小鼠肝臟的解剖及肝切除術(shù)的實(shí)驗(yàn)研究

小鼠肝臟的解剖及肝切除術(shù)的實(shí)驗(yàn)研究

在從牙齒上切除肝臟后，它具有強(qiáng)大的再生能力，通常為7.10天。1931年Higgins和Anderson首次創(chuàng)建大鼠70%肝部分切除模型,隨后這一模型被廣泛應(yīng)用于肝再生、肝腫瘤、肝衰竭、肝臟移植等相關(guān)基礎(chǔ)研究。隨著減體積肝移植、活體肝移植、雙或多供體肝移植、肝段移植等新技術(shù)正越來越多地應(yīng)用于臨床,基礎(chǔ)研究不僅對(duì)肝部分切除模型的制作提出了更高的要求,而且模型動(dòng)物也越來越多樣化。已有報(bào)道在轉(zhuǎn)基因和基因敲除小鼠中建立肝再生模型,使肝再生的分子生物學(xué)機(jī)制研究獲得了突破性進(jìn)展。然而,眾多學(xué)者直接將大鼠70%的肝部分切除技術(shù)運(yùn)用于小鼠中,造成不同實(shí)驗(yàn)室之間較大的結(jié)果差異。由于大、小鼠肝臟結(jié)構(gòu)的分葉特性,小鼠的肝臟解剖及肝葉比例是否完全等同于大鼠目前并無相關(guān)研究證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)60只成年C57BL/6J小鼠肝臟進(jìn)行解剖學(xué)觀測(cè)并施行常用的70%和90%肝部分切除術(shù),旨在為小鼠肝切除模型的建立提供解剖基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù),為基于此模型的相關(guān)研究提供理論依據(jù)。材料和方法一、飼養(yǎng)環(huán)境及電子外科健康成年C57BL/6J小鼠60只(中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供),年齡11~12周,體質(zhì)量25~28g,雌雄各半,隨機(jī)分為A組、B組和C組,各20只,雌雄分籠飼養(yǎng)于無特定病原體環(huán)境(SPF級(jí))中,溫度控制在(22.0±2.0)℃,自由進(jìn)水,標(biāo)準(zhǔn)鼠食喂養(yǎng),12h晝夜生活環(huán)境。顯微外科手術(shù)器械1套(可反復(fù)高壓消毒),自制泡沫塑料鼠板1個(gè),腹腔小拉鉤3個(gè),電子稱及電子天平(精確到0.0001g)各1個(gè)。各組手術(shù)操作均在SPF級(jí)環(huán)境中完成。二、不同肝葉比例的調(diào)查1.A組計(jì)算小鼠70%和90%的肝葉比例:取A組小鼠,術(shù)前不禁食、水,于手術(shù)當(dāng)日早晨8時(shí)分別稱取體質(zhì)量并記錄,3%水合氯醛按1.2ml/100g腹腔注射麻醉,麻醉滿意后將其固定在自制泡沫鼠板上,取腹正中切口,安爾碘消毒3遍,切口長(zhǎng)約2cm,打開腹腔,用自制腹腔小拉鉤分別拉開左、右腹壁及向上拉開劍突,用棉簽浸濕生理鹽水后輕柔搏動(dòng)肝臟,顯微剪游離肝周韌帶,快速切取整個(gè)肝臟,剔除肝表面外側(cè)的肝靜脈及肝上、肝后下腔靜脈和肝實(shí)質(zhì)外側(cè)的膽管、門靜脈、肝動(dòng)脈及結(jié)締組織。用電子天平稱其濕重(體質(zhì)量),計(jì)算全肝(濕重)/體質(zhì)量比;分別稱量左外葉、中葉、右前葉、右后葉和尾狀葉體質(zhì)量,計(jì)算70%和90%的肝葉比例,為下一步手術(shù)提供依據(jù)。2.B組70%肝葉切除術(shù):取B組小鼠,開腹同前,根據(jù)先前計(jì)算結(jié)果,先用1-0手術(shù)絲線集束結(jié)扎左外側(cè)葉肝蒂,切除左外側(cè)葉(圖1所示第1步);然后依法結(jié)扎肝中葉肝蒂并切除(圖1所示第2步)。3.C組90%肝葉切除術(shù):C組小鼠在70%肝葉切除的基礎(chǔ)上,繼續(xù)結(jié)扎并切除肝右葉(圖1所示第3步)。