l137在口腔扁平苔蘚病損中的表達及意義

l137在口腔扁平苔蘚病損中的表達及意義

抗菌劑是自然界中廣泛存在的一種具有抗菌和腫瘤活性的生物源性茶多酚。存在于人類黏膜組織的抗菌肽主要包括防御素家族和Cathelicidins家族。LL37是人類唯一的Cathelicidins家族成員,其兩端均為亮氨酸殘基(leu)、含有37個氨基酸的成熟肽,主要表達于上皮細胞和中性粒細胞。研究表明LL37在皮膚黏膜免疫中具有重要作用。口腔扁平苔蘚(orallichenplanus,OLP)是口腔黏膜常見的慢性炎癥性疾病,目前病因不確切。本研究旨在探討LL37在OLP患者病損中的表達水平及規(guī)律,分析LL37在OLP發(fā)病機制中的作用。1材料和方法1.1臨床資料及免疫組化檢測選擇經本院活檢確診的25例OLP初診患者口腔黏膜病損組織,其中男10例,女15例,年齡19～72歲,平均年齡47.2歲,病程2周～8年。所有患者均無全身系統(tǒng)性疾病,無其它確診口腔疾患,所有病例均由2位口腔病理醫(yī)師確診。7例正?？谇火つそM織納入對照組。切取新鮮病變組織5mm×5mm大小2份,一份液氮速凍后儲存于-70℃冰箱以備采用RT-PCR法檢測LL-37mRNA表達水平;另一份4%中性甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋,4μm厚連續(xù)切片行病理診斷及免疫組化染色檢測LL-37表達。所有納入研究對象均獲知情同意。1.2pcr檢測細胞內引物鼠抗人LL-37單克隆抗體(美國SantaCruz公司),UltraSensitiveTMSP超敏試劑盒(福州邁新生物技術開發(fā)公司),組織/細胞(小量)RNA抽提試劑盒(上海華舜生物工程有限公司),逆轉錄試劑盒、100bpladderDNAMarker(美國MBI公司),目的基因和內參引物(上海生物工程技術服務公司),Taq酶、dNTP、buffer、Mg2+(寶生物工程大連有限公司)。1.3細胞培養(yǎng)及鑒定主要步驟如下:石蠟切片脫蠟、水化后,微波抗原修復,過氧化酶阻斷溶液阻斷內源性過氧化物酶的活性,正常非免疫動物血清孵育,滴加LL37第一抗體(工作濃度為1∶150),4℃過夜,滴加生物標記的第二抗體,計滴加鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液,DAB溶液顯色,顯微鏡下觀察3～10min,蘇木精復染,梯度酒精脫水干燥,二甲苯透明,中性樹膠封固。對照設置:PBS代替一抗作為空白對照,用已知陽性切片作陽性對照。結果判斷:參照陽性對照切片,將在胞質中出現(xiàn)棕黃色顆粒的細胞判定為陽性細胞。結果判斷綜合考慮陽性細胞的著色強度及著色細胞百分比2個因素(表1)。對染色陽性切片選擇5個不相重疊的高倍視野(×400),將上皮層分不全角化層、顆粒層、棘層、基底層,淋巴細胞分別計數(shù),觀察陽性細胞著色強度以及著色細胞百分比。1.4pcr擴增具體步驟如下:取OLP患者口腔病損組織50mg加1ml裂解液,總RNA提取嚴格按照試劑盒說明書操作。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳,紫外燈下觀察結果并攝影。同時采用UV分光光度計測定A260/A280值。RNA-70℃保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)測得的RNA濃度,取4μlRNA嚴格按照試劑盒說明書進行逆轉錄。得到的cDNA-20℃保存或直接進行PCR擴增反應。PCR反應總體積為20μl。LL37上游引物為5′-GAAGACCCAAAGGAATGGCC-3′,下游引物為5′-TCAGAGCCCAGAAGCCTGAG-3′,擴增條件為95℃預變性2min后,按94℃變性20s,57℃退火40s,72℃延伸40s,共循環(huán)31次,最后在72℃延伸8min。預期擴增產物片斷為547bp。