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文檔簡介

花生青枯病抗性遺傳規(guī)律研究

花生是世界上重要的經(jīng)濟(jì)和油料作物之一,也是發(fā)展中國家重要的植物和蛋白質(zhì)來源。我國是世界上最大的花生生產(chǎn)、消費(fèi)和出口國,花生生產(chǎn)發(fā)展對(duì)于增加農(nóng)民收入和保障國家食物安全具有重要意義。近年來,隨著我國農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整和豐產(chǎn)栽培措施(如早播、密植、高肥等)的應(yīng)用和感病花生品種的推廣,花生青枯病在中國南方普遍發(fā)生,并成為長江流域及華南地區(qū)的主要病害之一,并有逐步向北發(fā)展的趨勢。在上述病區(qū),每年發(fā)病面積在40萬hm2以上,占中國花生種植面積的10%左右,同時(shí)該病區(qū)也是中國花生黃曲霉污染最嚴(yán)重的地區(qū),因此嚴(yán)重影響了中國花生的發(fā)展。而花生青枯病是土傳病害,栽培措施和藥劑防治難度大,選育和推廣抗病品種是控制病害發(fā)生、減少產(chǎn)量損失的最經(jīng)濟(jì)有效措施。但是,目前我國種植的抗青枯病花生品種在抗性水平、抗性穩(wěn)定性、產(chǎn)量潛力及品質(zhì)性狀等方面還存在諸多缺陷,與育種研究中選用抗病親本的遺傳基礎(chǔ)狹窄有關(guān),同時(shí)現(xiàn)有的抗性鑒定與篩選技術(shù)主要依靠田間試驗(yàn),受環(huán)境影響較大,費(fèi)時(shí)費(fèi)力,使近十多年來抗病育種進(jìn)展緩慢。20世紀(jì)90年代以來,分子標(biāo)記開始應(yīng)用于花生研究。RAPD和RFLP研究表明,花生栽培種的DNA多態(tài)性相對(duì)貧乏。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的完善和應(yīng)用,深入研究結(jié)果表明,花生栽培種之間或野生種不同區(qū)組間存在廣泛的DNA多態(tài)性[8,9,10,11,12,13,14]。Herselman等和雷永等利用AFLP技術(shù)分別獲得與抗黃曲霉有關(guān)的標(biāo)記和與抗花生矮化病毒病有關(guān)的標(biāo)記。而花生青枯病在分子水平上的研究還沒有開展。因此,針對(duì)抗性鑒定與篩選技術(shù)的不穩(wěn)定性和分子標(biāo)記技術(shù)在花生上成功應(yīng)用,有必要對(duì)花生青枯病進(jìn)行分子水平的研究,建立分子標(biāo)記輔助育種技術(shù),以加快花生抗青枯病育種進(jìn)程,提高產(chǎn)量及品質(zhì)。在此背景下,本研究對(duì)利用抗、感品種雜交獲得的重組近交系群體(RIL)進(jìn)行花生抗青枯病分子標(biāo)記研究,獲得與抗性相關(guān)的分子標(biāo)記,為花生青枯病抗性分子標(biāo)記輔助育種提供理論基礎(chǔ)。1材料和方法1.1f6重組近交系的制備本實(shí)驗(yàn)采用的材料中花5號(hào)是中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所培育的早熟高產(chǎn)高油花生新品種,不抗青枯病(成活率在25%以下);遠(yuǎn)雜9102是河南省農(nóng)科院通過遠(yuǎn)緣雜交而來,抗青枯病(成活率在85%以上)。以中花5號(hào)為母本、遠(yuǎn)雜9102為父本配制抗感雜交組合,F2每個(gè)花生果取一?;ㄉ追N植,得到123個(gè)家系,每個(gè)家系自交5代得到F6重組近交系。取幼嫩的花生葉片2~3片(0.5g),在液氮下迅速冷凍后保存于-70℃冰箱備用。