B、C組用濕棉簽清除腹腔內(nèi)積液,確認(rèn)無活動(dòng)性出血后用1-0手術(shù)絲線分兩層關(guān)腹。術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng),觀察存活情況,記錄兩組手術(shù)成功率及術(shù)后1周動(dòng)物生存率。三、體質(zhì)量或質(zhì)量生存率應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析結(jié)果,體質(zhì)量(或質(zhì)量)以u(píng)e003±s表示,生存率(%)=存活數(shù)/總數(shù)×100%。一、肝濕重、體質(zhì)量及全肝質(zhì)量比小鼠肝臟分葉結(jié)構(gòu)明顯,依據(jù)小鼠各葉獨(dú)立的脈管系統(tǒng),并參照人體肝臟分葉及命名方法,直觀、簡(jiǎn)潔地將其分為5葉:左外側(cè)葉、中葉、右前葉、右后葉、尾狀葉(圖2),膽囊位于肝中葉。肝臟顏色紅潤(rùn),質(zhì)地柔軟,無明顯結(jié)節(jié)及脂肪樣變。每個(gè)肝葉有相對(duì)獨(dú)立的脈管系統(tǒng),其中右前及右后葉有一段融合共用的脈管系統(tǒng)。根據(jù)對(duì)20只成年C57BL/6J小鼠肝臟測(cè)量的結(jié)果,小鼠全肝濕重(質(zhì)量)為(1.325±0.029)g,體質(zhì)量為(26.500±1.140)g,全肝質(zhì)量/體質(zhì)量比為(4.92±0.13)%,肝左外側(cè)葉與中葉之和約占全肝比重的70%;左外側(cè)葉、中葉、右前葉與右后葉之和約占全肝比重的90%。每葉肝臟質(zhì)量及所占全肝比例見表1。二、術(shù)后手術(shù)成功率在預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,B組小鼠完成70%肝臟部分切除的時(shí)間為(18.2±1.1)min,C組小鼠完成90%肝臟切除的時(shí)間為(26.7±1.5)min。本實(shí)驗(yàn)術(shù)中無結(jié)扎線脫落所致下腔靜脈、門靜脈或肝動(dòng)脈出血,無膽瘺等。手術(shù)成功率為100%。B組和C組術(shù)后數(shù)小時(shí)內(nèi)均出現(xiàn)萎靡不振、毛發(fā)豎立,嗜睡狀態(tài),5~10h后恢復(fù)活動(dòng),可自由進(jìn)食、飲水。B組術(shù)后1周內(nèi)動(dòng)物存活率為100%;C組術(shù)后1d內(nèi)的生存率為30%(6/20),2d存活率為0。C組死亡動(dòng)物尸體解剖時(shí)腹腔內(nèi)未發(fā)現(xiàn)有血凝塊、膿腫、腸瘺等。不同類型肝葉切除的效果分析小鼠和大鼠的肝臟解剖結(jié)構(gòu)不同之處在于小鼠肝臟有膽囊,大鼠則無該器官;相同之處為小鼠肝臟各葉同樣具有相對(duì)獨(dú)立的Glisson系統(tǒng)和肝靜脈系統(tǒng),小鼠肝臟分為4個(gè)解剖功能單位:左外側(cè)葉、中葉、右葉(包括右前葉和右后葉)和尾狀葉。從A組小鼠肝臟的測(cè)量結(jié)果來看,各肝葉形態(tài)、大小比例相對(duì)恒定,使得單獨(dú)切除其中1個(gè)或數(shù)個(gè)肝臟功能單位變得簡(jiǎn)單可行,而且切除肝葉比重相對(duì)恒定,保證了模型的規(guī)范性及有效性。肝切除對(duì)肝再生的刺激強(qiáng)度與所切除肝臟的質(zhì)量有直接的關(guān)系,70%和90%肝切除模型是實(shí)驗(yàn)中常用的兩種基礎(chǔ)模型。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,小鼠肝左外側(cè)葉與中葉之和約占全肝比重的70%(殘肝為右葉和尾狀葉);左外側(cè)葉、中葉、右前葉與右后葉之和約占90%(殘肝為尾狀葉),這一結(jié)果表明大、小鼠70%和90%肝切除的肝葉數(shù)目基本一致。