第四章分DNA長(zhǎng)度多態(tài)性2

PCR技術(shù)及在法醫(yī)物證中的應(yīng)用

概念：是一種體外快速擴(kuò)增特異DNA片段的技術(shù)。

過程：利用人工合成的一對(duì)寡核苷酸引物，分別與待擴(kuò)增DNA片段的兩翼序列互補(bǔ)，在DNA聚合酶催化下，以靶DNA序列為模板，以四種dNTP為原料，經(jīng)高溫變性、低溫退火、中溫延伸“三步曲”的循環(huán)，使靶DNA片段經(jīng)過約30個(gè)循環(huán)周期后達(dá)到百萬倍的擴(kuò)增。

PCR技術(shù)DNA復(fù)制原理DNA雙鏈單鏈變性（加熱95℃

）復(fù)性（緩慢冷卻55℃

）DNA分子的熱變性原理：變性的目的：復(fù)性的目的：解開雙鏈有利于引物Ⅰ和引物Ⅱ與兩條單鏈的結(jié)合

PCR的反應(yīng)過程1、PCR的反應(yīng)步驟PCR一般經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為三個(gè)基本步驟──變性、復(fù)性和延伸①變性（模板DNA解旋）

模板DNA經(jīng)加熱至900C以上。一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使成為單鏈，以便于它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備.2、循環(huán)過程靶序列靶序列PCR循環(huán)第一步：加熱變性②復(fù)性（退火）

模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降到550C左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’PCR循環(huán)第二步：引物與靶序列退火③延伸

DNA模板－引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脫氧核苷酸為原料，以母鏈為模板，按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則與半保留復(fù)制的原理，合成一條新的DNA鏈.靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNA聚合酶PCR循環(huán)第三步：引物延伸靶序列靶序列第1個(gè)PCR循環(huán)完成后：得到兩個(gè)拷貝的靶序列（二）、PCR的反應(yīng)過程每個(gè)循環(huán)包括：變性——復(fù)性——延伸

從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也可以作為模板參與反應(yīng)，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈會(huì)與引物Ⅱ結(jié)合，進(jìn)行DNA的延伸，這樣，DNA聚合酶只能特異性地復(fù)制處于兩個(gè)引物之間的DNA序列，使這段固定長(zhǎng)度的序列呈指數(shù)擴(kuò)增。PCR整個(gè)過程循環(huán)次數(shù)DNA數(shù)量122438201,048,576301,073,741,82430次循環(huán)后靶序列擴(kuò)增的數(shù)量PCR反應(yīng)體系成分優(yōu)化濃度10×緩沖液（Tris-HCL,PH8.3)10～15mmol/L4種dNTP混合物200umol/L一對(duì)引物0.1～2umol/L模板DNA0.1～10ng人類基因組TaqDNA聚合酶0.5～2UMg2＋1.5～2mmol/LKCL50mmol/L模板每份樣本的DNA量必須調(diào)整到適合擴(kuò)增反應(yīng)的濃度。大部分商業(yè)STR分型試劑盒最佳DNA濃度是1ng左右。1ng人類基因組DNA相當(dāng)于一個(gè)基因組的333拷貝，一個(gè)二倍體的DNA細(xì)胞約含人類基因組DNA6pg.在VNTR分型中需要20～100ng人類基因組DNA.在STR分型中需要1～10ng人類基因組DNA.

耐熱DNA聚合酶在PCR反應(yīng)中起著關(guān)鍵的作用。是從一種嗜熱細(xì)菌分離出來的DNA聚合酶。酶活性在1000C條件下，能保持幾個(gè)小時(shí)。而其最適溫度在720C左右（決定了PCR延伸溫度）。

PCR擴(kuò)增的前提是：根據(jù)已知基因座(或DNA片段)雙鏈的序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物。引物是決定PCR特異性的關(guān)鍵因素。限定PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度和特異性。引物是短DNA序列，位于復(fù)制區(qū)域之前或側(cè)翼，作用是識(shí)別或標(biāo)定模板DNA的復(fù)制區(qū)域。

引物的設(shè)計(jì)原則：1引物長(zhǎng)度以18～30個(gè)堿基為宜，引物過長(zhǎng)會(huì)影響與模板的退火效率。2(G＋C)含量最好保持在約40%～60%，(G＋C)含量越高退火溫度越高，退火溫度過高過低都不利于PCR的反應(yīng)。3兩個(gè)引物之間不應(yīng)發(fā)生互補(bǔ)。引物Tm55～72度，PCR的退火溫度：引物Tm-5°5四種堿基應(yīng)隨機(jī)分布，避免嘌呤、嘧啶大量堆積。

