細(xì)胞與胞外基質(zhì)微環(huán)境的物理力學(xué)相互作用

細(xì)胞與胞外基質(zhì)微環(huán)境的物理力學(xué)相互作用

0細(xì)胞牽引顯微方法一般來說，動(dòng)物組織中的細(xì)胞是被膜包圍的一個(gè)小單元。它充滿了濃度較高的化合物溶液，具有獨(dú)特的能力，即通過生長(zhǎng)和分裂產(chǎn)生自己的提取物。細(xì)胞是生命體的結(jié)構(gòu)與生命活動(dòng)的基本單元,在細(xì)胞內(nèi)部實(shí)現(xiàn)著物質(zhì)代謝、能量轉(zhuǎn)換和信息傳遞等一系列相互交織而又精確有序的生命過程,從而展現(xiàn)一個(gè)生機(jī)盎然、絢麗多姿的生命世界。細(xì)胞一般生活在細(xì)胞外基質(zhì)(即由分泌蛋白和多糖組成的充滿胞外空間的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu))所形成的微環(huán)境中,細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間主要通過粘著斑(FocalAdhesion)連接在一起。粘著斑是由眾多蛋白分子構(gòu)成的“超分子復(fù)合體”,呈橢圓形(一般長(zhǎng)軸尺寸為2～5μm,短軸為1～2μm),其上面至少包含150種以上的不同功能蛋白分子,它一端通過踝蛋白(Talin)與細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白骨架相銜接,另一端通過跨膜蛋白——整合素(Integrin,也稱整合蛋白)與細(xì)胞外基質(zhì)相連,從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞與胞外基質(zhì)的粘附。細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白骨架產(chǎn)生的收縮力可以經(jīng)由粘著斑傳遞到細(xì)胞外基質(zhì),產(chǎn)生所謂的細(xì)胞牽引力(CellularTractionForces)[13,14,15,16,17,18,19,20]。在此過程中,粘著斑上分布的豐富蛋白分子也會(huì)積極主動(dòng)地感知外部微環(huán)境的物理化學(xué)變化,適時(shí)做出相應(yīng)的功能性響應(yīng)[21,22,23,24,25,26,27,28]。近些年來的研究表明,細(xì)胞與胞外基質(zhì)微環(huán)境之間的這種生物物理力學(xué)相互作用涉及許多復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,不僅對(duì)于細(xì)胞的增殖、分化、收縮、遷移以及凋亡等基本生理過程起著重要的調(diào)控作用[29,30,31,32,33,34],而且也直接與諸多嚴(yán)重疾病(例如心血管疾病和腫瘤疾病)的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在單細(xì)胞水平上定量研究細(xì)胞生物物理力學(xué)活動(dòng)規(guī)律及特點(diǎn)具有重要的生理病理學(xué)意義。單個(gè)細(xì)胞與外部基質(zhì)(基底)之間的作用力一般在納牛頓量級(jí)(甚至更小),作用區(qū)域一般不超過50×50μm2,近幾年發(fā)展起來的細(xì)胞牽引力顯微鏡方法(CellularTractionForceMicroscopy),實(shí)現(xiàn)了在不破壞細(xì)胞生理活性的前提下,定量表征細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)(彈性基底)之間的力學(xué)相互作用。細(xì)胞牽引力顯微鏡方法的基本思路是將細(xì)胞培養(yǎng)在軟的凝膠(例如聚丙烯酰胺(Polyacrylamide,PAA))或高分子聚合物(例如聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane,PDMS))彈性基底表面,通過分析計(jì)算細(xì)胞引起的基底彈性變形進(jìn)而求得細(xì)胞牽引力場(chǎng)(如圖1所示)。