番茄組織培養(yǎng)與再生體系的優(yōu)化

番茄組織培養(yǎng)與再生體系的優(yōu)化

番茄是番茄科的一種一級(jí)或二級(jí)植物。作為一種全球蔬菜，它在擴(kuò)大了互補(bǔ)物質(zhì)資源方面取得了巨大成功。另一方面，它是一種廣泛種植，另一方面，它在遺傳理論上進(jìn)行了深入的研究，為補(bǔ)充互補(bǔ)物質(zhì)提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。近年來(lái),隨著植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展,外源基因轉(zhuǎn)入番茄的研究也越來(lái)越多,這不僅使人們獲得了農(nóng)藝性狀改良的番茄新品種(如抗蟲、抗病、抗除草劑、抗逆、果實(shí)的延熟保鮮等),而且利用植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)還可使番茄作為生產(chǎn)食用疫苗的生物反應(yīng)器.當(dāng)前,在植物基因工程技術(shù)中,多數(shù)成功的轉(zhuǎn)化體系都是建立在良好的組織培養(yǎng)系統(tǒng)基礎(chǔ)之上的.自人類首次利用根誘導(dǎo)培養(yǎng)出的愈傷組織獲得再生植株以來(lái),國(guó)內(nèi)外研究者們又相繼從各個(gè)不同角度對(duì)番茄的組織培養(yǎng)體系進(jìn)行了研究,但這些報(bào)道中,有的培養(yǎng)周期長(zhǎng),有的培養(yǎng)基復(fù)雜,有的外植體取材受季節(jié)限制等等.如將這些培養(yǎng)方案用于番茄的遺傳轉(zhuǎn)化,就會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率和結(jié)果.筆者就幾種影響番茄組織培養(yǎng)體系建立的重要因素如供體基因型、激素濃度、培養(yǎng)條件等作了初步研究,建立了一套優(yōu)化的番茄組織培養(yǎng)與再生體系,為下一步進(jìn)行番茄的遺傳轉(zhuǎn)化打下了良好的基礎(chǔ).1材料和方法1.1外植體的選擇番茄品種選用購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院蔬菜花卉研究所的毛粉802、串株櫻桃番茄、美麗櫻桃番茄、黃梨櫻桃番茄、紅梨櫻桃番茄、中雜9號(hào)、中蔬6號(hào)、麗春番茄、中雜8號(hào)、中蔬4號(hào)、中蔬5號(hào)共11個(gè)品種的子葉、下胚軸段、葉片、莖段做為外植體.1.2培養(yǎng)基產(chǎn)品1.2.1,5-ba1的添加量P1:MS+IAA0.2mg·L-1+6-BA1.0mg·L-1;P2:MS+IAA0.5mg·L-1+6-BA1.0mg·L-11.2.2l-1+6-ba1.0.0.2P3:MS+IAA0.02mg·L-1+6-BA1.0mg·L-1;P4:MS+IAA0.05mg·L-1+6-BA1.0mg·L-11.2.3生根培養(yǎng)基1/2MS+蔗糖3%+瓊脂0.7%+IBA1.0mg·L-1.1.3培訓(xùn)條件25℃,暗培養(yǎng)箱誘導(dǎo)出愈傷組織后轉(zhuǎn)入光照14h,溫度(25±2)℃誘導(dǎo)分化培養(yǎng).1.4誘導(dǎo)愈傷及誘導(dǎo)愈傷將番茄種子用70%酒精浸泡30s,無(wú)菌水沖洗1次,再用0.1%升汞溶液浸泡8min,用無(wú)菌水沖洗4～5次.接種到1/2MS培養(yǎng)基上,28℃暗培養(yǎng)箱培養(yǎng),發(fā)芽后轉(zhuǎn)到光下培養(yǎng)至兩片子葉完全展開.取無(wú)菌苗的子葉、下胚軸段、葉片和莖段做外植體,外植體大小0.6cm左右,接種到誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基上.25℃,部分材料置于暗培養(yǎng)箱誘導(dǎo)愈傷,部分置于光下誘導(dǎo)愈傷,比較其影響,愈傷產(chǎn)生后轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基上并接受14小時(shí)/天的光照,分化培養(yǎng)出的苗長(zhǎng)到1.5cm后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中,生成發(fā)達(dá)根系后,揭開培養(yǎng)膜往三角瓶中倒入少許水接受煉苗,3～5d后洗去苗根部的培養(yǎng)基后轉(zhuǎn)入土壤中成為正常植株,并能開花結(jié)果.2結(jié)果2.1培養(yǎng)基的誘導(dǎo)分化IAA和6-BA是目前在番茄組織培養(yǎng)中常用的兩種激素.其濃度配比對(duì)11種番茄外植體的愈傷組織的形成及分化的影響見表1,從表中可以看出,11種番茄子葉、下胚軸段、葉片、莖段對(duì)植物激素的要求存在一定的差別,11個(gè)品種的外植體的愈傷誘導(dǎo)率為100%,但當(dāng)6-BA的濃度為1.0mg·L-1時(shí),中蔬9號(hào)在P3上,麗春番茄在P4培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較好,分化率分別為95%,100%.而中蔬5號(hào)在P3上、中蔬4號(hào)在P4上、紅梨櫻桃番茄在P4培養(yǎng)基上獲得相對(duì)較高的分化率,分別為90.9%,83%,84%.