Mg2＋的作用:TaqDNA聚合酶的活性依賴于反應(yīng)體系中Mg2＋，Mg2＋濃度過高，非特異性擴(kuò)增增多，Mg2＋濃度過低，酶活性顯著降低。此外，Mg2＋濃度影響退火溫度、模板與PCR產(chǎn)物的解鏈溫度，從而影響反應(yīng)速度。KCL：利于引物退火。4種dNTP：4種dNTP在反應(yīng)體系中濃度相等。dNTP濃度過高，提高堿基的錯(cuò)配率；過低，減低反應(yīng)速度。所以，優(yōu)化反應(yīng)參數(shù)對(duì)PCR反應(yīng)結(jié)果至關(guān)重要。理想的PCR反應(yīng)檢驗(yàn)PCR擴(kuò)增效果的指標(biāo)是特異性，有效性、忠實(shí)性。特異性指PCR產(chǎn)物只有預(yù)期的靶序列。有效性指經(jīng)較少的循環(huán)產(chǎn)生更多的產(chǎn)物。忠實(shí)性指PCR反應(yīng)的精確性，其產(chǎn)物沒有由TaqDNA聚合酶誘導(dǎo)發(fā)生堿基錯(cuò)配。理想的PCR反應(yīng)體現(xiàn)高特異性、高效、忠實(shí)性。電泳

電泳是指溶液中的樣品（DNA混合物或PCR產(chǎn)物）,在電場(chǎng)影響下可對(duì)多個(gè)DNA片段進(jìn)行分離的過程。

不同瓊脂糖凝膠濃度與分離DNA大小范圍的關(guān)系瓊脂糖凝膠濃度(%)線性DNA分子的有效分離范圍(kb)0.35—600.61—200.70.8—100.90.5—71.20.4—61.50.2—42.00.1—3

聚丙烯酰胺凝膠濃度與分離DNA大小范圍的關(guān)系

聚丙烯酰胺凝膠濃度(%)線性DNA分子的有效分離范圍(bp)3.51000-20005.080-5008.060-40012.040-20015.025-15020.06-100原理：DNA分子和銀離子形成穩(wěn)定的復(fù)合物，然后還原劑甲醛還原銀顆粒，可以把DNA條帶染成黑褐色。主要用于聚丙烯酰胺凝膠電泳，比溴乙錠靈敏200倍。

硝酸銀染色PCR產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳

1靈敏度高是用于微量檢材2特異性高3適用于降解檢材4種屬特異性好，根據(jù)人類的基因座設(shè)計(jì)的引物。5易于操作，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化PCR技術(shù)的特點(diǎn)由于單個(gè)STR提供的信息有限，難以滿足法醫(yī)學(xué)鑒定之要求，所以多個(gè)STR聯(lián)合應(yīng)用，這樣可以提高個(gè)體識(shí)別率，降低偶合概率。隨著技術(shù)改進(jìn)和成熟，復(fù)合擴(kuò)增技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。采用復(fù)合擴(kuò)增結(jié)合銀染法和復(fù)合擴(kuò)增結(jié)合自動(dòng)化熒光檢測(cè)技術(shù)，提高了準(zhǔn)確率，降低了工作強(qiáng)度。但由于熒光復(fù)合擴(kuò)增技術(shù)一次檢測(cè)可達(dá)到個(gè)人同一認(rèn)定、親權(quán)鑒定，避免因電泳過程中帶的漂移及檢測(cè)過程中膠的改變而造成的片段對(duì)比困難和錯(cuò)誤，現(xiàn)在成為主要的檢測(cè)方法，復(fù)合PCR用多對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增多條DNA片段的方法稱為復(fù)合PCR（MultiplexPCR）。在復(fù)合PCR中，選用基因座的引物Tm值應(yīng)相近。如果兩對(duì)引物Tm值差異超過±10℃，會(huì)使擴(kuò)增產(chǎn)物的量明顯不同，大片段擴(kuò)增產(chǎn)物或目的DNA很難觀察到。另外，靶DNA的長(zhǎng)度也應(yīng)相近，差別大時(shí)短片的靶DNA會(huì)優(yōu)先擴(kuò)增，因此，會(huì)產(chǎn)生不同產(chǎn)量的擴(kuò)增產(chǎn)物。用銀染法檢測(cè)STR的復(fù)合擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，要求不同STR基因座之間的等位基因在電泳圖譜中不能有重疊，而且同一擴(kuò)增體系中基因座不一般不超過5個(gè)。多對(duì)引物之間不形成二聚體、Tm值較相近。

銀染復(fù)合擴(kuò)增熒光標(biāo)記復(fù)合檢測(cè)系統(tǒng)通過對(duì)復(fù)合擴(kuò)增的STR基因座引物有計(jì)劃地分別標(biāo)記不同的熒光染料，結(jié)合激光激發(fā)檢測(cè)技術(shù)，可有效識(shí)別長(zhǎng)度重疊而標(biāo)記熒光染料不同的擴(kuò)增產(chǎn)物。16個(gè)STR基因座的分型體系

基因座熒光素標(biāo)記物基因座熒光素標(biāo)記物基因座熒光素標(biāo)記物基因座熒光素標(biāo)記物D8S11796-FAMD3S1358

VICD19S433NEDAme