采用上述思路求解時(shí),細(xì)胞在彈性基底上運(yùn)動(dòng)(例如細(xì)胞收縮和遷移)過程中各個(gè)時(shí)刻牽引力變化分布圖都可以可視化在計(jì)算機(jī)屏幕上,因此這種技術(shù)通常形象地稱作“細(xì)胞牽引力顯微鏡方法”。細(xì)胞牽引力測(cè)量方法始于上個(gè)世紀(jì)八十年代初Harris等人的開創(chuàng)性研究工作,他們當(dāng)時(shí)設(shè)法在硅酮液體表面形成一層硅膠薄膜,然后把成纖維細(xì)胞培養(yǎng)在這層薄膜之上,首次觀察到了牽引力導(dǎo)致的硅膠薄膜褶皺變形,并以此估算了細(xì)胞牽引力大小。后來,Burton等人利用紫外照射的方法軟化含三甲基末端的苯甲基聚硅氧烷,獲得了更加柔軟的基底膜,從而提高了這一方法的分辨率。然而,由于基底膜褶皺變形具有高度非線性特點(diǎn),致使?fàn)恳η蠼馐掷щy,因此Harris等人開創(chuàng)的測(cè)力方法只能獲得半定量甚至是定性的計(jì)算結(jié)果。1997年,Pelham和Wang等人提出了應(yīng)用聚丙烯酰胺凝膠材料制作彈性薄膜進(jìn)行細(xì)胞牽引力測(cè)量的方法。聚丙烯酰胺是一種疏松多孔的高聚物,由丙烯酰胺與二丙烯酰胺交聯(lián)而成,通過調(diào)節(jié)兩種組分的配比,可改變孔徑大小,形成不同交聯(lián)程度、不同硬度的凝膠彈性基底。此種凝膠材料不僅透明,無毒,生物相容性好,適合細(xì)胞在其上面粘附生長(zhǎng),而且在制作過程中可以方便地?fù)饺霟晒忸w粒,在薄膜表面形成隨機(jī)分布的熒光標(biāo)記圖案(類似于散斑圖,如圖1所示),便于使用光力學(xué)測(cè)量方法進(jìn)行基底變形分析。以聚丙烯酰胺凝膠彈性基底為例,細(xì)胞牽引力顯微鏡方法主要包括如下幾個(gè)步驟:(1)根據(jù)需要確定丙烯酰胺與二丙烯酰胺的濃度配比,同時(shí)摻入適量的熒光標(biāo)記顆粒,制作硬度合適的彈性薄膜基底,并在基底表面形成隨機(jī)熒光標(biāo)記圖案;(2)在其上面粘附生長(zhǎng)細(xì)胞,然后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞活動(dòng)導(dǎo)致的彈性基底表面變形,并拍攝變形前后的基底熒光“散斑”圖案;(3)運(yùn)用圖像處理方法提取彈性基底表面變形信息;(4)根據(jù)基底變形反演計(jì)算細(xì)胞牽引力場(chǎng)。應(yīng)該指出,由測(cè)量得到的彈性基底位移場(chǎng)求解細(xì)胞牽引力場(chǎng)的過程屬于數(shù)學(xué)物理問題中的一類病態(tài)“反問題”,這使得無論是理論分析還是數(shù)值計(jì)算都有特定的困難。所謂病態(tài)反問題,主要表現(xiàn)為數(shù)字物理方程的解不是連續(xù)地依賴于觀測(cè)數(shù)據(jù)(輸入數(shù)據(jù)),即觀測(cè)數(shù)據(jù)的微小偏差都可能導(dǎo)致解的很大變化。對(duì)于實(shí)際問題,一般觀測(cè)數(shù)據(jù)的誤差(或噪聲)在所難免,因此,基于這些或多或少帶有誤差的觀測(cè)數(shù)據(jù)反推得到的方程解極有可能偏離真解甚遠(yuǎn)。如何通過盡可能多的先驗(yàn)知識(shí),運(yùn)用適當(dāng)?shù)臄?shù)學(xué)物理方法反演得到穩(wěn)定可靠、高時(shí)空分辨率的引力場(chǎng)是細(xì)胞牽引力顯微鏡方法的核心所在,也是本文關(guān)注的重點(diǎn)。為此,我們將首先簡(jiǎn)要介紹一下彈性基底位移場(chǎng)的求解方法,然后著重論述細(xì)胞牽引力顯微鏡反演方法的最新研究進(jìn)展。1興趣讀者介紹在細(xì)胞牽引力顯微鏡方法中,彈性基底膜的制備、力學(xué)性能表征、細(xì)胞培養(yǎng)與顯微觀察等前期實(shí)驗(yàn)技術(shù)相對(duì)簡(jiǎn)單,且已經(jīng)形成了比較完善的實(shí)驗(yàn)流程,限于篇幅,本文將不再進(jìn)行詳細(xì)介紹,有興趣的讀者可以參考相關(guān)文獻(xiàn)[30,41,43,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60]。