理論上,如果切除左外側(cè)葉、中葉、右前葉及右后葉,只保留尾狀葉,那么殘肝質(zhì)量?jī)H為全肝的7%左右;如選擇保留右前葉,殘肝質(zhì)量更接近于全肝的10%。但是,由于右前葉與右后葉同屬一個(gè)功能單位,兩者有一段融合共用的脈管系統(tǒng),單獨(dú)切除右后葉容易損傷殘留右前葉的脈管系統(tǒng)的通暢性,勢(shì)必會(huì)影響術(shù)后肝功能的恢復(fù),導(dǎo)致相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生偏差,從而降低模型的有效性。我們體會(huì),建立90%肝葉切除模型時(shí),采取保留完整的尾狀葉更利于術(shù)后殘肝發(fā)揮功能。另一方面,本組模型所采用的直視下分步單純絲線結(jié)扎肝臟解剖功能單位后再切除肝葉的方法,不僅術(shù)中出血量極少,甚至無出血,而且與顯微鏡下肝部分切除術(shù)相比,更具有操作簡(jiǎn)單,易于完成以及效率高等優(yōu)點(diǎn)。值得注意的是,切除肝中葉時(shí),絲線結(jié)扎位置應(yīng)距離肝上下腔靜脈2~3mm遠(yuǎn)為宜,以保障術(shù)后下腔靜脈不會(huì)發(fā)生狹窄。此外,建模后如需計(jì)算再生肝臟質(zhì)量與體質(zhì)量比,應(yīng)剔除切肝時(shí)剩余肝葉殘樁部分肝組織后再計(jì)算。本組90%肝葉切除術(shù)后2d無動(dòng)物存活,這與Gaub等所報(bào)道的大鼠90%肝葉切除后的生存率基本一致,但本組小鼠90%肝葉切除術(shù)后24h內(nèi)尚有30%的存活率,這為研究急性肝衰竭早期病理生理變化和治療提供了一個(gè)重要的窗口期。關(guān)于動(dòng)物年齡、性別、術(shù)前禁食、手術(shù)時(shí)間、麻醉等實(shí)驗(yàn)相關(guān)問題,C57BL/6J作為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中最常用的小鼠品系之一,選其作為模型動(dòng)物,實(shí)驗(yàn)結(jié)果更具有參考價(jià)值。研究表明肝部分切除后肝再生過程中,幼年動(dòng)物(4~6周)肝再生的速度比成年動(dòng)物快,相反,40周以上的動(dòng)物肝再生的速度明顯滯后。因此,肝再生模型宜選用8~14周齡的小鼠。同時(shí)盡可能使用同性別小鼠,因?yàn)槟承┻z傳基因的改變可能產(chǎn)生性別依賴的結(jié)果。很多研究者建立動(dòng)物肝部分切除模型時(shí),常對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物施行術(shù)前數(shù)小時(shí)的禁食、禁飲,事實(shí)上,禁食容易導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪樣變,極易影響術(shù)后的肝再生,長(zhǎng)時(shí)間的禁飲可致小鼠體質(zhì)量明顯下降,導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤差增大。此外,肝臟代謝會(huì)隨著晝夜節(jié)律而改變,上午時(shí)段完成肝切除模型更可取。麻醉在完成動(dòng)物模型中占有重要作用,麻醉劑選擇和使用不當(dāng)容易導(dǎo)致動(dòng)物死亡,單用氣體麻醉劑需要特殊的輔助呼吸裝置,增加了實(shí)驗(yàn)難度,本研究中使用的水合氯醛及用法用量,不僅操作簡(jiǎn)單,而且術(shù)中麻醉穩(wěn)定,術(shù)后蘇醒快,并不明顯增加動(dòng)物死亡率,可作為此類手術(shù)的常規(guī)麻醉方法?？傊?我們采用直視下分步單純絲線結(jié)扎肝臟解剖功能單位后再切除肝葉的方法建立小鼠70%和90%肝部分切