一種含新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的濃縮方法

一種含新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的濃縮方法

作為一種真正的細(xì)胞遺傳遺傳因素轉(zhuǎn)移的載體系統(tǒng)之一，病毒反演反演過(guò)程病毒以其高效感染主細(xì)胞，穩(wěn)定整合到主細(xì)胞組，并將其傳給后細(xì)胞。同時(shí)，高度感染的病毒數(shù)量也是確保在轉(zhuǎn)移基因轉(zhuǎn)移研究中更好地應(yīng)用于遷移率等。因此，病毒反演過(guò)程中的病毒篩選減少，體積減少，滴度增加，已成為推動(dòng)轉(zhuǎn)型反演過(guò)程體系研究的重要方面。本研究旨在通過(guò)差速離心、濾膜截留兩種方法的比較及條件的優(yōu)化,建立可行、高效的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的濃縮方法,獲得帶有標(biāo)記基因的、具有理想感染滴度的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng),從而為使用該系統(tǒng)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。1材料和方法1.1菌株和培養(yǎng)基含有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶Ⅱ(Neor)重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXSN及用于感染靶細(xì)胞NIH3T3細(xì)胞由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室孟慶文博士惠贈(zèng)。大腸桿菌DH5α為本室保存菌種。包裝細(xì)胞系PA317細(xì)胞由本室保存,PA317和NIH3T3細(xì)胞均用含10%小牛血清的DMEM營(yíng)養(yǎng)液增殖,維持液為含2%小牛血清的DMEM營(yíng)養(yǎng)液。工具酶、一般試劑及培養(yǎng)基均購(gòu)自Promega公司與Takara公司。脂質(zhì)體Lipofectin、G418均為GIBCO公司產(chǎn)品。Centricon-30濃縮器為Millipore公司產(chǎn)品。SCP55H型超速冷凍離心機(jī),日立公司產(chǎn)品。日本電子GJEM1200EX2型透射電鏡,本校中心實(shí)驗(yàn)室提供。1.2方法1.2.1病毒載體的檢測(cè)按文獻(xiàn)方法進(jìn)行1.2.2dmem—G418對(duì)于PA317細(xì)胞的最小致死劑量的測(cè)定24孔板接種適量的PA317細(xì)胞,次日,待其長(zhǎng)成50%左右時(shí),加入G418濃度分別為300、400、450、500、550、600、700、800μg/ml的DMEM—10營(yíng)養(yǎng)液,每日觀察細(xì)胞狀態(tài),大約一周后,根據(jù)細(xì)胞死亡情況確定G418對(duì)于PA317細(xì)胞的最小致死劑量。1.2.3病毒載體的篩選參照Lipofectin說(shuō)明書(shū)及文獻(xiàn),用Lipofectin及磷酸鈣兩種介質(zhì)將病毒載體導(dǎo)入包裝細(xì)胞系PA317,并以最小致死劑量的G418進(jìn)行篩選。1.2.4病毒濃縮方法將得到的G418抗性克隆在含有G418(300μg/ml)的選擇培養(yǎng)液中擴(kuò)大培養(yǎng),收毒前一天將陽(yáng)性細(xì)胞1∶4分傳,細(xì)胞貼壁后,加入半量的、新鮮的完全培養(yǎng)液,2—3天后收取培養(yǎng)上清。差速離心法濃縮病毒具體步驟為4℃,10000rpm(6,250×g)離心15min,棄沉淀,上清于4℃,80,730×g離心2h,離心管置于冰浴條件下,1%體積的完全營(yíng)養(yǎng)液回懸沉淀,回懸時(shí)使用同一吸管以避免損失,約每15min吹打一次,避免產(chǎn)生氣泡(氣泡的產(chǎn)生會(huì)使病毒蛋白變性)。濾膜截留法濃縮病毒具體步驟為:將上清加入Centricon-30濃縮器,4℃,6,250×g離心10min,棄去濾液,用回收管封閉濾器,倒置,4℃,6,250×g離心10min,回收濃縮液。電鏡觀察收取濃縮病毒,2%磷鎢酸負(fù)染,透射電鏡觀察。1.2.5g218對(duì)nih3t3的最小致死劑量24孔板接種適量的NIH3T3細(xì)胞,次日待其長(zhǎng)成50%左右時(shí),加入含有G418濃度分別為300、400、500、600、700、800、900、1000μg/ml的DMEM—10營(yíng)養(yǎng)液,每日觀察細(xì)胞狀態(tài),大約一周后根據(jù)細(xì)胞死亡情況,確定G418對(duì)于NIH3T3的最小致死劑量。1.2.6polyhene病毒的感染途徑培養(yǎng)參考文獻(xiàn),用改進(jìn)的方法進(jìn)行滴度測(cè)定。具體步驟為:感染前1天將NIH3T3細(xì)胞按1萬(wàn)/孔接種24孔板,過(guò)夜。感染當(dāng)天,移去培養(yǎng)液,加入低血清培養(yǎng)液1ml(含病毒上清0.1μl、1μl和5μl),加800μg/ml的polybrene儲(chǔ)液至終濃度4μg/ml。37℃感染1—3h。加入低血清培養(yǎng)液1ml,將polybrene稀釋至2μg/ml,培養(yǎng)48h。用選擇培養(yǎng)液1∶4分傳NIH3T3細(xì)胞,培養(yǎng)3天。換含G418最小致死劑量的選擇培養(yǎng)液(含G418)。共培養(yǎng)7—10天后。待克隆出現(xiàn)時(shí),進(jìn)行克隆計(jì)數(shù)。根據(jù)公式:滴度(RCFU)=克隆數(shù)×稀釋度×10,計(jì)算滴度。