歸納起來,基底位移場(chǎng)的求解方法可以大致分為兩種,即基于模式識(shí)別技術(shù)的熒光粒子位移跟蹤方法(PatternRecognitioninIdentifyingPairsofBeads)和數(shù)字圖像相關(guān)方法(DigitalImageCorrelation,DIC)。1.1彈性基底熒光顆粒點(diǎn)位置信息該方法通過精確匹配彈性膜基底變形前后其表面熒光微顆粒位置信息,達(dá)到快速準(zhǔn)確獲取基底彈性變形信息的目的。用模式識(shí)別技術(shù)提取彈性基底位移場(chǎng)的基本思路如圖2所示。首先,把變形前的彈性基底熒光圖作為參考圖像,并在其中任選一個(gè)熒光顆粒點(diǎn)m,找到其鄰近熒光顆粒點(diǎn)n;其次,在變形后的彈性基底熒光圖像中分別預(yù)搜索熒光顆粒點(diǎn)m和n的可能位置集合{M}和{N};最后,精確匹配從集合{M}到{N}所有可能情況,這樣,根據(jù)基底彈性位移場(chǎng)唯一確定性這一限制條件,我們總能確定熒光顆粒m和n之間相對(duì)位置。依次類推,就可以獲得基底彈性變形后所有熒光顆粒點(diǎn)相對(duì)位置信息。此方法通過對(duì)單個(gè)的熒光粒子位置的跟蹤方式,最終可獲得所有粒子的位移,整個(gè)彈性基底的位移場(chǎng)可以通過插值的方法計(jì)算出來。顯而易見,這種方法的計(jì)算精度嚴(yán)重依賴于熒光標(biāo)記顆粒的分布密度和分布的均勻性,當(dāng)表面熒光顆粒分布密度較高時(shí),單個(gè)熒光粒子的位移場(chǎng)的“錯(cuò)誤識(shí)別”也會(huì)增多,當(dāng)表面熒光顆粒分布密度較低時(shí),遠(yuǎn)離熒光顆粒的位置處的位移需要由插值方法求得,這在一定程度上也會(huì)損失精度。1.2亞像素搜索算法眾所周知,數(shù)字圖像相關(guān)方法主要通過一系列的圖像互相關(guān)運(yùn)算,來獲得變形后的圖像相對(duì)于變形前圖像的位移(以及應(yīng)變)場(chǎng)。具體來說,在參考圖中選取適當(dāng)?shù)?矩形)子區(qū)域A,然后在變形圖中的對(duì)應(yīng)區(qū)域附近搜索該子區(qū)域,計(jì)算它們的互相關(guān)系數(shù),則相關(guān)系數(shù)的峰值所在的位置就代表變形前A區(qū)域當(dāng)前最可能的位置,通過采用亞像素搜索算法,該方法得到的位移場(chǎng)能夠精確到亞像素水平。數(shù)字圖像相關(guān)技術(shù)最早應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)固體力學(xué)領(lǐng)域,現(xiàn)已在材料力學(xué)行為測(cè)試、微尺度變形測(cè)量等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[66,67,68,69,70,71]。目前,基于數(shù)字圖像相關(guān)技術(shù)的位移(以及應(yīng)變)提取算法已經(jīng)開始應(yīng)用于求解細(xì)胞基底圖像變形場(chǎng)。根據(jù)基底表面熒光粒子分布的特征(包括粒子的分布密度、局部粒子分布差異性特征),這種方法能夠比較準(zhǔn)確高效地計(jì)算出基底圖像的全場(chǎng)位移和應(yīng)變信息。2反欺凌法的方法2.1基于boussi現(xiàn)行積分核的細(xì)胞牽引場(chǎng)一般細(xì)胞的直徑大約10～40μm,而近似橢圓形的粘著斑長(zhǎng)軸大約2～5μm,短軸大約1～2μm,基底的最大變形一般不超過3μm,而(聚丙烯酰胺)彈性基底厚度一般都至少是60～70μm,理論分析表明對(duì)于細(xì)胞與彈性基底相互作用而言,這種厚度的基底可以采用基于半空間無窮厚度假設(shè)的Boussinesq基本解來分析處理。若把每一個(gè)孤立的基底粘附位置所承擔(dān)的細(xì)胞骨架收縮力看成一個(gè)集中力F(r),且這些集中力都切向作用于基底表面,用u(r)表示由此引起的彈性基底表面位移,則細(xì)胞牽引力F(r)和基底表面位移u(r)之間滿足下面的第一類Fredholm積分方程:ui(r)=∫Gij(r-r′)Fj(r′)dr′(1)其中,r=(x,y)T=(x1,x2)T代表位置向量,積分號(hào)內(nèi)重復(fù)出現(xiàn)的下標(biāo)(亞指標(biāo))項(xiàng)代表求和運(yùn)算;Gij是基于Boussinesq基本解的格林函數(shù)(積分核),可表示為如下形式:Gij(d)=1+νπEd[δij(1-ν)+(xi-x′i)(xj-x′j)d2ν](2)其中,d=|r-r′|代表相對(duì)位置向量;E和ν分別代表各向同性的聚丙烯酰胺彈性基底的彈性模量和泊松比;δij是Kronecker符號(hào)(即當(dāng)i=j時(shí),δij=1;否則δij=0),1≤i,j≤2?？