腎衰瀉濁丸通過調(diào)控gf-

腎衰瀉濁丸通過調(diào)控gf-

慢性腎衰竭（crf）是各種慢性腎疾病發(fā)展的最終階段。腎間質(zhì)纖維是腎衰竭發(fā)展到最終階段的各種腎疾病的一條共同通道。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)高表達(dá)是腎間質(zhì)纖維化形成的中心環(huán)節(jié),Smads蛋白是TGF-β1家族信號從受體到核的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,TGF-β1/Smads信號通路是腎臟纖維化主要的最終的共同通路。BMP-7是重要的抗腎間質(zhì)纖維化因子,可通過影響TGF-β1/Smads通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、與TGF-β1存在互逆作用等多種途徑發(fā)揮抗腎纖維化作用。腎衰瀉濁丸是著名中醫(yī)學(xué)家張琪教授經(jīng)過長期臨床實(shí)踐總結(jié)的經(jīng)驗(yàn)方,通過臨床觀察證實(shí)能夠顯著改善腎功能,延緩CRF的進(jìn)展。本文通過觀察本方對CRF大鼠BMP-7/Smads/TGF-β1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響,以探討其對CRF的治療作用及抗腎間質(zhì)纖維化的機(jī)制。材料和方法1藥物、試劑與儀器腎衰瀉濁丸由大黃、草果仁、黃連等12味中藥組成,50g/瓶,由黑龍江省中醫(yī)研究院制劑室提供。尿毒清顆粒5g/袋,由廣州康臣藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。腺嘌呤50g/瓶,由美國Sigma公司生產(chǎn)。2pcr引物TGF-β1兔抗大鼠多克隆抗體,Smad6兔抗大鼠多克隆抗體,BMP-7兔抗大鼠多克隆抗體,購自武漢博士德公司。PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。TGF-β1上游引物:5′-CTTTAGGAAGGACCTGGGTT-3′,下游引物:5′-CAGGAGCGCACAATCATGTT-3′;β-actin為內(nèi)參,上游引物:5′-CACGGCATTGTAACCAACTG-3′,下游引物:5′-TAATGTCACGCACGATTTCC-3′。3腺點(diǎn)誘導(dǎo)crf大鼠腎組織檢測雄性Wister成年大鼠68只,體重200～250g,由沈陽雙義嚙齒類實(shí)驗(yàn)動物中心提供,微生物控制等級:一級。隨機(jī)取8只正常大鼠作為空白對照組,給予等量蒸餾水灌胃,其余大鼠給予2.5%腺嘌呤混懸液按250mg·kg-1·d-1灌胃,連續(xù)給藥14d,之后改為125mg·kg-1·d-1,連續(xù)給藥14d,給藥過程中大鼠共死亡8只。第29天,采用眶底靜脈叢取血0.8～1ml,測血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)值后,隨機(jī)處死空白對照組大鼠2只,腺嘌呤灌胃大鼠10只,取大鼠腎組織做Masson染色,證實(shí)腺嘌呤誘導(dǎo)CRF大鼠模型制作成功。將剩余42只CRF大鼠隨機(jī)分為5組,其中模型組9只,尿毒清對照組9只,腎衰瀉濁丸低劑量組(簡稱低劑量組)、腎衰瀉濁丸中劑量組(簡稱中劑量組)和腎衰瀉濁丸高劑量組(簡稱高劑量組)各8只。4單次用藥劑量d-1,低劑量者實(shí)行2/2的灌胃管理模型制作結(jié)束后,分別采用腎衰瀉濁丸和尿毒清進(jìn)行治療。中劑量組為臨床等效組,按1.58g·kg-1·d-1灌胃,濃度為15.8%;低劑量組為其1/2,按0.79g·kg-1·d-1灌胃,濃度為7.9%;高劑量組為其2倍,按3.16g·kg-1·d-1灌胃,濃度為31.6%。尿毒清組按1.81g·kg-1·d-1灌胃,濃度為20%。空白對照組、模型組給予同體積蒸餾水灌胃,共治療60d。5免疫組織表達(dá)BUN采用酶法,Scr采用苦味酸法檢測;腎臟病理切片做Masson染色于光鏡下觀察。采用免疫組織化學(xué)法檢測腎組織中的TGF-β1,Smad6,BMP-7,BMP-7RⅡ的蛋白表達(dá);采用WesternBlot法檢測腎組織內(nèi)的Smad6,BMP-7蛋白的表達(dá),采用半定量RT-PCR檢測腎組織內(nèi)TGF-β1mRNA的表達(dá)水平。6實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以(xˉ±s)(xˉ±s)表示,兩兩比較用q檢驗(yàn),多組間比較用方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1治療后bun治療過程中,模型組死亡2只,尿毒清組和高劑量組各死亡1只,共死亡4只。