不同藥物降壓對腎性高血壓大鼠imd基因表達的影響

不同藥物降壓對腎性高血壓大鼠imd基因表達的影響

1imd在高血壓心肌組織及病理生理中的作用中介素（imd）是roh和geti發(fā)現(xiàn)的相同物質，屬于減少鈣基因（cacliman）相關的基因（calciman）家族的成員。imd磁共振成像可廣泛存在于中樞神經和周圍器官。IMDmRNA在異丙腎上腺素誘導的肥厚心肌中表達增加,有報道給自發(fā)性高血壓大鼠(Spontaneoushypertensiverat,SRH)持續(xù)、大劑量地靜脈注入IMD,可降低平均動脈壓和抑制心肌功能、減輕心肌肥厚,所以人們推測IMD在高血壓肥厚心肌細胞中代償性的升高,并具有降壓擴血管作用和改善心肌肥厚的作用。在一氧化氮合酶抑制劑誘導的壓力超負荷模型的左室心肌細胞中,IMD及其受體成分(CLR、RAMP1,RAMP2,RAMP3)表達均明顯上調,應用肼屈嗪和或氫氯噻嗪使收縮壓恢復正常后,CLR、RAMP2,RAMP3的表達恢復正常,但IMD和RAMP1仍然高表達,同時心肌厚度也未恢復正常,說明在此種高血壓動物模型中,IMD在高血壓心肌肥厚的病理生理過程中發(fā)揮重要作用,IMD的作用與心肌壓力超負荷無關。但是這未能證明在所有的高血壓動物模型中IMD變化規(guī)律,本實驗旨在研究腎血管性高血壓大鼠肥厚心肌中IMD表達的規(guī)律,及纈沙坦、氨氯地平和依那普利對此的干預作用。2材料和方法2.1動物高血壓的形成選用健康雄性SD大鼠(280～320g,四川省中醫(yī)藥研究所)。實驗前至少適應性籠養(yǎng)10d以上,室溫21℃,自由飲水和進食。用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(30mg·kg-1)。動物取右側臥位,暴露左腎區(qū),在左肋弓下距離脊柱0.5cm處作一切口,入腹膜后探出左腎,分離左腎動脈,將直徑為0.22mm的針灸針放置在左腎動脈上,用手術縫線結扎,抽出針灸針,縫合關閉創(chuàng)口,讓大鼠從麻醉狀態(tài)下蘇醒。假性手術組分離左腎動脈,僅用手術縫線繞過,不予結扎,余下操作與以上模型組相同。以術后血壓超過140mmHg時即確定動物高血壓形成,并用于藥物實驗。所有動物術后飼養(yǎng)于清潔級動物實驗室,自由取食與飲水。2.2尾動脈血壓測定采用RBP—III型大鼠血壓心率儀(中日友好醫(yī)院),應用標準尾套法在大鼠清醒狀態(tài)下測定尾動脈血壓。測量前大鼠在預熱箱中34℃下預熱10～15min。測量時間設置在每天上午8∶00-12∶00,每只至少測定3次,取3次結果的平均值作為血壓數(shù)值。在術后第1個月每周至少測定血壓一次,以后2周測定血壓1次。2.3藥物干預及給藥劑量以收縮壓≥140mmHg為標準造模,成功后隨機分組成五組:(1)單純不完全結扎左側腎動脈(renalarteryconstructiongroup,RAC,n=8);(2)不完全結扎左側腎動脈+纈沙坦組(Valsartangroup,Val,n=7);(3)不完全結扎左側腎動脈+氨氯地平組(Amlodipinegroup,Aml,n=7);(4)不完全結扎左側腎動脈+依那普利組(Enalaprilgroup,Ena,n=8);(5)假性手術組(Shamoperationgroup,So,n=6)。以上藥物干預組于術后第5周開始,每周測量動物體重,開始給第2組纈沙坦30mg/(kg·d)),第3組氨氯地平5mg/(kg·d),第4組依那普利20mg/(kg·d),每組均每日給藥1次,連續(xù)給藥10周。各組藥物劑量的選擇參照文獻,此劑量已被證實可降低腎性高血壓大鼠的血壓,并抑制左室心肌肥厚。以上各組分籠喂養(yǎng),藥物分別溶于蒸餾水中通過胃管灌飼給藥。假手術對照組及高血壓對照組給予同等容積的溶劑。對那些被不完全結扎但在術后第4周末血壓仍未升高的大鼠,將在給藥前從藥物實驗中剔除。在給藥時間結束之時,再次測量動物體重和血壓。2.4go-dt/dt的制備MMLV逆轉錄酶及dNTP、Tag酶、Oligo(dT)15primer、擴增的寡核苷酸引物均由上海生工生產,日本產OLYMPUS顯微鏡;顯微鏡目鏡測微尺系上海第三光學儀器廠產品。