紤]到各向同性的聚丙烯酰胺彈性基底的近乎不可壓縮特性,一般可將其泊松比設(shè)為ν=0.5,這樣,積分核Gij也可以進(jìn)一步簡(jiǎn)化為:Gij(d)=34πEd[δij+(xi-x′i)(xj-x′j)d2](3)對(duì)于實(shí)際的細(xì)胞牽引力數(shù)值計(jì)算,通常將(1)式表示的連續(xù)方程進(jìn)行離散化處理,即:u=GF(4)其中,細(xì)胞牽引力場(chǎng)為F=(F1(r′1)F2(r′1)F1(r′2)F2(r′2)…F1(r′N)F2(r′N))T,基底表面位移場(chǎng)為u=(u1(r1)u2(r1)u2(r2)u2(r2)…u1(rN)u2(rN))T,而基于Boussinesq基本解的離散格林函數(shù)(積分核)矩陣可以寫作:G=(G11(r1-r′1)G12(r1-r′1)G11(r1-r′2)G12(r1-r′2)?G21(r1-r′1)G22(r1-r′1)G21(r1-r′2)G22(r1-r′2)?G11(r2-r′1)G12(r2-r′1)G11(r2-r′2)G12(r2-r′2)?G21(r2-r′1)G22(r2-r′1)G21(r2-r′2)G22(r2-r′2)??????](5)注意,由于位移采樣點(diǎn)的個(gè)數(shù)不一定與牽引力采樣點(diǎn)的個(gè)數(shù)相等,因此上述矩陣G不一定為方陣。原則上,我們就可以利用(4)式根據(jù)測(cè)量得到的基底位移場(chǎng)求解出細(xì)胞牽引力場(chǎng),但事實(shí)遠(yuǎn)非如此。正如前面所述,由基底位移場(chǎng)求解細(xì)胞牽引力場(chǎng)的過程涉及具有奇異積分核(即Gij(d=0)=∞)的第一類Fredholm積分方程,屬于高度病態(tài)的反問題范疇。積分核Gij在(1)式等號(hào)右端的積分過程中通常起著光滑的作用,這種光滑作用的結(jié)果實(shí)際上常常丟失信息,而逆運(yùn)算(即由測(cè)量得到的位移場(chǎng)求解細(xì)胞牽引力場(chǎng))卻很難直接還原這些丟失的信息,這將導(dǎo)致細(xì)胞牽引力場(chǎng)的求解計(jì)算結(jié)果極其不穩(wěn)定。在通過公式(1)和(4)直接反求細(xì)胞牽引力場(chǎng)過程中,輸入位移數(shù)據(jù)的微小波動(dòng)或誤差都極有可能引起反演結(jié)果的巨大波動(dòng)。為了盡可能準(zhǔn)確地重建細(xì)胞牽引力場(chǎng),必須根據(jù)當(dāng)前問題的特點(diǎn),尋找一些先驗(yàn)的知識(shí)來最大限度地恢復(fù)丟失的信息,從而獲得比較可靠的反演結(jié)果。2.2dw方法的模型一般來說,處理病態(tài)反問題的通常辦法是采用所謂的正則化(也稱規(guī)整化,Regularization)。正則化的目的就是修改一個(gè)病態(tài)問題成為一個(gè)良態(tài)問題,使得問題的解在物理上是合理的,并且連續(xù)地依賴于數(shù)據(jù)。當(dāng)然,對(duì)問題的任何一種修改都必須是合理的,必須符合人們對(duì)于問題的解的先驗(yàn)知識(shí)。事實(shí)上,所謂正則化,其基本思想就是利用關(guān)于解的先驗(yàn)知識(shí),構(gòu)造附加約束或改變求解策略,使得反問題的解變得確定和穩(wěn)定。由于物理問題的多樣性以及人們對(duì)于先驗(yàn)知識(shí)的了解和利用方面的差異,不同的問題和不同的研究者往往會(huì)構(gòu)建不同的反演方法。對(duì)于細(xì)胞牽引力反演而言,目前主要存在如下幾種方法:(1)DW方法。DW方法是由Dembo和Wang在1999年首先提出的,有的文獻(xiàn)中也稱此方法為邊界元法(BoundaryElementMethod,BEM)。DW方法出現(xiàn)早期,這一方法把細(xì)胞與彈性基底接觸區(qū)域劃分為網(wǎng)格,假設(shè)細(xì)胞牽引力以集中力的形式分別作用在這些網(wǎng)格的節(jié)點(diǎn)上,然后通過位移場(chǎng)來反演相應(yīng)的細(xì)胞牽引力場(chǎng)。