秋水仙素在植物多倍體誘導中的應用

秋水仙素在植物多倍體誘導中的應用

多倍體是指有三個以上完整染色體的生物個體。由于染色體數(shù)目加倍,個體外形往往具有巨大性,并且有適應不利自然條件的能力,在生物進化與育種上有重要意義。多倍體往往具有植株粗壯、葉大、花器官增大、花色更嬌艷、耐貯藏運輸?shù)葍?yōu)點,增加了花卉的觀賞價值和商業(yè)價值。多倍體植株具有許多優(yōu)良的特性,而自然界產生多倍體的過程相當漫長,因此人們常用人工誘導的方法獲得多倍體植株,分為物理方法和化學方法,物理方法效率太低,不能被廣泛利用,因而在多倍體的誘導研究中通常是用化學方法。誘導多倍體的化學藥劑很多,主要有秋水仙素、水合三氯乙醛、笑氣、富民隆等。被廣泛采用且最有效的藥劑是秋水仙素,因為秋水仙素的作用只局限于阻礙處于細胞分裂中期的紡錘絲的形成,而對染色體的結構并無顯著影響,在遺傳上很少發(fā)生其他不利的變異。1誘導方法1.1整體植物誘導常用的方法有處理種子、胚根和生長點。1.1.1金魚草種子染色體變異類型設計用秋水仙素溶液直接浸泡種子,此方法簡便易行,但加倍功效較低,且容易產生嵌合體。用秋水仙素溶液處理金魚草種子,鏡檢發(fā)現(xiàn)變異植株的染色體多為嵌合體;用秋水仙素處理虞美人種子,產生多種變異類型,有四倍體、八倍體及嵌合體;用秋水仙素處理新疆雪蓮種子,變異植株全部為嵌合體,生長后期,絕大部分嵌合體由于根部畸形,無法吸收營養(yǎng),最終死亡,存活下來的少量嵌合體幼苗在不同程度上發(fā)生了回復突變。1.1.2不同植物種類對秋水仙素的應用應注意使用的單種子萌發(fā)后,用秋水仙素溶液浸泡種子胚根,該方法對材料有一定的傷害,不同植物種類對秋水仙素的敏感度不同。應用時應注意濃度和處理時間的選擇。用秋水仙素處理發(fā)芽1~2cm的枸杞種子,50%的植株具變異性狀,但大部分生長緩慢,最后死亡,四倍體只占6.7%。1.1.3秋水仙素對枸杞幼苗生長的誘變效果常用脫脂棉包裹幼芽,每日滴秋水仙素溶液,連續(xù)處理或間歇處理數(shù)日,或將生長點浸泡在秋水仙素溶液中。與處理種子、胚根相比,處理更加直接,同時對材料的傷害較輕,誘變效果較好。以用濃度為0.5%的秋水仙素處理枸杞小苗的生長點,連續(xù)處理72h或間歇處理36h,誘變率達27%,成苗的四倍體占13%和20%,與處理胚根法相比誘變效果顯著。將荷花種子破殼催芽,待第二葉開始長出后選擇長勢一致、生長正常的種苗,用脫脂棉包裹幼芽,每天滴0.05%秋水仙素溶液3~4次,處理96h,加倍效果不理想;但將荷花種子及芽全部浸泡在0.05%秋水仙素溶液中48h和72h,均獲得了良好的加倍效果。此外,將秋水仙素直接注射到郁金香花苞中下部的子房位置,也獲得了多倍體。1.2誘導分化成苗在無菌條件下用經過濾滅菌的秋水仙素溶液浸泡離體植物組織,處理結束后用無菌水漂洗數(shù)次轉入培養(yǎng)基中培養(yǎng),或將外離體植物組織接種到添加了秋水仙素的培養(yǎng)基內進行誘導培養(yǎng),一段時間后,再轉入不含秋水仙素的培養(yǎng)基中,使其分化成苗。離體的植物組織包括小苗、莖段、叢生芽、愈傷組織、葉片等任何可分化成苗的器官及組織。1.2.1秋水仙素處理浸泡處理是秋水仙素對外植體作用最為直接的一種,材料的生長和分化在不同程度上受到抑制,甚至部分死亡。篩選適宜的處理濃度、時間組合是多倍體誘導的關鍵。以0.2%秋水仙素溶液處理番木瓜無菌苗72h效果好,誘導率最高達36.7%。將香石竹帶芽莖段浸泡在0.05%的秋水仙素溶液中50h,變異率達21.0%。用0.2%秋水仙素溶液浸泡花葉綠蘿叢生芽24h,誘變率達14.0%。將彩色馬蹄蓮的愈傷組織在0.05%秋水仙素溶液中浸泡24h,轉入分化培養(yǎng)基,誘導率最高達52.0%。葉片也可作為多倍體的誘導材料,取鄂柿的無菌葉片,沿中脈橫切成3~4塊,隨即放至0.5%的秋水仙素溶液中,在黑暗條件下振蕩處理96h,隨即轉入分化培養(yǎng)基,誘導獲得十二倍體再生植株。