1.2方法1.2.1抗病品種和品種的選擇2003年和2004年采用田間自然鑒定法,分別對(duì)重組近交系進(jìn)行青枯病抗性鑒定。在自然病區(qū)選擇青枯病歷年感病品種發(fā)病率在70%以上的地塊作為病圃,病圃土壤質(zhì)地、肥料和發(fā)病程度均勻一致。重組近交系種植單行,每行單粒種15粒,并每隔10行種植抗病品種和感病品種作為對(duì)照,隨機(jī)排列,3次重復(fù)。出苗后發(fā)病前調(diào)查各區(qū)的基本苗數(shù),并定期調(diào)查記載田間發(fā)病情況,注意辨別枯萎癥狀,剔除根腐、莖腐病造成的死苗,以植株成活率表示抗性。植株成活率在80.1%以上的表示抗,用R表示;植株成活率在65.1%~80%之間的表示中抗,用MR表示;植株成活率在35.1%~65%之間的表示中感,用MS表示;植株成活率在35%以下的表示感病,用S表示。參照Choo等的方法估算青枯病抗性的遺傳力、基因?qū)?shù)、偏度系數(shù)(g1)和峰度系數(shù)(g2)。1.2.2st和mse雙酶切參照Vos等和雷永等的方法,并加以改進(jìn),采用PstⅠ和MseⅠ雙酶切,所用接頭和引物系列見表1。銀染程序參照陸光遠(yuǎn)等和雷永等的銀染程序。染色后晾干,并照相保存??垢谐氐臉?gòu)建參照雷永等的方法。1.2.3重組遺傳距離和抗性關(guān)系記錄多態(tài)性引物在抗青枯病花生材料、親本和重組近交系上的多態(tài)性條帶,有帶記為1,無帶記為0。建立在重組近交系標(biāo)記和抗性之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系,估計(jì)遺傳距離。將分子標(biāo)記作為染色體上的一個(gè)位點(diǎn),根據(jù)重組表型出現(xiàn)的比率,計(jì)算標(biāo)記與抗青枯病基因間的交換值,并換算成遺傳距離X(cM)=1/4ln[(1+2r)/(1-2r)],其中r表示交換值。2結(jié)果與分析2.1重組青枯病抗性基因因子檢測根據(jù)抗性鑒定結(jié)果的統(tǒng)計(jì),重組近交系株系抗性(以植株成活率表示)在10.56%~100%之間,平均抗性在70%左右;抗性大于80.1%的株系有51個(gè),抗性在65.1%~80%之間的有33個(gè),抗性在35.1%~65%之間的有28個(gè),抗性小于35%的有11個(gè),呈連續(xù)分布特征,表現(xiàn)為數(shù)量性狀遺傳。重組近交系青枯病抗性分布不具有單一分布的特征,而表現(xiàn)為多個(gè)成分分布的混合分布(圖1),成分分布函數(shù)大于1,說明該性狀由主效基因控制,而且抗性趨向于抗性親本,呈顯性或部分顯性,這與珍珠豆型花生青枯病抗性是顯性或部分顯性相一致。由于重組近交系與DH群體一樣,各株系內(nèi)具有同質(zhì)性,根據(jù)Choo等提出的公式,可以估算出控制青枯病抗性的基因?qū)?shù)為2(表2)。由此可以看出青枯病抗性表現(xiàn)為兩對(duì)主效基因控制的數(shù)量遺傳,這與珍珠豆型花生青枯病抗性是由寡基因控制的遺傳一致,而且主效基因的遺傳力較高,為84.0%(表2)。由于RIL的偏度系數(shù)顯著小于0,峰度系數(shù)也小于0,說明這兩對(duì)主效基因存在重疊作用。2.2引物篩選及篩選用224對(duì)AFLP引物(表1)在兩親本中花5號(hào)和遠(yuǎn)雜9102進(jìn)行篩選,檢測到有差異條帶的引物45對(duì),多態(tài)性引物占20.09%。45對(duì)多態(tài)性引物共擴(kuò)增出60條多態(tài)性條帶,平均每條多態(tài)性引物產(chǎn)生1.33條帶。大多數(shù)引物只產(chǎn)生一條多態(tài)性帶,部分引物有2~3條多態(tài)性條帶。