奶牛體內(nèi)金屬硫蛋白的富集與分布

奶牛體內(nèi)金屬硫蛋白的富集與分布

金屬硫蛋白（mt）廣泛存在于各種動(dòng)物組織和器官中，其功能結(jié)合了蛋白質(zhì)和天然生物活性物質(zhì)。它具有重要的生物學(xué)和生物學(xué)功能。在機(jī)體微量元素代謝平衡、重金屬解毒、清除自由基、抗應(yīng)激、抗輻射、增強(qiáng)免疫力和延緩生殖衰老等方面均具有重要作用,因而受到了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛重視,并取得了一些令人囑目的成果,為MT的研究和應(yīng)用展示了廣闊的前景。但MT在畜禽體內(nèi)代謝規(guī)律的研究卻鮮見報(bào)道。而開展MT在畜禽體內(nèi)代謝規(guī)律研究,對(duì)全面認(rèn)識(shí)和充分發(fā)揮MT各種生物學(xué)功能,促進(jìn)動(dòng)物健康,提高畜禽生產(chǎn)性能及產(chǎn)品質(zhì)量,保證人類健康和環(huán)境安全均具有重要意義,顯得十分重要和緊迫。研究MT在奶牛公犢體內(nèi)的吸收速率、代謝過程、排泄途徑以及在各組織器官中的存留分布規(guī)律,以期為MT的深入研究及其在提高家畜生產(chǎn)力以及生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)安全畜產(chǎn)品中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1牛奶公身份肝臟鋅金屬硫蛋白的純化金屬硫蛋白系本實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)合成、分離和純化的奶牛公犢肝臟鋅金屬硫蛋白(Zn-MT)。Na125I來自中國原子能研究院(100mCi)。1.1.2蛋白混合成分配比的確定參照本實(shí)驗(yàn)室的方法制備:取N-琥珀酰胺-3-(2-吡啶-二硫)-丙酸酯的苯溶液2mL(100mg/L),加入Iodogen100μg,氮?dú)獯蹈?加水0.5mL,加125I溶液35mCi,反應(yīng)5min,加入5%的偏重亞硫酸鈉溶液0.2mL終止反應(yīng),用氯仿萃取反應(yīng)物4次,每次1mL,合并氯仿相,氮?dú)獯蹈?加入1mL的MT溶液(蛋白含量為15g/L),于4℃冰箱中反應(yīng)6h,用LH-20分離(層析柱:1cm×20cm),分部收集。經(jīng)測定后收集蛋白部分流出液。標(biāo)記物放化純度:98%;標(biāo)記率:75%;標(biāo)記物放射性比度:1.7mCi/mg。制作成膠囊,125I每粒1mCi,125I標(biāo)記MT(125I-MT)每4粒1mCi。1.2方法1.2.1血樣、尿樣的采集選用健康的中國黑白花奶牛初生公犢12頭(平均體重40kg左右),隨機(jī)分成對(duì)照組和試驗(yàn)組,每組6頭。試驗(yàn)前預(yù)試4d,每日飼喂3次,每頭日喂7.5kg牛奶。第5天進(jìn)入正式試驗(yàn)期。對(duì)照組每頭灌喂Na125I1mCi,試驗(yàn)組每頭灌喂125I-MT1mCi。分別在灌喂后第1,2,3,5,7,9,11,12,14,16,18,24和48h逐頭經(jīng)頸靜脈采取血樣5mL;在灌喂后第1,3,5,7,9,13,17,21,25,29,33,37,41和45h按全收糞法收集糞、尿樣。在灌喂后48h屠宰取肝、肺、腎、心、脾、小腸、大腸、真胃、皮、肌肉、骨等組織和臟器樣,并且同時(shí)取各樣品平行樣5份進(jìn)行放射性γ計(jì)數(shù)。1.2.2mt在牛體內(nèi)的泄漏動(dòng)態(tài)和留置服務(wù)量取不同時(shí)間點(diǎn)采取的血液和尿樣各1mL、糞和組織器官樣各1g,用GC-300全自動(dòng)γ計(jì)數(shù)儀進(jìn)行放射性γ計(jì)數(shù),通過對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)血液、糞和尿樣中125I的測定推算出MT在牛體內(nèi)的排泄動(dòng)態(tài);并測定牛組織器官中MT的存留量。計(jì)算公式為:居里數(shù)(mCi)=放射性記數(shù)÷0.75÷(2.22×109)式中,0.75為標(biāo)記效率。MT量=居里數(shù)÷放射性活度比,并且用間接競爭性ELISA法對(duì)MT量進(jìn)行校驗(yàn)。1.3處理數(shù)據(jù)采用SAS(6.12)統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。2結(jié)果與分析2.1灌喂抗過血指標(biāo)在對(duì)照組和試驗(yàn)組牛只分別灌喂Na125I和125I-MT后48h內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)血液中放射性活度動(dòng)態(tài)變化見表1。