由于位移采樣點(diǎn)的總數(shù)(這里用m表示)一般多于網(wǎng)格節(jié)點(diǎn)上的細(xì)胞牽引力采樣點(diǎn)的總數(shù)(這里用n表示),因此,表征牽引力與基底位移場(chǎng)之間關(guān)系的離散格林函數(shù)系數(shù)矩陣為非方陣,這使得直接通過系數(shù)矩陣求逆的方法求得細(xì)胞牽引力場(chǎng)的思路變得行不通。另一方面,由于基于集中力假設(shè)的Boussinesq解生成的格林函數(shù)具有奇異性,這樣得到的DW方程是具有弱奇異核的第一類Fredholm積分方程,這類方程一般來說是高度病態(tài)的。針對(duì)這些問題,Dembo和Wang采用著名的Tikhonov正則化方法(TikhonovRegularization)[39,40,41,48,49,50]來提高細(xì)胞牽引力反演結(jié)果的穩(wěn)定可靠性。此時(shí),正則化參數(shù)λ可基于使下面的表達(dá)式達(dá)到最小值來確定:χ2+λΙ2(6)其中χ2代表χ2統(tǒng)計(jì),即:χ2=m∑i=1(di-n∑j=1G(rij)Fj)2σ2i(7)上式中,di代表聚丙烯酰胺彈性基底表面第i個(gè)熒光粒子的位移測(cè)量值大小;σi代表di的誤差;G(rij)是基于集中力假設(shè)的Boussinesq解的離散格林函數(shù)矩陣;Fj代表第j個(gè)網(wǎng)格節(jié)點(diǎn)上的細(xì)胞牽引力分量。I2是與網(wǎng)格劃分有關(guān)的約束項(xiàng),其具體取值比較復(fù)雜,有興趣的讀者可以參考文獻(xiàn)。DW方法試圖通過先驗(yàn)的信息來提高反演結(jié)果的可靠性,但操作過程十分復(fù)雜,不利于數(shù)據(jù)的實(shí)時(shí)處理;由于只假設(shè)細(xì)胞牽引力僅在網(wǎng)格的節(jié)點(diǎn)上存在,不同的網(wǎng)格劃分將直接導(dǎo)致這些細(xì)胞牽引力作用點(diǎn)位置發(fā)生變化,這說明DW方法具有一定的“主觀性”,細(xì)胞牽引力反演結(jié)果將因此受到影響。另外,DW方法在確定約束項(xiàng)I2時(shí)假設(shè)細(xì)胞牽引力場(chǎng)分布是光滑的,這與實(shí)際情況也有較大差別。(2)TRPF方法。TRPF(Tractionreconstructionwithpointforces)方法(基于集中力假設(shè)的細(xì)胞牽引力反演方法)是Schwarz等人在2002年首先提出的。該方法假設(shè)在細(xì)胞與基底的每個(gè)粘附位置(粘著斑)上受到集中力的作用,由于在集中力作用點(diǎn)處經(jīng)典Boussinesq解呈現(xiàn)奇異性,因此,這種方法要求位移采樣點(diǎn)與集中力的作用點(diǎn)位移必須分開一段距離,TRPF方法中的格林函數(shù)矩陣一般具有較大的條件數(shù),集中力假設(shè)導(dǎo)致的牽引力反演病態(tài)問題較嚴(yán)重。為了提高反演結(jié)果的可靠性,TRPF方法采用零階Tikhonov正則化方法,即:minF{|GF-u|2+λ20|F|2}(8)上式中,G是基于集中力假設(shè)的Boussinesq解的離散格林函數(shù)矩陣;F和u分別代表細(xì)胞牽引力場(chǎng)和彈性基底表面位移場(chǎng);λ0是零階正則化參數(shù)。一般來說,此正則化參數(shù)的選取十分關(guān)鍵,否則得到的反演結(jié)果會(huì)很糟糕。TRPF方法采用L曲線法來確定λ0的取值,需要指出的是,L曲線法需要專門的曲線拐角識(shí)別算法(Corner-findingAlgorithm)來確定最優(yōu)的正則化參數(shù),這在一定程度上降低了TRPF方法的反演效率。另外,使用TRPF方法求解細(xì)胞牽引力場(chǎng)時(shí),一般將單個(gè)粘著斑位置處的牽引力作用點(diǎn)人為地選在其幾何中心處,因此,反演前必須事先準(zhǔn)確知道粘著斑分布的位置,否則由此帶來的誤差將會(huì)對(duì)細(xì)胞牽引力反演造成很大影響。(3)基于Boussinesq積分解的牽引力反演方法。