1.2.2大巖桐葉片誘導變/根用秋水仙素液體浸泡處理對外植體的傷害較直接,多次沖洗增加了外植體受污染的機會,秋水仙素加入培養(yǎng)基法避免了外植體的直接傷害,沖洗次數(shù)降低,也降低了受污染的幾率,所以日益受到科學工作者的青睞。將大巖桐葉片接種到20mg·L-1秋水仙素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)1周,誘變率達62.5%,誘變效果優(yōu)于浸泡處理。將紅千層莖段接入含0.2%秋水仙素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)15d和20d誘變效果最佳,達10.0%。用含有0.05%秋水仙素的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)紅果冬青的叢生芽48h,變異率最高,達40.0%。2秋水仙素對多倍體的誘變效果秋水仙素的濃度是誘導多倍體的成敗關鍵之一,濃度過低,不能產生加倍效應,濃度過高則抑制植物材料生長甚至死亡,處理的濃度、時間因不同植物和同一植物的不同組織而異。在一定范圍內,秋水仙素濃度與處理時間同誘變效果呈正相關,同植物材料存活率呈負相關。光照情況是影響多倍體誘導效果的第二顯著因素,試驗探索得到,無光條件更利于多倍體誘導。溫度影響藥劑的水解速度,低溫條件下藥效減弱,高溫條件下藥效增強但對植物組織的損傷較大,變溫處理可提高誘導效果同時減輕對植物的傷害。滲透劑二甲基亞砜(DMSO)能促進秋水仙素快速浸透到植物組織中,能減輕秋水仙素的藥害作用,顯著提高秋水仙素的加倍效果并降低嵌合體的發(fā)生率,在作物的多倍體研究中得到了驗證。此外,植物的不同組織、誘導方法及誘導前的狀態(tài)對誘導率也有影響。2.1不同濃度秋水仙素前處理對桉樹多倍體誘導效果的影響用秋水仙素溶液浸泡百合的鱗片、無菌試管苗、不定芽、叢生芽,均獲得了多倍體,濃度為0.02%~0.10%,誘變率在13.3%~50.0%,處理不定芽的誘導效果最佳,誘變率達50.0%。用秋水仙素溶液處理桔梗的愈傷組織,濃度為0.2%、處理時間為15h誘變效果最佳,但誘導率也不過為20.0%;用0.1%的秋水仙素處理其帶芽莖段40h,誘導率達50.0%。用0.05%秋水仙素溶液浸泡處理小葉綠蘿的不定芽72h,不定芽無死亡現(xiàn)象發(fā)生,誘導率達12.5%;而浸泡愈傷組織72h,死亡率可高達90.0%,且誘導完全不成功。用0.5%秋水仙素處理桉樹的單芽和叢生芽進行多倍體誘導,處理單芽120h時誘變率最高,達42.9%,死亡率也最高,達65.0%;處理叢生芽96h時誘變率最高,達38.5%,死亡率35.0%。叢生芽的誘導效果比單芽好。與莖段、葉柄相比較,葉片是毛泡桐和白花泡桐四倍體誘導的最佳材料,經秋水仙素處理后葉片最高存活率略低,但四倍體誘導率明顯高于莖段和葉柄。以庫拉索蘆薈的叢生芽、微塊莖、愈傷組織為材料,用秋水仙素濃度為0.05%的固體培養(yǎng)基培養(yǎng)24h,愈傷組織誘變的效果最差;叢生芽誘導效果較理想。2.2誘導方法2.2.1誘導率及誘導效果在培養(yǎng)基中添加一定濃度的秋水仙素,或者用秋水仙素浸泡處理植物材料一段時間再轉入培養(yǎng)基中培養(yǎng),均可誘發(fā)多倍體的產生,不同植物種類的最佳誘導方法存在差異。用0.1%的秋水仙素處理貝母的愈傷組織24h,誘導率為47.0%;將其接種到含1000mg·L-1秋水仙素的培養(yǎng)基中處理5d,誘導率最高達70.0%,誘變效果優(yōu)于浸泡處理。以不定芽為材料對金銀花進行多倍體的誘導,將其接種到添加秋水仙素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)1個月,以添加40mg·L-1秋水仙素處理組誘導率最高,為20.0%;用0.2%秋水仙素浸泡不定芽72h的誘導率僅15.0%。