碘在對(duì)照組牛體內(nèi)吸收較快,在灌喂125I后血液中放射性活度快速上升,灌喂后1h即達(dá)最大值(1.0428×10-2mCi),2h后逐漸下降,放射性碘在血液中半衰期為12.5h(表1)。試驗(yàn)組在灌喂125I-MT后,血液中放射性活度緩慢上升,在灌喂后11h達(dá)最大值(0.6235×10-2mCi),血液中清除半衰期為36.8h,然后緩慢下降。除灌喂后7,9,11,12和48h等時(shí)間段外,試驗(yàn)組牛只血液中放射性活度與對(duì)照組相比均差異顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01),具體表現(xiàn)為5h之前顯著低于對(duì)照組,14h之后顯著高于對(duì)照組。由此可見,MT在奶牛公犢體內(nèi)消化、吸收較緩慢。2.2牛糞中產(chǎn)品中放射性活度的變化對(duì)照組牛只灌喂后1h可以在糞中開始檢測到125I,以后糞中125I的濃度緩慢上升,29h達(dá)到峰值(0.7740×10-2mCi)(表2),隨后糞中125I的濃度快速下降,糞中的125I濃度較低,說明碘消化吸收較完全,并且糞中內(nèi)源性碘排出量不大。試驗(yàn)組在灌喂后3h才開始從糞中檢測到125I-MT,以后糞中125I-MT濃度逐漸升高,33h達(dá)最大值(6.4673×10-2mCi),125I-MT在糞中排出時(shí)間主要集中在29~37h這一時(shí)間段,37h后糞中濃度便快速下降,可見MT在牛體內(nèi)大量滯留時(shí)間為37h左右;并且,由MT在糞中排出的時(shí)間集中在灌喂后29~37h,可初步推斷牛糞中排出的MT主要是在腸道中未吸收完的MT,而并非內(nèi)源性MT。試驗(yàn)組牛糞中放射性活度除了在1和3h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)顯著低于對(duì)照組外,其余各時(shí)間段均顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)地高于對(duì)照組(表2),說明125I-MT從牛糞中排出量明顯大于125I。從總的情況看,對(duì)照組牛糞中125I的排出率(即排出量占灌喂總量的百分比)僅為3.0907%,而試驗(yàn)組牛糞中125I-MT的排出率為24.1776%,兩者差異極顯著(P<0.01)。說明MT在牛體內(nèi)消化吸收不完全,從糞中排出是牛MT排泄的重要途徑。2.3灌喂na125i前后尿中放射性活度的比較試驗(yàn)組在灌喂后1h便可在尿中檢測出125I-MT,隨后尿中125I-MT濃度逐漸升高,在灌喂后21h尿中放射性活度達(dá)最大值(6.1845×10-2mCi),此后迅速下降(表3)。對(duì)照組在灌喂Na125I后1h也可從尿中檢測出I,隨后尿中125I的濃度逐漸升高,在灌喂后13h尿中濃度達(dá)最大值(9.1583×10-2mCi),此后逐漸下降。就2組比較而言,試驗(yàn)組在處理全期各時(shí)間段(21h除外)尿中放射性活度均顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)地低于對(duì)照組;從各組尿中放射性總活度占灌喂總活度的百分比看,對(duì)照組尿中排出125I的量占灌喂總量的65.2413%,極顯著(P<0.01)地高于試驗(yàn)組尿中排出MT量占灌喂總量的百分比(31.7460%)。說明125I大部分從尿中排出;尿是牛MT排泄的主要途徑之一;這也進(jìn)一步說明MT在牛體內(nèi)消化吸收不完全。2.4mt在組織器官中的殘留情況對(duì)照組牛只組織器官中125I放射性活度和125I的存留率以及試驗(yàn)組牛只組織器官中125I-MT放射性活度、125I-MT的存留率和MT含量在多數(shù)組織器官間具有顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)的差異(表4和5)。125I在組織器官中的放射性活度由大到小依次為:肝>真胃>腎>肌肉>皮>小腸>大腸>肺>心>脾>骨;肌肉中125I的存留率(即存留量占灌喂總量的百分比)最高,達(dá)3.9793%,其余依次是肝臟、皮、小腸、骨、真胃、大腸、腎、肺、心和脾。試驗(yàn)組125I-MT在組織器官中放射性活度(表5)依次為:肝>脾>肌肉>皮>大腸>小腸>腎>肺>真胃>心>骨;125I-MT在各組織器官中的存留率大小依次為:肌肉、肝、皮、骨、小腸、大腸、真胃、肺、心、腎和脾;MT在各組織器官中的含量高低則依次為:心、肝、肺、脾、大腸、真胃、小腸、腎、皮、肌肉和骨。說明MT主要存留在肌肉、肝臟和皮中,其次富集在小腸、大腸、真胃和肝,MT在牛上述各組織器官中總的存留率為7.9854%;就MT在牛各組織器官中的含量而言,以心、肝、肺、脾等器官最高,大腸、真胃、小腸、腎等器官次之,皮、肌肉和骨等組織最低。