細(xì)胞主要經(jīng)由粘著斑對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)(彈性基底)施加力。Balaban等人的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)表明,作用在粘著斑上的切向力大小與粘著斑的面積近似成正比,這一事實(shí)顯示單個(gè)粘著斑上所受的牽引力呈現(xiàn)均勻分布的特點(diǎn)。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果并考慮到以往基于集中力Boussinesq基本解對(duì)于細(xì)胞牽引力反演的一些弊端,本文作者提出了基于分布力的Boussinesq積分解來代替基于集中力的Boussinesq基本解進(jìn)行細(xì)胞牽引力反演計(jì)算。其基本思路是把細(xì)胞下面的彈性基底劃分為矩形網(wǎng)格(作為采樣?xùn)鸥?,并假設(shè)每個(gè)矩形網(wǎng)格上的細(xì)胞牽引力呈均勻分布,如圖3所示。設(shè)矩形網(wǎng)格單元的長(zhǎng)和寬分別為2l和2b,其上作用有切向均布牽引力,強(qiáng)度用p表示,局部坐標(biāo)原點(diǎn)O選擇在此矩形單元的幾何中心位置,則這個(gè)網(wǎng)格單元上均勻分布的牽引力引起彈性基底表面上任意一點(diǎn)(x,y)位置處的彈性變形可以表示為如下的積分形式(即把經(jīng)典的Boussinesq基本解在此矩形區(qū)域上進(jìn)行積分):{u(x,y)=∫b-b∫l-lp(1+ν)2πER{1+(x-ξ)2R2+(1-2ν)[RR+z-(x-ξ)2(R+z)2]}dξdηv(x,y)=∫b-b∫l-lp(1+ν)(x-ξ)(y-η)2πER[1R2-1-2ν(R+z)2]dξdη(9)經(jīng)過一系列較復(fù)雜繁瑣的數(shù)學(xué)積分運(yùn)算,可以得到如下的解析表達(dá)式:u(x,y)=p(1+ν)2πE(2×((b-y)×log((l-x)+R1(-l-x)+R3)-(-b-y)×log((l-x)+R2(-l-x)+R4))+(l-x)×log((b-y)+R1(-b-y)+R2)-(-l-x)×log((b-y)+R3(-b-y)+R4)+(1-2ν)×((l-x)×log((b-y)+R1(-b-y)+R2)-(-l-x)×log((b-y)+R3(-b-y)+R4)))(10)v(x,y)=pν(1+ν)πE(-R1+R2+R3-R4)(11)其中,R1=√(l-x)2+(b-y)2,R2=√(l-x)2+(b+y)2?R3=√(l+x)2+(b-y)2,R4=√(l+x)2+(b+y)2。應(yīng)該指出,上述基于矩形分布力的Boussinesq積分解消除了經(jīng)典Boussinesq基本解在集中力作用點(diǎn)位置處的奇異性。為了構(gòu)建新的離散格林函數(shù)矩陣,我們?cè)O(shè)牽引力為單位強(qiáng)度(p=1),基底泊松比ν=0.5(聚丙烯酰胺基底),這樣,以上兩式可進(jìn)一步化簡(jiǎn)為:?u(x,y)=34πE(2×((b-y)×log((l-x)+R1(-l-x)+R3)-(-b-y)×log((l-x)+R2(-l-x)+R4))+(l-x)×log((b-y)+R1(-b-y)+R2)-(-l-x)×log((b-y)+R3(-b-y)+R4))(12)?v(x,y)=34πE(-R1+R2+R3-R4)(13)由此,可以得到新的基于矩形分布力Boussinesq積分解的離散格林函數(shù)矩陣:[gij]=[g11g12g21g22]=[?u(x,y)-?v(y,-x)?v(x,y)?u(y,-x)](14)這樣,細(xì)胞牽引力場(chǎng)和基底表面位移場(chǎng)之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系可重新數(shù)值離散為如下形式:u=gΤ(15)其中,位移場(chǎng)為u=(u1(r1)u2(r1)u1(r2)u2(r2)?u1(rΝ)u2(rΝ))Τ,切向的細(xì)胞牽引力場(chǎng)為Τ=(Τ1(r′1)Τ2(r′1)Τ1(r′2)Τ2(r′2)?Τ1(r′Ν)Τ2(r′Ν))Τ?