縫隙連接參與缺血復灌大鼠心肌傳導功能的影響

縫隙連接參與缺血復灌大鼠心肌傳導功能的影響

所謂死亡后出血，是指患者在重新注冊的初始階段立即給患者進行反復修剪，對心肌的缺血性和重新灌木的損傷有明顯的保護作用。但缺血后處理的心肌保護作用機制尚未完全清楚。近幾年來的研究表明,縫隙連接(gapjunction)通訊參與缺血/復灌心肌的保護作用?？p隙連接是存在于相鄰細胞間的膜通道結(jié)構(gòu),由相鄰的兩個細胞質(zhì)膜上的連接子相互銜接而成,縫隙連接對心肌細胞電同步興奮和代謝耦聯(lián)起著重要作用,同時縫隙連接通訊也受到一些藥物的影響,如庚醇(heptanol)。庚醇是一種脂溶性的縫隙連接脫耦聯(lián)劑,能可逆地抑制縫隙連接。研究發(fā)現(xiàn),庚醇可以發(fā)揮類似心肌缺血預處理的效應。據(jù)報道,缺血后處理與缺血預處理存在一些共同的保護機制。筆者假設(shè),在缺血后處理的心肌保護作用中,可能與預處理共享縫隙連接機制。本實驗旨在探討縫隙連接是否參與缺血后處理的心肌保護作用。1材料和方法1.1ttc公司庚醇(heptanol),氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazoliumchloride,TTC)為Sigma公司產(chǎn)品;H2N-Gly-Ala-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-CONH2(AAP10)委托成都川抗派德生物醫(yī)藥科技有限公司合成。1.2特氟綸左心室SD大鼠,♂,體重220～280g[由浙江省醫(yī)學科學院提供,動物編號:SCXK(浙2003-0001)],斷頭后迅速取出心臟,置于4℃改良Krebs-Henseleit(K-H)液中洗凈血液,迅速轉(zhuǎn)移、固定于Langendorff灌流裝置,以改良K-H液行常規(guī)恒壓(76mmHg)灌流。改良K-H液成分(mmol·L-1):NaCl118.0,KCl4.7,K2PO41.2,MgSO41.2,NaHCO325.0,CaCl21.25,葡萄糖10.0g,pH7.3～7.4,以95%O2+5%CO2飽和,維持灌流液溫度37℃。切開左心耳,將充水乳膠囊插入左心室,囊內(nèi)壓力經(jīng)特氟綸管傳遞至壓力傳感器,由MedLab生物信號采集處理系統(tǒng)記錄和分析。向插入左心室內(nèi)的乳膠囊注水使左心室舒張末壓(leftventricularend-diastolicpressure,LVEDP)維持于4～8mmHg,連續(xù)記錄左心室發(fā)展壓(leftventriculardevelopedpressure,LVDP)、心率(heartrate,HR)、心率與發(fā)展壓的乘積(rate-pressureproduct,RPP)、左心室內(nèi)壓最大上升和下降速率(maximalrise/fallrateofleftventricularpressure,(dP/dtmax)等指標。測定復灌各時間點單位時間的冠脈流量。在復灌各時間點收集冠脈流出液,采用分光光度法測定乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase,LDH)的含量。1.3聯(lián)軸復灌/停灌循環(huán)本模型采用冠脈結(jié)扎法。暴露左心耳和動脈圓錐之間表淺冠狀靜脈下方的左冠脈,用針、線繞過冠脈下方后,兩個線頭穿過一段細硅膠管,然后在另一小段細硅膠管上打結(jié)結(jié)扎,松開結(jié)扣作為復灌處理,以結(jié)扎30min,復灌120min作為缺血/復灌過程,在停灌后復灌即刻立即給予3次復灌/停灌循環(huán),每次10s共計1min,實現(xiàn)缺血后處理。1.4心肌面積測量采用TTC染色法測定梗死面積,掃描儀掃描后使用ImageJ軟件(美國NIH)計算以梗死區(qū)面積占危險區(qū)面積的比例。