3討論3.1腸道組織病理學(xué)檢測隨著近代生物科學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展,生物活性物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)、研究及其應(yīng)用備受關(guān)注。作為一種具有重要生理學(xué)和生物學(xué)功能的天然生物活性物質(zhì),MT在動(dòng)物體內(nèi)的吸收方式成為近年來研究的熱點(diǎn)。研究指出:MT能在小鼠真胃腸道內(nèi)被完整吸收,并且以完整的MT形式轉(zhuǎn)運(yùn)到體組織。李麗立等報(bào)道,放射性125I大部分在甲狀腺富集,小部分被蛋白絡(luò)合,而與蛋白結(jié)合碘不能被甲狀腺攝取。125I-MT在灌喂后的消化過程中沒有被分解出125I,仍以125I-MT結(jié)合形式在消化道內(nèi)被吸收,并被轉(zhuǎn)運(yùn)到體內(nèi)各組織器官。因而通過檢測125I的量能直接反應(yīng)出MT的量。這說明MT在動(dòng)物消化道內(nèi)吸收方式有別于其他蛋白,MT抗酸、抗堿、抗酶解以及分子量小等特性使其能夠在胃腸道內(nèi)被完整吸收,并沒有被分解成單個(gè)的氨基酸,也說明采用檢測125I的活度來確定MT的量是完全可行的,而且,用此方法還可以排除內(nèi)源性MT對(duì)研究結(jié)果的干擾。3.2mt的不同動(dòng)物和不同本研究表明,試驗(yàn)組牛只在灌喂125I-MT后,血液中放射性活度緩慢上升,在灌喂后11h達(dá)最大值(0.6235×10-2mCi),然后緩慢下降。試驗(yàn)組牛只血液中放射性活度與灌喂125I的對(duì)照組牛只血液中放射性活度相比,灌喂后的前5h顯著(P<0.05或P<0.01)低于對(duì)照組,14h之后顯著(P<0.05或P<0.01)高于對(duì)照組。由此可見,MT在奶牛公犢體內(nèi)消化、吸收較緩慢。MT在血液中具有一定的半衰期,不同動(dòng)物MT的半衰期不同。研究指出,綿羊MT的半衰期大約為22~24d,雞MT的半衰期為36h;小白鼠血液中MT清除半衰期為15.3h;杜長大三元雜交豬血液中MT清除半衰期為22.6h。本研究結(jié)果表明,經(jīng)灌喂后的MT在奶牛公犢血液中的清除半衰期為36.8h。盡管這方面的報(bào)道不多,但從僅有的研究資料仍然可以看出:MT在各種動(dòng)物體內(nèi)清除速率差異十分顯著。因此,在研究和應(yīng)用MT時(shí),應(yīng)充分考慮MT在各動(dòng)物體內(nèi)吸收特征、代謝動(dòng)態(tài)和清除速率,否則將難以達(dá)到預(yù)期效果甚至造成不必要的浪費(fèi)。3.3mt的排泄量MT在體內(nèi)的吸收、排泄涉及許多生理過程,其中包括體內(nèi)必需金屬元素的儲(chǔ)存、代謝和轉(zhuǎn)運(yùn),重金屬的解毒。本研究表明,奶牛公犢M(fèi)T主要從尿中排出,其次是從糞中排出。牛尿中排出MT量占灌喂總量的31.7460%,糞中的排泄量占總灌喂量的24.1776%;MT從奶牛公犢體內(nèi)排出時(shí)間相對(duì)集中于灌喂后29~37h,滯留時(shí)間較長(37h左右)。MT排泄規(guī)律表明,MT在牛體內(nèi)消化吸收不完全。由于MT消化率較低,并且在消化道內(nèi)滯留時(shí)間較長,飼糧中過量的礦物質(zhì)能夠在消化道內(nèi)與MT結(jié)合,從而可以減緩礦物質(zhì)的吸收速度,使采食后血液和組織器官內(nèi)礦物質(zhì)的含量不會(huì)驟然上升。當(dāng)機(jī)體組織缺乏某一礦物質(zhì)時(shí),MT能夠釋放出該礦物質(zhì)供機(jī)體需要。由此可見,MT在消化道內(nèi)能夠?qū)ΦV物質(zhì)起到緩釋作用,能夠促進(jìn)機(jī)體對(duì)礦物質(zhì)的充分利用,減少礦物質(zhì)的排泄量,從而可有效發(fā)揮節(jié)約飼料資源和防止生態(tài)環(huán)境污染的重要作用。3.4mt在不同組織器官中的殘留探明MT在機(jī)體各個(gè)組織器官中的存留和分布,將為MT的進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供重要依據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn),試驗(yàn)組牛只組織器官125I-MT的存留率以及MT含量在多數(shù)組織器官間具有顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)的差異。125I-MT在牛各組織器官中總存留量大小依次為:肌肉、肝、皮、骨、小腸、大腸、真胃、肺、心、腎和脾,說明MT主要存留在牛的肌肉、肝臟和皮中,這是因?yàn)榧∪夂推つw占牛胴體的比例大而肝臟中MT含量高的緣故。MT在各組織器官中的含量高低則依次為:心、肝、肺、脾、大腸、真胃、小腸、腎、皮、肌肉和骨,即MT含量在牛的心、肝、