Ν代表采樣點(diǎn)總數(shù),而此時(shí)系數(shù)矩陣為(2N×2N)階方陣,即:g=(g11(r1-r′1)g12(r1-r′1)g11(r1-r′2)g12(r1-r′2)?g21(r1-r′1)g22(r1-r′1)g21(r1-r′2)g22(r1-r′2)?g11(r2-r′1)g12(r2-r′1)g11(r2-r′2)g12(r2-r′2)?g21(r2-r′1)g22(r2-r′1)g21(r2-r′2)g22(r2-r′2)??????]2Ν×2Ν(16)最后,基于矩形分布力Boussinesq積分解的細(xì)胞牽引力場(chǎng)可以通過下式求解:Τ=g-1u(17)對(duì)于這種基于矩形分布力Boussinesq積分解的細(xì)胞牽引力反演算法而言,采樣網(wǎng)格單元的實(shí)際尺寸一般可以達(dá)到(1～2μm)×(1～2μm),這與粘著斑的短軸尺寸(1～2μm)大致相當(dāng)。此時(shí),離散格林函數(shù)矩陣g的2范數(shù)下的條件數(shù)一般不會(huì)超過102量級(jí),反演過程中位移噪聲的放大效應(yīng)會(huì)被顯著抑制,牽引力的計(jì)算結(jié)果比較穩(wěn)定可靠。在這種情況下,可以不必進(jìn)行復(fù)雜的正則化處理,反演計(jì)算得以大大簡(jiǎn)化,這對(duì)于發(fā)展具有實(shí)時(shí)處理功能的高效牽引力顯微分析系統(tǒng)是至關(guān)重要的。然而需要說明的是,當(dāng)矩形采樣單元尺寸進(jìn)一步減小時(shí),此問題所涉及到的病態(tài)效應(yīng)將開始顯現(xiàn),此方法對(duì)噪聲的抑制能力開始減弱,反演的可靠性將會(huì)降低。因此,運(yùn)用如上所述反演方法時(shí),我們推薦使用的采樣單元實(shí)際尺寸為(1～2μm)×(1～2μm)。(4)FTTC方法。FTTC是Fouriertransformtractioncytometry的英文縮寫(基于傅立葉變換的細(xì)胞牽引力反演方法),這一細(xì)胞牽引力反演方法是由Butler等人在2002年首先提出的。他們當(dāng)時(shí)注意到表征細(xì)胞牽引力與基底表面位移之間關(guān)系的第一類Fredholm積分方程(即公式(1))可等效地寫作如下的卷積形式:→u(r)=G(r)?→Τ(r)(18)其中位移向量用u→(r)=(ux(r),uy(r))Τ表示,而相應(yīng)的牽引力向量用Τ→(r)=(Τx(r),Τy(r))Τ表示(注:在(1)式中牽引力(集中力)用符號(hào)F(r)代表,而(15)和(18)式中的牽引力(分布力)用符號(hào)T(r)代表);G(r)是基于集中力Boussinesq基本解的格林函數(shù)(積分核),其分量形式如公式(2)和(3)所示。對(duì)(18)式兩端作二維傅里葉變換并運(yùn)用卷積定理可知:u→?(k→)=G?(k→)Τ→?(k→)(19)上式兩邊左乘G?-1,然后在進(jìn)行傅里葉逆變換,則有:Τ→(r)=FΤ2-1(G?(k→)-1u→?(k→)(20)G(k→)=G(kx,ky)=A2πk3[(1-ν)k2+νky2-νkxky-νkxky(1-ν)k2+νkx2](21)其中,A=(1+ν)πE?k=|k→|=kx2+ky2。另外,由于波向量的零點(diǎn)(kx,ky)=(0,0)對(duì)應(yīng)于空間域中的剛體位移部分,與基底的彈性變形(位移場(chǎng))無關(guān),因此FTTC方法通常不計(jì)算這一波數(shù)處的細(xì)胞牽引力分量,即直接令Τ→(0)=0。FTTC方法把細(xì)胞牽引力反演變換到Fourier空間來實(shí)現(xiàn),這樣,通過對(duì)不同波數(shù)位置處的位移分量與相應(yīng)的系數(shù)矩陣直接相乘,就可獲得這一波數(shù)處的牽引力分量。由于在傅立葉空間中力與位移不存在耦合關(guān)系,因此,FTTC方法將極大地節(jié)省數(shù)據(jù)存儲(chǔ)空間。另一方面,FTTC方法可利用成熟的快速傅立葉變換(FFT)技術(shù)來提高求解計(jì)算速度,易于進(jìn)行高效牽引力反演運(yùn)算。與此同時(shí),也應(yīng)該指出,在上述FTTC方法中,由于輸入的位移場(chǎng)不具有嚴(yán)格的周期性,往往在牽引力場(chǎng)的邊界會(huì)產(chǎn)生頻率混疊效應(yīng),但這些僅在圖像視場(chǎng)邊界處出現(xiàn),一般不會(huì)影響細(xì)胞位置處的粘附力反演效果(因?yàn)橥ǔ＜?xì)胞總是在遠(yuǎn)離圖像邊界的中心位置)。