1.5復灌和停灌循環(huán)本模型采用全心停灌30min復灌120min的處理方法,在停灌后復灌即刻立即給予6次全心復灌/停灌循環(huán),每次10s共計2min,實現(xiàn)缺血后處理。1.6丟失的心律得分法采用心律失常評分法對心律失常嚴重程度進行定量分析,具體評分辦法見表1。1.7心外膜下插設(shè)電極SD大鼠斷頭后開胸迅速取出心臟,置于4℃改良K-H液中洗凈血液,迅速轉(zhuǎn)移、固定于Langendorff灌流裝置,以改良K-H液行常規(guī)恒壓灌流。心外膜下插置3對電極,由外涂絕緣層特氟龍的不銹鋼絲制成,右心室垂直方向置起博電極一對,左心室方向置記錄電極兩對,兩對電極縱向排列固定在一個干膠片上,每個內(nèi)電極相距2.5mm。電極插入時,其縱行方向平行于心室肌纖維的縱軸,另有接地電極一支插入灌流管口附近溶液中。以起搏頻率5Hz和兩倍于舒張期閾值的電壓起搏,測出兩對記錄電極所記錄到心外膜電圖的起始點的時間差,取連續(xù)5個起搏周長的時間差作為計算值,將傳導距離除以該值即為傳導速度。1.8實驗組1.8.1復灌初期系統(tǒng)大鼠隨機分為10組,每組6只。①I/R組(ischemia/reperfusion,I/R):心臟平衡20min后,結(jié)扎左冠狀動脈前降支30min,然后復灌120min;②缺血后處理組(ischemicpostconditioning,Postcond組):同I/R組,但在復灌初期立即給予反復3次短暫的冠狀動脈前降支復灌/缺血的循環(huán),每次10s,共計1min;③庚醇后處理組:同I/R組,但在復灌初期分別以濃度為0.05,0.1,0.5,1.0mmol·L-1的縫隙連接脫耦聯(lián)劑庚醇灌流15min;④I/R+AAP10組:同I/R組,但在復灌初期同時給予縫隙連接開放劑AAP10(1×10-7mol·L-1)灌流15min;⑤Postcond+AAP10:同Postcond組,但在復灌初期同時給予AAP10(1×10-7mol·L-1)灌流15min;⑥庚醇預處理組:同I/R組,但在結(jié)扎冠狀前給予0.5mmol·L-1庚醇的K-H溶液繼續(xù)灌流15min;⑦庚醇+AAP10組:同庚醇預處理組,但在復灌初期立即給予濃度為1×10-7mol·L-1的AAP10灌流15min。1.8.2復灌和停灌時間大鼠隨機分為9組,每組6只。①對照組:心臟穩(wěn)定20min后,繼續(xù)灌流15min;②AAP10組:心臟穩(wěn)定20min后,繼續(xù)分別以濃度為1×10-6、1×10-7、1×10-8mol·L-1的AAP10灌流15min;③I/R組:心臟平衡20min后,全心停灌30min,然后復灌120min;④Postcond組:同I/R組,但在復灌初期立即給予反復6次短暫的全心復灌/停灌的循環(huán),每次各10s,共計2min;⑤庚醇后處理組:同I/R組,但在復灌時分別以濃度為0.05、0.1、0.5、1.0mmol·L-1的庚醇灌流15min;⑥I/R+AAP10組:同I/R組,但在復灌初期同時以濃度為1×10-7mol·L-1的AAP10灌流15min;⑦Postcond+AAP10組:同Postcond組,但在復灌初期同時以濃度為1×10-7mol·L-1AAP10的K-H液灌流15min;⑧庚醇預處理組:同I/R組,但在停灌前給予0.5mmol·L-1的庚醇繼續(xù)灌流15min;⑨庚醇預處理+AAP10組:同庚醇組,但在復灌時以濃度為1×10-7mol·L-1的AAP10灌流15min。1.9統(tǒng)計分析實驗數(shù)據(jù)以ˉx±s表示,采用One-wayANOVA和Newman-Keuls法進行統(tǒng)計學分析。2結(jié)果2.1復灌期間ldh含量與I/R組相比,缺血后處理組LVDP、RPP明顯增高、±dP/dtmax增大、冠脈流量增多,復灌期間冠脈流出液中LDH含量降低,結(jié)果見圖1,表2。復灌期間心律失常評分下降,結(jié)果見表3,心肌傳導速度降低,結(jié)果見圖2,心肌梗死面積明顯減小(I/R組49.11%±18.29%,缺血后處理組25.51%±8.94%,P<0.05)。