治療后,各治療組BUN,Scr與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。中劑量組與尿毒清組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說明腎衰瀉濁丸能夠降低大鼠血清BUN、Scr水平,改善腎功能。見表1。2腎病理改變2.1不同劑量各組小鼠肝腎組織病理學(xué)檢查空白對照組:腎組織無病理改變,腎小球、腎小管無異常,小管管腔無結(jié)晶物沉積,腎間質(zhì)無異常改變。模型組:腎小管萎縮,上皮細(xì)胞變性、壞死,可見較多異物肉芽腫形成。棕黃色結(jié)晶占據(jù)整個(gè)腎小管,少部分未被結(jié)晶沉積的小管呈代償性擴(kuò)張。尿毒清組:腎小管上皮細(xì)胞顆粒變性,腔內(nèi)可見管型形成;腎小管內(nèi)棕黃色結(jié)晶物沉積較多見,結(jié)晶物占據(jù)整個(gè)管腔,腎間質(zhì)少量炎癥細(xì)胞浸潤。低劑量組:腎小管上皮細(xì)胞顆粒變性不明顯,小管代償性擴(kuò)張,腎小管間質(zhì)內(nèi)棕黃色結(jié)晶沉積較模型組少見,腎間質(zhì)少量炎癥細(xì)胞浸潤。中劑量組:腎小管內(nèi)棕黃色結(jié)晶沉積偶見,腎間質(zhì)極少量炎癥細(xì)胞浸潤。高劑量組:腎小管上皮細(xì)胞顆粒變性,腔內(nèi)可見管型形成;腎小管內(nèi)棕黃色結(jié)晶物沉積較多見,結(jié)晶物占據(jù)整個(gè)管腔,腎間質(zhì)大量炎癥細(xì)胞浸潤。見圖1。2.2各組治療前后肝腎組織病理學(xué)檢查正常腎組織染色主要位于基底膜、包曼氏囊、系膜區(qū)和腎小管間的毛細(xì)血管周圍,腎小管未見萎縮,腎間質(zhì)無炎癥細(xì)胞浸潤及纖維化。模型組腎小管片狀萎縮、可見管腔閉塞,腎間質(zhì)片狀炎癥細(xì)胞浸潤,纖維組織片狀增生。治療后各治療組腎小管間質(zhì)病變減輕,中劑量組腎小管小灶狀萎縮,腎間質(zhì)極少量炎癥細(xì)胞浸潤,纖維組織增生成小灶性、少量分布。尿毒清組和低劑量組腎小管局灶狀萎縮,腎間質(zhì)少量炎癥細(xì)胞浸潤,纖維組織局灶狀增生。高劑量組腎小管多灶狀萎縮,腎間質(zhì)大量炎癥細(xì)胞浸潤,纖維組織多灶狀增生。見圖2。3smad6、bmp-7的蛋白表達(dá)由圖3及表3可見,Smad6與BMP-7的蛋白表達(dá)趨勢一致。各治療組與模型組相比,Smad6、BMP-7的蛋白表達(dá)極顯著增多(P<0.01);中劑量組與尿毒清組相比,Smad6、BMP-7的蛋白表達(dá)極顯著升高(P<0.01)。4腎衰瀉濁丸對mtgf-2mrna表達(dá)的影響mRNA表達(dá)水平的影響由圖4及表4可見,治療后,治療各組與模型組比較,TGF-β1mRNA表達(dá)水平極顯著減弱(P<0.01);中劑量組與尿毒清組比較,TGF-β1mRNA表達(dá)水平顯著減弱(P<0.05),說明腎衰瀉濁丸能減少TGF-β1mRNA的表達(dá)。電泳強(qiáng)度比較顯示:空白對照組<中劑量組<低劑量組<尿毒清組<高劑量組<模型組?？鼓I間質(zhì)纖維化慢性腎衰竭是指所有原發(fā)性或繼發(fā)性慢性腎臟疾患所致的進(jìn)行性腎功能損害所出現(xiàn)的一系列癥狀和代謝紊亂組成的臨床綜合征,是各種慢性腎臟疾病發(fā)展的最終階段。其病理變化是腎臟的纖維化,包括腎小球的硬化和腎間質(zhì)的纖維化。各種原因引起的慢性腎功能損傷與腎間質(zhì)纖維化的相關(guān)程度,較腎小球病變更為密切,腎間質(zhì)纖維化是預(yù)測腎臟病情的重要指標(biāo),對腎病的預(yù)后有著重要的影響,抗腎間質(zhì)纖維化防治CRF的重要地位已取得公認(rèn)。細(xì)胞因子在腎間質(zhì)纖維化發(fā)展過程中起著重要作用,它們通過與靶細(xì)胞膜上的受體相結(jié)合通過各自的傳導(dǎo)通路,將指令傳到靶基因產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。影響腎間質(zhì)纖維化的細(xì)胞因子可以分為促腎間質(zhì)纖維化因子如TGF-β1和抗腎間質(zhì)纖維化因子如BMP-7等。TGF-β是目前已知細(xì)胞因子中最重要的調(diào)節(jié)因子,是受到各種外源性刺激后組織發(fā)生纖維化的最關(guān)鍵因子,其中的TGF-β1是眾多因子發(fā)揮作用的中心環(huán)節(jié)。TGF-β1及其介導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化與腎間質(zhì)纖維化關(guān)系密切。