn)物分析生物化學(xué)：肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸、糖環(huán)境化學(xué)：農(nóng)藥和農(nóng)殘分析、有機(jī)污染物、土壤/食品/水分析臨床醫(yī)學(xué)：新生兒檢查、糖化血紅蛋白（糖尿病）、血紅蛋白變異、膽酸食品科學(xué)：香料、添加物、包裝物、蛋白質(zhì)、致癌物法醫(yī)學(xué)：濫用藥物、爆炸物、興奮劑檢測(cè)獸醫(yī)學(xué)：興奮劑、磺胺類藥物、抗體合成化學(xué)：有機(jī)金屬化合物、有機(jī)合成物有機(jī)化學(xué)：表面活性劑、染料藥物代謝研究

藥物代謝與藥物動(dòng)力學(xué)研究技術(shù)上的最新重大進(jìn)展是LC-MS-MS的使用，電噴霧（ESI）和大氣壓化學(xué)電離（APCI）以及大氣壓光電離（APPI）是其主要的離子源，由于具有高靈敏度（ng/ml~pg/ml），高選擇性（檢測(cè)特定的碎片離子）、高效率（每天可檢測(cè)幾百個(gè)生物樣品和對(duì)藥物結(jié)構(gòu)的廣泛適用性，對(duì)液態(tài)樣品和混合樣品的分離能力高，可通過(guò)二級(jí)離子碎片尋找原型藥物并推導(dǎo)其結(jié)構(gòu)，LC-ESI-MS-MS已廣泛地應(yīng)用于藥物代謝研究中一期生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)和二期結(jié)合反應(yīng)產(chǎn)物的鑒定、復(fù)雜生物樣品的自動(dòng)化分析以及代謝物結(jié)構(gòu)闡述等，已在世界上大型制藥企業(yè)中取代HPLC而占據(jù)了主導(dǎo)地位，其測(cè)試的樣品量占總量的70%以上。天然產(chǎn)物天然藥物的研究目前中藥開發(fā)研究有兩條途徑。一條途徑是從單一植物中提取一種有效成分(單體化合物)或提取物開發(fā)成新藥。另一途徑則是中藥復(fù)方制劑的開發(fā)研究。采用現(xiàn)代多種儀器聯(lián)用新技術(shù)，特別是高效液相色譜/質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS/MS)，可對(duì)其十幾種乃至幾十種化學(xué)成分進(jìn)行指紋圖譜分離鑒定。再?gòu)闹讣y圖譜中選擇四、五種指標(biāo)成分(有效成分或特征成分)進(jìn)行定量，可以確定出簡(jiǎn)化的指紋圖譜和指標(biāo)成分，又是最合理的中藥復(fù)方質(zhì)量控制的方法，是研究中藥復(fù)雜體系，尤其是復(fù)方的有力工具。國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者已進(jìn)行了復(fù)方丹參、清開靈、瀉心湯、人參或黨參制劑等中藥中的主要成分的分析。臨床診斷和疾病生物標(biāo)志物的分析

歐美等目前已廣泛采用HPLC/MS/MS法用于臨床診斷以及疾病生物標(biāo)志物的研究、檢測(cè)，具有專一性好、靈敏度高、成本低、分析快速，經(jīng)濟(jì)效益可觀等特點(diǎn)。目前可進(jìn)行新生兒遺傳疾病篩選（PKU、MCAD等四十種左右）、新生兒性激素變異的檢測(cè)、男女激素的監(jiān)測(cè)、老年癡呆癥的早期診斷、抗排異藥物的檢測(cè)、磷酸脂的檢測(cè)、血紅蛋白變異檢測(cè)、糖化血紅蛋白（糖尿病早期檢測(cè)）、某些心臟病、癌癥疾病篩查如乳腺癌等等（Biomarker法、通過(guò)鑒定DNA損傷程度測(cè)定）、藥物劑量監(jiān)測(cè)、藥物相互作用監(jiān)測(cè)、地區(qū)性突發(fā)性中毒病人的毒物檢測(cè)等。殘留、法醫(yī)學(xué)和環(huán)境樣品測(cè)