β-action內參上游引物為5′-ATTGCCGACAGGATGCAGAA-3′,下游引物為5′-GCTGATCCACATCTGCTGGA-3′,擴增條件與LL-37相同。預期擴增產物片斷為150bp。取目的基因和內參產物各5μl混合用2%瓊脂糖凝膠100V穩(wěn)壓電泳1h,EB染色。紫外燈下觀察結果并攝影。采用圖像分析系統(tǒng)掃描儀測定每組標本擴增產物的吸光度值(A),分別計算出LL-37與β-action灰度的相對比值代表LL-37mRNA的水平。1.5設計背景方差齊或參數(shù)檢驗中的秩和檢驗采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料采用成組設計兩樣本比較的t檢驗(方差齊)或非參數(shù)檢驗中的成組設計兩樣本比較的秩和檢驗(方差不齊);計數(shù)資料采用非參數(shù)等級資料檢驗中的成組設計兩樣本比較的秩和檢驗。檢驗水準取α=0.05(雙側)。2結果2.1固有層的表達所有檢測樣本均出現(xiàn)了LL-37的陽性染色,陽性染色主要在胞質,胞膜和胞核無表達。在上皮層主要表達于棘層,少量表達于不全角化層和基底層,顆粒層無表達;在固有層主要表達于T淋巴細胞。7例健康口腔黏膜中,其上皮組織均呈LL-37弱陽性染色(圖1),而25例OLP樣本,口腔黏膜上皮均呈LL37強陽性染色,且陽性細胞較多,可見于上皮各層,但主要是棘層(圖2),P<0.05,差異有統(tǒng)計學意義。2.2rna純度的測定總RNA電泳如圖3所示,出現(xiàn)清晰的28S、18S條帶,且兩者的熒光強度基本為2∶1,說明所提取的總RNA濃度較好,基本無降解。采用UV分光光度計于260nm和280nm處測定RNA的吸光度(A)值,計算A260/A280值,為1.7～1.9,表明標本保存較好,無污染,總RNA純度較好。OLP與健康對照口腔黏膜組織中的LL37以及β-actin內參的RT-PCR產物電泳圖譜如圖3所示。LL37/actin比值分別為0.71±0.07、0.39±0.03,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。3ll3在olp基因子研究中的作用本研究發(fā)現(xiàn)正?？谇火つそM織中LL-37亦有較弱表達,結合唾液中可檢測出LL37,提示其在健康口腔黏膜的天然免疫中起著一定作用。LL37在正?？谇火つど掀ぶ形⑷醣磉_,而在OLP病損組織中呈上調強表達,提示LL37參與了OLP的病理過程。大量研究表明,OLP是T淋巴細胞介導的免疫性疾病。李寧等發(fā)現(xiàn)OLP病損上皮趨化因子9(CXCL9)等強陽性表達,提示CXCL9在淋巴細胞和炎癥細胞的趨化、聚集以及OLP發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮了一定作用。而LL37在OLP中的具體機制目前尚未見報道。Hase等研究發(fā)現(xiàn)皮膚以及消化道上皮在受到潰瘍分枝桿菌、幽門螺桿菌等病原微生物刺激時,上皮細胞可以通過toll-like受體(TLRs)2、4等旁路刺激釋放LL37等趨化因子而起到局部免疫作用。本研究中發(fā)現(xiàn)糜爛型OLP中局部LL37表達加強的現(xiàn)象,提示其暴露在有菌的口腔環(huán)境中,口腔外源刺激是否促進LL37在病損的局部表達有待進一步研究。同時LL37能結合和抑制脂多糖活性,趨化CD4T淋巴細胞、單核細胞和中性粒細胞,使?jié){細胞脫顆粒,增強巨噬細胞的吞噬功能,增強殺菌力度,促進抗感染免疫;趨化肥大細胞,使其脫顆粒,并產生前列腺素D等。Heliborn等的研究提示在皮膚傷口處,可以檢測出高水平的LL37,相反,在慢性潰瘍部位,其LL37水平低,周邊上皮細胞中LL37缺如,提示LL37還可能通過參與上皮細胞的增殖而參與皮膚等傷口的愈合和血管的發(fā)生。Aarbiou等在LL37對人肺上皮細胞體外作用研究中發(fā)現(xiàn),防御素HNP1-3與LL37等可以通過不同的細胞間旁路導致線粒體損傷從而導致細胞死亡,可能對宿主細胞有直