FTTC方法通過傅立葉變換的方式有效地避免了基于集中力的Boussinesq基本解的奇異性問題,但是,在解卷積過程中依然存在病態(tài)的問題,嚴(yán)格的理論和數(shù)值分析表明,較稀疏采樣網(wǎng)格的情況下(例如20～30個(gè)像素),即其對(duì)應(yīng)的奈奎斯特采樣頻率與位移場(chǎng)的頻譜大致相當(dāng)時(shí),FTTC方法不會(huì)表現(xiàn)出反演病態(tài)現(xiàn)象,具有較好的穩(wěn)定性。但是當(dāng)采用網(wǎng)格進(jìn)一步增加時(shí),FTTC方法會(huì)出嚴(yán)重的病態(tài),對(duì)高頻噪聲異常敏感,牽引力反演結(jié)果極不可靠。(5)基于二維傅里葉空間最優(yōu)濾波的牽引力反演方法。上述經(jīng)典FTTC方法首次實(shí)現(xiàn)了在傅立葉空間求解細(xì)胞牽引力場(chǎng),但這一方法的一個(gè)致命弱點(diǎn)在于沒有充分考慮到反卷積的病態(tài)問題,因此,它用于細(xì)胞牽引力反演存在很大風(fēng)險(xiǎn),特別是在位移場(chǎng)信噪比比較低的情況下,其反演獲得的牽引力場(chǎng)往往被噪聲嚴(yán)重“污染”,反演精度顯著降低,甚至得不到可靠的牽引力反演結(jié)果。為此,本文作者基于經(jīng)典FTTC方法,發(fā)展了一整套基于二維傅立葉空間最優(yōu)濾波的細(xì)胞牽引力反演方法?？紤]到測(cè)量得到的位移場(chǎng)含有噪聲,即:u^→(x,y)=u→(x,y)+n→(x,y)(22)或?qū)懽鞣至啃问?[u^x(x,y)u^y(x,y)]=[ux(x,y)uy(x,y)]+[nx(x,y)ny(x,y)](23)其中,u^→(x,y)=[u^x(x,y)u^y(x,y))]Τ代表測(cè)量得到的含噪聲位移場(chǎng)(例如通過DIC方法得到的彈性基底表面位移場(chǎng));u→(x,y)=[ux(x,y)uy(x,y)]Τ表示無噪聲的真實(shí)位移場(chǎng);n^→(x,y)=[nx(x,y)ny(x,y)]Τ代表加性白噪聲。對(duì)(22)式進(jìn)行二維傅立葉變換,則有:u^→(kx,ky)=u→(kx,ky)+n→(kx,ky)(24)其分量形式可以等效地表示為:[u^x(kx,ky)u^y(kx,ky)]=[ux(kx,ky)uy(kx,ky)]+[nx(kx,ky)ny(kx,ky)](25)另一方面,在經(jīng)典的FTTC方法中,由于沒有考慮位移場(chǎng)噪聲的影響,所以根據(jù)(20)式可知:Τ→(k→)=G?(k→)-1u→(k→)(26)即在沒有噪聲(或不考慮噪聲)的情況下,其分量形式可以表示為:{Τx(k→)=R11(k→)ux(k→)+R12(k→)uy(k→)Τy(k→)=R21(k→)ux(k→)+R22(k→)uy(k→)(27)注,在上式中我們已經(jīng)事先設(shè)R(k→)=G?(k→)-1,即:[R11(kx,ky)R12(kx,ky)R21(kx,ky)R22(kx,ky)]2×2=(A2πk3[(1-ν)k2+νky2-νkxky-νkxky(1-ν)k2+νkx2])-1(28)對(duì)于實(shí)際含有噪聲的位移場(chǎng)(即(24)式),可以通過類比(27)式,構(gòu)造出帶有最優(yōu)(Wiener)濾波參數(shù)的細(xì)胞牽引力表達(dá)式,即:{Τ^x(k→)=R11(k→)u^x(k→)Φxx(k→)+R12(k→)u^y(k→)Φxy(k→)Τ^y(k→)=R21(k→)u^x(k→)Φyx(k→)+R22(k→)u^y(k→)Φyy(k→)(29)其中,Φxx(k→),Φxy(k→),Φyx(k→),Φyy(k→)分別為實(shí)最優(yōu)濾波參數(shù)。接下來,我們期望選取適當(dāng)?shù)纳鲜鰹V波參數(shù),使求得的牽引力Τ→^(如公式(29)所示)在最小均方差意義下盡可能地接近真實(shí)細(xì)胞牽引力場(chǎng)Τ→(盡管如公式(27)所示的真實(shí)牽引力場(chǎng)Τ→總是未知的),即要求下面的表達(dá)式取得最小值:∫-∞+∞|Τ→^(r→)-Τ→(r→)|2dr→=∫-∞+∞∫-∞+∞|Τ→^(x,y)-Τ→(x,y)|2dxdy=∫-∞+∞∫-∞+∞|Τ