2結(jié)果2.1多元雙酶切鑒定經(jīng)KpnⅠ單酶切得到2.75kb、3.1kb兩條帶,經(jīng)HindⅢ、XbaI雙酶切得到了1.6kb、4.2kb兩條帶(鑒定結(jié)果見(jiàn)圖1)。2.2g418對(duì)pa317細(xì)胞的最小致死量的測(cè)量G418對(duì)于PA317的最小致死劑量為0.3g/L。2.3基于plxsn抗性克氏原螯蝦的轉(zhuǎn)染效果用脂質(zhì)體Lipofectin介導(dǎo)與磷酸鈣介導(dǎo)兩種方法,經(jīng)多次轉(zhuǎn)染,0.3g/LG418篩選,得到了多個(gè)整合有pLXSN抗性克隆(相同條件下,兩種方法的轉(zhuǎn)染效果的比較見(jiàn)表1)。2.4病毒的采集和電看病毒的濃縮液在透射電鏡下觀察,觀察到了具有逆轉(zhuǎn)錄病毒形態(tài)特征(球形,有囊膜,直徑平均約為100nm)的病毒粒子(見(jiàn)圖2)。2.5g418對(duì)nih3t3細(xì)胞的最小致死量的測(cè)量G418對(duì)于NIH3T3細(xì)胞的最小致死劑量為0.5g/L。2.6比較前后病毒濃度的逆模式病毒感染流度結(jié)果見(jiàn)表23第二代溶劑系統(tǒng)的篩選在逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移中,經(jīng)常選用標(biāo)記基因(Neor,LacZ等)來(lái)追蹤被標(biāo)記細(xì)胞,本實(shí)驗(yàn)以Neor作為顯性標(biāo)記基因。具有易于篩選、無(wú)內(nèi)源性等優(yōu)點(diǎn)。骨架為Moloney小鼠白血病病毒的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中,只含有病毒基因組5′、3′兩端的長(zhǎng)末端重復(fù)(LTR)序列(包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和整合必需的序列)和Ψ信號(hào)(含有結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行包裝的結(jié)合序列和病毒外殼蛋白mRNA的剪接信號(hào))。本研究選擇的載體屬于骨架為MoMLV的載體系列,在實(shí)踐中已得到廣泛應(yīng)用,克隆有目的基因的病毒載體需要包裝細(xì)胞的包裝才能成為成熟的病毒粒子,包裝細(xì)胞的染色體上以前病毒的形式整合有逆轉(zhuǎn)錄病毒順式缺陷的全部結(jié)構(gòu)基因,可表達(dá)病毒結(jié)構(gòu)蛋白,并將載體RNA包裝起來(lái)。另外,本研究選用的包裝細(xì)胞系PA317,屬于第二代包裝細(xì)胞系,含逆轉(zhuǎn)錄病毒PAM3基因組,除Ψ信號(hào)缺失外,5′LTR部分缺失,3′LTR被SV40的poly(A)信號(hào)取代,這種包裝結(jié)構(gòu)與載體結(jié)構(gòu)只有經(jīng)過(guò)二次獨(dú)立的重組才可能形成有復(fù)制能力的野生型病毒,因此其安全性高,而且PAM3的env來(lái)自4070A雙嗜性(amphotropic)逆轉(zhuǎn)錄病毒,可產(chǎn)生雙嗜性(amphotropic)病毒顆粒。在轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞的試驗(yàn)中,本研究運(yùn)用了脂質(zhì)體Lipofectin與磷酸鈣兩種介質(zhì),根據(jù)G418抗性細(xì)胞克隆的數(shù)目,比較兩種方法的轉(zhuǎn)染效率,結(jié)果表明,脂質(zhì)體介導(dǎo)法要優(yōu)于磷酸鈣介導(dǎo)法。對(duì)于靶細(xì)胞而言,病毒受體的豐度以及細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)是影響重組逆轉(zhuǎn)錄病毒體外感染的兩個(gè)主要因素。我們選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、鼠源的NIH3T3,來(lái)滿足這兩個(gè)條件,從而為通過(guò)體外感染靶細(xì)胞以測(cè)定重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的滴度提供了基本保證。由于細(xì)胞數(shù)目等方面的因素,為了保證重組逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度測(cè)定的精確性,在使用病毒溶液對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行感染時(shí),除了要設(shè)置平行樣品之外,我們還設(shè)置了多個(gè)不同稀釋倍數(shù)進(jìn)行滴定,以獲得可計(jì)數(shù)的克隆數(shù),得到精確的滴度值,經(jīng)過(guò)多次摸索,我們發(fā)現(xiàn),在24孔板(1ml營(yíng)養(yǎng)液)進(jìn)行重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的滴度測(cè)定時(shí),加入0.1μl、1μl、5μl的病毒100倍濃縮液,在計(jì)數(shù)克隆時(shí),即可獲得較為理想的結(jié)果,而加入0.01μl、100μl病毒濃縮液時(shí),則很難獲得理想的克隆計(jì)數(shù)結(jié)果,因此不能獲得精確的滴度值。差速離心法是分離提純病毒的有效方法之一,本研究先用中速去除病毒上清中較大的細(xì)胞碎片及其它較大的雜質(zhì),然后選擇80,730×g進(jìn)行超速離心,并且盡量保證所有操作在低溫下進(jìn)行,濃縮前后重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染滴度比較結(jié)果表明,采用該方法基本不影響病毒的滴度。而濾膜截留法盡管簡(jiǎn)化了操作步驟并縮短了操作時(shí)間,避免了操作中可能發(fā)生的病毒粒子數(shù)目的減少與病毒蛋白的變性,但由于濾器濾膜吸附了一定數(shù)量的病