TGF-β1高表達(dá)是腎間質(zhì)纖維化形成的中心環(huán)節(jié)。Smads蛋白是TGF-β1家族信號從受體到核的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,是目前所知的唯一受體的胞內(nèi)激酶底物。Smad6為抑制性Smad,是TGF-β1信號通路負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子,可以抑制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。BMP-7不僅是重要的抗腎間質(zhì)纖維化因子,可通過多種途徑發(fā)揮抗腎纖維化作用;同時(shí)作為TGF-β超家族成員中最大的一族,可通過增加Smad6表達(dá)等途徑,影響TGF-β1/Smads通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo),抑制腎纖維化的進(jìn)展;且與TGF-β1存在互逆作用,可多方面抵消TGF-β1的促腎纖維化作用。在各種腎臟疾病模型中,BMP-7治療具有維持腎組織結(jié)構(gòu)和功能的重要作用。應(yīng)用BMP-7治療糖尿病腎病大鼠,則可部分逆轉(zhuǎn)腎臟肥大,恢復(fù)腎小球?yàn)V過率,降低蛋白尿,明顯改善腎小球病理改變,降低局灶性節(jié)段性腎小球硬化。通過輸尿管逆向注入含有BMP-7重組腺病毒可使腎間質(zhì)纖維化大大降低,為抑制腎間質(zhì)纖維化開辟了一條嶄新的途徑。BMP-7通過以下途徑影響TGF-β1/Smad信號傳導(dǎo):BMP-7與其Ⅱ型受體結(jié)合后再與Ⅰ型受體結(jié)合,而使Ⅰ型受體發(fā)生磷酸化。Ⅰ型受體被磷酸化后,作用于Smad1或Smad5竣基端末端的2個(gè)絲氨酸,使之磷酸化,隨后Smad1或Smad5再與Smad4結(jié)合成復(fù)合體,移位到細(xì)胞核內(nèi),再作用于特定基因的啟動子,引起相應(yīng)生物學(xué)效應(yīng),如使Smad6表達(dá)增加等。體外實(shí)驗(yàn)表明,BMP-7在近曲小管上皮細(xì)胞中能增加Smad6表達(dá),而Smad6抑制TGF-β1的信號傳導(dǎo),抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄。BMP-7在近曲小管上皮細(xì)胞的抗炎癥和細(xì)胞保護(hù)作用,與上調(diào)Smad6表達(dá)密切相關(guān)。腎衰瀉濁丸是根據(jù)中晚期CRF濕濁化熱,濕熱內(nèi)蘊(yùn),郁久成毒的病機(jī)特點(diǎn)研制而成。方中大黃為君;臣以黃芩、黃連清熱解毒,通腑瀉濁;草果仁、藿香、蒼術(shù)芳香化濕亦為臣藥,砂仁、陳皮、紫蘇行氣健脾祛濕,和胃降逆止嘔,助君藥瀉濁;佐以半夏開痞止嘔,干姜防苦寒傷胃。共奏清熱解毒,祛濕化濁之功。方中藥物大多具有抗血小板聚集,抗血栓形成;擴(kuò)張血管,改善微循環(huán);降血脂,抗脂質(zhì)過氧化等作用,能夠減輕腎臟的損傷。實(shí)驗(yàn)證明,腎衰瀉濁丸能明顯降低慢性腎衰竭大鼠尿素氮、肌酐水平;改善腎小管-間質(zhì)病理變化;上調(diào)腎組織中Smad6、BMP-7的表達(dá),降低TGF-β1的表達(dá)。說明腎衰瀉濁丸可以減輕慢性腎衰竭大鼠的腎功能損傷及腎小管及間質(zhì)損害,推測腎衰瀉濁丸可能是通過上調(diào)慢性腎衰竭大鼠腎組織中BMP-7、Smad6的表達(dá),下調(diào)TGF-β1的表達(dá),從而抑制了TGF-β1信號向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的通路;腎衰瀉濁丸通過影響B(tài)MP-7/Smads/TGF-β1信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)而減輕腎間質(zhì)纖維化可能是其延緩慢性腎衰竭進(jìn)展的機(jī)制之一。本實(shí)驗(yàn)中腎衰瀉濁丸中劑量組為臨床等效劑量組,低劑量組的劑量為其二分之一,高劑量組的劑量為其2倍。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示中劑量組療效最好,其次為低劑量組,而高劑量組的治療效果與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,效果最差?？梢娔I衰瀉濁丸的療效雖隨著用藥劑量的減少而減效,但當(dāng)超過臨床合理用量時(shí),并未隨著用藥劑量的增加而增加。分析其原因,可能與腎衰瀉濁丸的作用機(jī)制有關(guān)。該藥主要是通過調(diào)整脾胃功能,增加大便次數(shù),軟化便質(zhì),使大