從表1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果還可以看出,11個(gè)品種在不同的愈傷組織誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)基上雖然都以較高的頻率形成愈傷組織,但分化率卻存在很大差別,從36%到100%不等,其中以中9、麗春為最好,而且不同品種在不同培養(yǎng)基上形成的愈傷組織大小及形態(tài)也不盡相同,在IAA濃度較高的培養(yǎng)基上所形成的愈傷組織塊小且有的顏色發(fā)白,有的愈傷組織都長(zhǎng)出白色須根.但在轉(zhuǎn)入IAA濃度低的培養(yǎng)基上后,愈傷很快變綠,先出現(xiàn)許多綠點(diǎn),逐漸長(zhǎng)大,大約1周左右就有叢生芽分化,且數(shù)量較多.這是因?yàn)樯L(zhǎng)素與分裂素比值大時(shí)有利于愈傷的形成,比值小時(shí)有利于細(xì)胞的分化.2.2蔗糖濃度對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)分化效果從表2中可以看出在不含蔗糖的培養(yǎng)基上,外植體不能形成愈傷組織,逐漸白化死亡.而在含有不同蔗糖濃度的培養(yǎng)基上,隨著蔗糖濃度的升高,外植體形成愈傷組織的百分率逐漸升高,在30～50g·L-1蔗糖的培養(yǎng)基中,愈傷組織形成率均為100%.蔗糖濃度不同時(shí),愈傷組織大小及形態(tài)也不盡相同.蔗糖濃度為10g·L-1時(shí),只在子葉邊緣形成少量的愈傷組織,分化能力也很低,分化率僅為35%.當(dāng)蔗糖濃度升至20～30g·L-1時(shí),外植體邊緣形成較多的白色顆粒狀愈傷組織,并能夠正常分化,但以30g·L-1的蔗糖濃度分化率最高,可達(dá)100%.當(dāng)蔗糖濃度繼續(xù)升高,達(dá)到40～50g·L-1時(shí),雖然都能誘導(dǎo)出愈傷組織,但愈傷組織塊卻明顯變硬且顏色變褐,只有部分愈傷組織能分化,當(dāng)濃度為50g·L-1時(shí),分化率已降至23%.2.3光照培養(yǎng)成因從表3中看出,不經(jīng)過(guò)暗培養(yǎng),直接在光照條件下進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo),只有部分外植體能形成愈傷組織并且分化率低.如果將外植體暗培養(yǎng)10天,在外植體邊緣開始形成愈傷組織時(shí)進(jìn)行光照培養(yǎng),愈傷組織都可分化.隨著暗培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),愈傷組織雖可不斷生長(zhǎng),但卻逐漸失去了分化能力.在暗培養(yǎng)30天后轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng),只有27%的愈傷組織能分化,很多的則褐化死亡.3討論3.1選擇合適的基因型大量研究證明,基因型是影響番茄組織培養(yǎng)效果的重要因素.在相同培養(yǎng)基上,不同的番茄品種間存在著不同的分化率,只有中蔬9號(hào)和麗春番茄在P3、P4培養(yǎng)基上獲得了最高的愈傷組織分化率,而其它幾個(gè)品種雖然在這幾個(gè)培養(yǎng)基上也能形成愈傷組織,并能不同程度的分化,但要獲得最大的分化率和芽再生率,還需進(jìn)一步調(diào)整培養(yǎng)基中的植物激素種類與濃度,因此,選擇合適的基因型在番茄組織培養(yǎng)中尤為重要.3.2不同的植物生長(zhǎng)劑用量對(duì)番茄外植體再生頻率的影響在植物組織培養(yǎng)中,外源激素的使用是必不可少的,已有許多的研究證明,IAA和6-BA結(jié)合使用會(huì)提高番茄外植體的再生頻率,但由于所選用品種不同,其用量也有很大差別.3.3蔗糖濃度對(duì)植物的影響蔗糖作為植物組織培養(yǎng)中的碳源,既可作為營(yíng)養(yǎng)來(lái)源,又可作為滲透調(diào)節(jié)劑.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,選擇合適的蔗糖濃度對(duì)植物的組織培養(yǎng)非常重要.蔗糖濃度過(guò)低,不能使光合作用有效地進(jìn)行,在愈傷組織中累積的淀粉量不足以使其全部分化,甚至不能分化成苗.而蔗糖濃度過(guò)高會(huì)使培養(yǎng)基中的滲透壓過(guò)高,對(duì)植物材料產(chǎn)生毒害作用,在某種程度上抑制細(xì)胞的分化,進(jìn)而影響分化結(jié)果.3.4暗培養(yǎng)時(shí)間對(duì)番茄外植體分化的影響因?yàn)橹参锊牧鲜窃诤堑呐囵B(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)的,所以光照的作用主要是誘導(dǎo)形態(tài)建成.它涉及到植物細(xì)胞分化的若干重要過(guò)程.光可能通過(guò)光合作用在特殊的細(xì)胞里累積淀粉,并經(jīng)一定量的淀粉聚集,直接或間接地扣動(dòng)了器官發(fā)生的光誘導(dǎo)扳機(jī).暗培養(yǎng)的主要目的是使外植體脫分化,產(chǎn)生一定量的愈傷組織.從表3的結(jié)果可以看出,在完全光照條件下培養(yǎng)番茄外植體只能誘導(dǎo)出少量愈傷組織,因此這些愈傷組織累積的淀粉量也很低,有的甚至無(wú)法啟動(dòng)愈傷組織的分化,所以完全光照條件下誘導(dǎo)的愈傷組織的分化率很低.而暗培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng),雖可使愈傷組織大量生長(zhǎng),但由于大部分糖都用于愈傷組織的增殖,即使轉(zhuǎn)入光照條件下,僅通過(guò)光合作用在愈傷組織中累積的淀粉也是有限的,只能使很少的愈傷組織能產(chǎn)生芽原基,因此分化率下降.可見