2.5心肌細胞橫徑檢測開胸摘取心臟在預冷(0～4℃)的DEPC處理的水中洗去心腔中殘血,用濾紙(DEPC處理)將心臟表面水吸干,剪去左右心房及右心室,即所得左心室,計算左心室質量指數(shù)(mg/g)=左心室重量/體重。稱重后取兩份,一份固定在4%多聚甲醛中過夜,行常規(guī)石蠟包埋,以用作心肌細胞橫徑的測量;另一份用于左心室IMDmRNA的測定。2.6心肌細胞橫徑檢測沿冠狀面于心臟最大橫徑處分別切取約3mm厚的左室游離壁心肌,常規(guī)制作HE切片。在蘇木精(Hatmatoxylin)-伊紅(Eosin)染色(HE)切片上,用顯微鏡目鏡測微尺測量左室心肌細胞橫徑(Leftventriculartransectiondiameter,VTDM)每張切片先在低倍鏡下觀察左室游離壁,然后高倍鏡下(10×40)在心肌縱斷面隨機選取20個胞漿橫紋清晰、胞核完整、形狀規(guī)則的心肌細胞,應用SPOTVERSION4.6顯微圖像分析軟件測量有核處橫徑,取其均值為該例的LVTDM。2.7pcr擴增產物的表達心肌組織總RNA提取和IMDmRNA的測定用Trizol一步法提取上述所剩余心肌組織總RNA、MMLV逆轉錄酶及Oligo(dT)15primer逆轉錄成單鏈cDNA。PCR反應體系25μl:cDNA1μl、IMDprimerF0.5μl,IMDprimerR0.5μl,2.5mmol/ldNTP2μl,TagDNA聚合酶0.2單位,2.5mmol/LdTNP1μl,含15mmol/LMgCl2的10×PCR緩沖液2.5μl,反應條件:94℃變性5min,然后94℃30s,55℃30s,熱循環(huán)30次,72℃40s。取1μlcDNA產物,以β-actin為引物,反應條件為:94℃變性5min,然后94℃30s,55℃30s熱循環(huán)24次,72℃40s。PCR擴增產物檢測(半定量RT-PCR):RT-PCR擴增產物在0.8%瓊脂糖凝膠上經100V恒壓電泳30min后,溴乙錠染色后取出該凝膠,在凝膠分析系統(tǒng)上拍照,定量掃描儀分別獲得376bp和446bp條帶,分析各樣本擴增條帶的光密度值,將各目的基因擴增條帶的光密度數(shù)據(jù)分別與β-actin基因的光密度數(shù)據(jù)相比得出各樣本的光密度相對比值,即為IMDmRNA的相對含量。IMDmRNAPCR反應條件(見表1)。2.8b分析結果采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件(SPSSforWindows13.0)對所得數(shù)據(jù)進行分析,各組數(shù)值以均數(shù)±標準差(xˉ±s)(xˉ±s)表示。組間比較采用單因素方差(One-wayANOVA)分析,Student-Newman-Keuls(SNK)方法檢驗,P<0.05為差異有顯著性。3結果3.1心率變化情況取樣前Val組、Aml組和Ena組體重較RAC組明顯升高(P<0.05),并較So組明顯降低(P<0.05)。心率各組無差異(P=0.110),取樣前與結扎前無差異。各組結扎前血壓無差異,取樣前單純結扎組收縮壓較結扎前明顯升高,用藥組收縮壓較單純結扎組明顯減低,但較假手術組仍明顯升高,三個用藥組組間血壓無統(tǒng)計學差異(見表2)。3.2各組心肌細胞橫徑的比較心肌細胞橫徑(LVTDM)的變化顯示RAC較其它4組心肌細胞橫徑顯著增大,Ena組、Val組和Aml組組間無差異且顯著高于So組(見圖1和表3)。3.3各組大鼠心肌橫徑的比較圖2縱坐標顯示IMDmRNA電泳的條帶與β-action光密度比值測定所得數(shù)值,橫坐標顯示不同組別。左心室IMDmRNA在單純結扎組較對照組和三個藥物干預組均顯著性升高(P<0.01),三個藥物干預組之間兩兩比較無差異(P=0.810),三者又均較對照組顯著性升高(P<0.01)(見圖2、表3)。表3說明左心室心肌橫徑在單純不完全結扎組(RAC)均較其它各組有顯著性增加(P<0.01),Val組、Aml和Ena組組間無差異(P=0.622),且顯著高于So組(P<0.05)。