用親本間有多態(tài)性的引物在抗感池間進(jìn)一步篩選。結(jié)果顯示,有5對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物在抗感池間表現(xiàn)差異。進(jìn)一步用這5對(duì)引物對(duì)極端抗感株系進(jìn)行AFLP分析,P1M58及P3M59在極端抗病株系中能擴(kuò)增,而在極端感病株系中不能擴(kuò)增,這2個(gè)標(biāo)記的擴(kuò)增片段大小都在500bp左右,可能與花生抗青枯病基因連鎖。2.3篩選和擴(kuò)增數(shù)據(jù)用多態(tài)性引物P1M58、P3M59對(duì)重組近交系的123個(gè)株系進(jìn)行AFLP檢測,結(jié)果表明,在重組近交系的123株系中,引物P3M59在64個(gè)株系擴(kuò)增出分子量在500bp左右的條帶,59個(gè)株系未擴(kuò)增出特異條帶。51個(gè)抗病株系中有5個(gè)株系未擴(kuò)增出特異條帶;11個(gè)感病株系都未擴(kuò)增出特異性條帶,兩點(diǎn)測驗(yàn)結(jié)果,標(biāo)記P3M59與花生青枯病抗性的交換值為8.06%,換算成遺傳距離為8.12cM(圖2,表3)。引物P1M58在重組近交系的123個(gè)株系中,有58個(gè)株系擴(kuò)增出分子量在500bp左右的條帶,65個(gè)株系未擴(kuò)增出特異性條帶,其中51個(gè)抗病株系中有6個(gè)株系未擴(kuò)增出特異條帶,11個(gè)感病株系中有1個(gè)感病株系擴(kuò)增出特異性條帶,兩點(diǎn)測驗(yàn)結(jié)果,該分子標(biāo)記與花生青枯病抗性的交換值為11.29%,換算為遺傳距離為11.46cM(圖3,表3)。2.4抗青枯病基因標(biāo)記與抗性的關(guān)系通過對(duì)10個(gè)抗花生青枯病品種和3個(gè)感病品種的花生材料進(jìn)行AFLP分析,結(jié)果表明,在10個(gè)抗青枯病品種中,P3M59標(biāo)記僅在7個(gè)材料中有擴(kuò)增帶(表4);3個(gè)感病品種均未獲得擴(kuò)增帶,標(biāo)記與抗性的符合率為70%;標(biāo)記P1M58在5抗病品種檢測到擴(kuò)增帶,符合率為50%,感病品種未檢測到該標(biāo)記。3討論3.1花生青枯病抗性基因型基因控制花生青枯病抗性受兩對(duì)主效基因控制,主效基因的遺傳力較高,為84.0%,這與先前的研究結(jié)果基本一致,但先前的研究結(jié)果表明花生青枯病抗性還受一對(duì)抑制基因控制,而本研究未檢測到抑制基因,而發(fā)現(xiàn)兩對(duì)主效基因存在重疊作用,這可能與所用材料不同有關(guān)。3.2抗青枯病司法學(xué)標(biāo)記的選擇早期的RAPD和RFLP研究表明,花生栽培種的DNA多態(tài)性相對(duì)貧乏。而AFLP和SSR研究表明,花生栽培種之間或野生種不同區(qū)組間存在廣泛的DNA多態(tài)性。但由于SSR引物開發(fā)需要知道基因組信息,開發(fā)成本較大,因此花生上已開發(fā)的SSR引物較少,不能滿足本實(shí)驗(yàn)的需要;而AFLP技術(shù)具有實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定,無需預(yù)知基因組信息等特點(diǎn),對(duì)于花生等分子生物學(xué)研究進(jìn)展比較緩慢的作物來說,是一種實(shí)用性強(qiáng)、高效可靠的分子標(biāo)記技術(shù)。本研究通過BSA分析方法,獲得了與花生青枯病抗性連鎖的兩個(gè)AFLP標(biāo)記P1M58和P3M59

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