以種子為材料進行杜仲多倍體的誘導,研究表明,用秋水仙素處理后再進行試管萌發(fā)處理,其多倍體的誘導率高于培養(yǎng)基中添加秋水仙素直接進行試管萌發(fā)的處理。2.2.2倍體誘導率測定u將紅掌愈傷組織放入含200mg·L-1秋水仙素的液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)14d,誘導率為45.45%,高于固體培養(yǎng)基處理的四倍體誘導率。在毛泡桐和白花泡桐四倍體誘導研究中,雙層培養(yǎng)基的誘導效果最好。剪秋羅的莖段接入含400mg·L-1秋水仙素的培養(yǎng)基培養(yǎng),液體培養(yǎng)基比固體培養(yǎng)基誘導率和存活率高。2.3預處理的時間對誘導效果的影響由于秋水仙素見光易分解,誘導處理需在黑暗環(huán)境進行,誘導前將材料置入黑暗環(huán)境進行預處理的時間對誘導效果有一定的影響。在毛泡桐和白花泡桐四倍體誘導研究中,外植體的預培養(yǎng)時間對外植體存活率、芽誘導率和四倍體誘導率的影響皆達到極顯著水平。將茶樹幼苗先遮光黃化3d后再用秋水仙素處理生長點效果較好。3多倍體測試3.1外部形態(tài)的變化最簡單、最直觀粗放的鑒定方法,主要是觀察株高、莖粗、葉色及厚度、花冠、花藥及花粉、果實、種子等外部形態(tài)的變化。由于秋水仙素處理后會引起生長初期的表型畸變,所以在早期用形態(tài)特征指標來鑒定多倍體是不可靠的。3.2整倍性的鑒定最直接、也是最準確的鑒定方法。它不但能區(qū)分倍性而且還能鑒定是整倍性或非整倍性的變異。但技術性要求高,工作量大,而且實現(xiàn)的可能因植物而異。3.3氣孔大小和密度氣孔的大小、密度,保衛(wèi)細胞的長度、寬度及葉綠體的數(shù)目可作為多倍體鑒定的間接指標。氣孔的大小與倍性呈正相關,氣孔的密度與倍性呈負相關。以氣孔為指標間接鑒定杜仲多倍體,與通過染色體記數(shù)法直接鑒定相比,其誤差不超過25%。認為利用氣孔大小和密度來鑒定杜仲多倍體是一種相對可靠的方法。還可以作為鑒別渥丹百合多倍體、紅掌四倍體的可靠方法。如在同一植株或同一表皮上的氣孔大小差異明顯,此植株多為嵌合體,必須通過再次脫分化誘導不定芽的方法分離獲得純多倍體植株。3.4克氏原螯蝦多倍體的鑒定流式細胞術可以直接測定細胞核的DNA含量,測量精確、快速、重復性好,通過比較細胞核DNA含量來鑒定倍性較準確,這種方法已被成功地用于蘋果、草莓、白花泡桐、美人梅、剪秋羅的倍性鑒別上。此外,李涵等用指紋圖譜分析法對齒瓣石斛多倍體進行分析,研究表明正常二倍體與多倍體齒之間存在著明顯的差異,推斷在多倍體誘導過程中,存在著較多的加倍類型或少數(shù)染色體結構的變異。王鴻鶴等對重瓣大巖桐多倍體進行了過氧化物同工酶酶譜分析比較,但酶譜帶數(shù)與倍性之間無相關性,不能作為倍性進行鑒定的指標。李政等對綠玉樹不同倍性的植株進行共有譜帶、特有譜帶的比較,研究發(fā)現(xiàn),二倍體綠玉樹的過氧化物酶同工酶譜帶僅有5條,而四倍體譜帶有8條,其中3條明顯加強,僅能說明四倍體綠玉樹的過氧化物酶同工酶活性增強。4問題和視角的取消4.1其他植物對秋水仙素的抗性秋水仙素的作用機理在于它能抑制或妨礙細胞的紡錘絲形成,使分裂的染色體停留在赤道板,不向兩極移動,而細胞質不分裂,導致染色體數(shù)目增加。秋水仙素對外植體有毒害作用,常常使材料的生長受到抑制或死亡。不同植物對秋水仙素的敏感程度不同,除處理濃度外還有多種因素共同影響誘導效果,綜合使用各方法可提高材料成活率和誘導率;不同植物或同一植物的不同部位也有差異,各種植物的誘導系統(tǒng)有待完善。4.2染色體計數(shù)的有效方法染色體記數(shù)法是最直接、最準確的鑒定方法,但技術性高,工作量大,對材料的狀態(tài)要求嚴格,只有處于旺盛分裂期的組織才能用于染色體計數(shù),實現(xiàn)的可能因植物而異。因此,找到一種簡單、快速、相對可靠的間接方法勢在必行。流式細胞術可以直接測