2.2各組大鼠心肌梗死范圍、ldh、l-1、3.復灌初期分別給予0.05,0.1,0.5,1.0mmol·L-1的庚醇,與I/R組相比,各庚醇組使心肌復灌過程中心律失常評分下降,結(jié)果見表3,高濃度庚醇(0.1～1.0mmol·L-1)使心肌梗死范圍縮小(I/R組49.11%±18.29%,0.1mmol·L-1庚醇組27.93%±1.38%,0.05mmol·L-1庚醇組21.26%±5.00%,1.0mmol·L-1庚醇組16.24%±3.44%,三組P<0.01),復灌期間冠脈流出液中LDH含量降低,傳導速度降低,結(jié)果見圖3、4。2.3增加了1.0.0.05的心肌傳導速度1×10-6,1×10-7,1×10-8mol·L-1的AAP10分別使心肌的傳導速度(m·s-1)由正常時的1.05±0.05增加到1.13±0.04(P<0.05),1.30±0.05(P<0.01),1.43±0.11(P<0.01),并呈劑量依從性關(guān)系。2.4復灌期心律失常評分與I/R組相比,AAP10+I/R組的RPP,LVDP,±dP/dtmax和冠脈流量、LDH含量、心肌梗死面積無明顯變化,結(jié)果見圖1,表2,但明顯降低了復灌期各時間點的心律失常評分,結(jié)果見表3,增加復灌30min前的心肌傳導速度,結(jié)果見圖2。2.5活檢后處理的作用復灌初期同時給予1×10-7mol·L-1的AAP10取消了缺血后處理增高復灌期RPP,LVDP,±dP/dtmax的作用,結(jié)果見表2,取消了缺血后處理增加冠脈流量和降低冠脈流出液中LDH釋放的作用,結(jié)果見圖1,表2,取消了缺血后處理降低心律失常評分的作用,結(jié)果見表3,也取消了缺血后處理縮小心肌梗死面積的作用(缺血后處理組25.51%±8.94%,AAP10+缺血后處理組44.79%±14.77%,P<0.05)。復灌時心肌傳導速度比缺血后處理組加快,結(jié)果見圖2。2.6復灌初期心律失常評分的影響復灌初期同時給予1×10-7mol·L-1的AAP10,減弱了庚醇縮小心肌梗死面積的作用(庚醇組6.96%±3.69%,庚醇+AAP10組43.97%±8.67%,P<0.01),減弱了庚醇降低心律失常評分的作用(庚醇組0.88%±0.64%,庚醇+AAP10組2.0%±0.89%,P<0.05),也減弱了庚醇降低復灌初期的心肌傳導速度的作用,結(jié)果見圖5。3縫隙連接的生理參數(shù)及體外傳導速度的影響本實驗在離體心臟灌流模型上發(fā)現(xiàn),缺血后處理可明顯改善灌注后左心室收縮功能,增加缺血/復灌后冠脈流量,減少心肌損傷標志酶LDH的漏出,減少心肌梗死面積,減少復灌期間心律失常的發(fā)生,縫隙連接脫耦聯(lián)劑庚醇也有類似作用,這種心肌保護作用可被縫隙連接開放劑AAP10所阻斷,提示縫隙連接可能參與了缺血后處理的心肌保護作用。縫隙連接是相鄰細胞之間的連接通道,低分子量物質(zhì)可以自由通透,電位變化也可以進行傳遞,不論是化學耦聯(lián)或電耦聯(lián)均可使信息通過縫隙連接傳到另一細胞,起到細胞間通訊的作用。近年的研究表明,心肌細胞間的電耦聯(lián)對心臟興奮沖動的傳導速度起著關(guān)鍵的決定性作用,因此,在決定傳導速度方面,縫隙連接通道起到了重要的作用。在本實驗中,筆者采用的測定電興奮在心室肌細胞的傳導速度可以間接反映心肌細胞間縫隙連接電耦聯(lián)的情況。在實驗中,筆者發(fā)現(xiàn)經(jīng)缺血后處理的心肌,在復灌期間心肌傳導速度明顯減慢。不同劑量的庚醇在復灌期間心肌傳導速度也呈現(xiàn)不同程度的減慢,同時,這些作用都可以被縫隙連接開放劑AAP10取消或減弱。AAP10的作用機制是增加細胞縫隙連接的傳導性,而對心肌細胞的其他電生理參數(shù)沒有明顯影響。在實驗中筆者觀察到AAP10增加心肌的傳導速度,并呈劑量依從性,表明AAP10可增加縫隙連接細胞間電通訊;另外,AAP