左心室質量指數(shù)在單純不完全結扎組(RAC)均較其它各組有顯著性增加(P<0.01),Val組、Aml和Ena組間無顯著性差異(P=0.263),So組較Val組、Aml和Ena組顯著性降低(P<0.05)。3.4mdmrna泳帶第一列為DNAMarker,其后五列上排為標準β-actin泳帶,下排為左心室肌IMDmRNA泳帶。顯示左心室IMDmRNA在So組較其它組顯著性升高(P<0.01),Val組、Ena組和Aml組均較對照組顯著性升高(P<0.01),Val組、Ena組和Aml組之間無差異(P=0.767),So組的電泳條帶幾乎不顯像(見圖3)。4腎性高血壓大鼠心肌imd的變化IMD是2003年Roh等發(fā)現(xiàn)的一種CGRP家族中的多肽,在血管、左心室甚至在心房、右心室和血清均有低水平的表達,具有降壓、擴血管、心臟保護等作用。已有人用RT-PCR半定量的方法在新生心肌和異丙腎誘導的肥大心肌細胞中測到了IMDmRNA,而正常心肌細胞中無表達;又有人持續(xù)、大劑量地給離體自發(fā)性高血壓大鼠(SRH)靜脈注入IMD,可降低平均動脈壓和抑制心肌功能、減輕心肌肥厚,這說明IMD是一個新發(fā)現(xiàn)的對心肌肥厚起代償性保護機制的內生性因子。袁鷹等發(fā)現(xiàn),SHR心肌和主動脈的IMDmRNA水平上調。還首次用放射免疫(RIA)法測定發(fā)現(xiàn)IMD在自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)時血漿、心肌和主動脈中的含量升高。但是SHR組大鼠組的血漿中的IMD含量和收縮壓呈顯著負相關,對照組WistarKyoto(WKY)大鼠組則呈顯著正相關。這說明機體在正常生理狀態(tài)下,血壓是受血漿IMD水平調控的,這是一種代償性增高。而在高血壓狀態(tài)下,由于調節(jié)通路的障礙及機體的某種器官損傷導致了這種代償性反應處于失衡狀態(tài),從而導致了IMD出現(xiàn)了絕對或相對不足,且伴隨著血壓的升高和病理損傷過程的加重,使得這種失代償狀態(tài)更加嚴重,從而出現(xiàn)了血壓越高,而IMD血漿含量越低的負相關。為了解腎性高血壓大鼠IMD的變化規(guī)律,本實驗中應用腎動脈結扎造腎性高血壓模型,用左心室游離壁心肌橫徑和心肌質量指數(shù)來衡量左心室肌肥厚,發(fā)現(xiàn)單純結扎組大鼠心肌橫徑和心肌質量指數(shù)較其他組顯著增加,表明腎性高血壓大鼠心肌肥厚模型建立成功。實驗發(fā)現(xiàn)三種降壓藥物組可以相似地減輕心肌肥厚,左心室IMDmRNA在單純結扎組較其他組顯著性升高,三個藥物干預組較單純結扎組降低且組間無差異,由于選用的三種藥物從不同機理降壓,其中纈沙坦為ARB(血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑),由于抑制了血管緊張素Ⅱ-1受體(AT-1)反饋性地升高血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ),并降低左心室醛固酮(Aldosterone,ALD)水平;依那普利為血管緊張素轉換酶抑制劑(Angiotensin-convertingenzymeinhibitor,ACEI),抑制了腎素血管緊張素轉化酶,使AngⅡ產生減少,也降低左心室ALD水平;氨氯地平作為鈣拮抗劑是擴血管劑,對RAAS的影響很小。可見心肌中IMDmRNA的變化與血壓或左心室肌肥厚有關,而與干預RAAS的不同環(huán)節(jié)無關,即心肌IMDmRNA的變化獨立于RAAS的變化。本實驗為首次發(fā)現(xiàn)腎性高血壓大鼠(包括單純結扎組和藥物干預組)肥厚心肌中IMDmRNA系統(tǒng)上調,IMD的上調可能參與了腎性高血壓大鼠左心室肥大的病理生理過程,藥物干預組纈沙坦、氨氯地平和依那普利都可以使上調的IMDmRNA部分恢復,由于同時使高血壓和心肌厚度得到相似的改善,即三組比較無差異,所以IMDmRNA的變化是由于三組藥物降低了血壓還是改善了心肌肥厚還不清楚。Bell等也發(fā)現(xiàn)肥厚心肌中IMD上調,且血壓降至正常后恢復正常。他們給一氧化氮合酶抑制劑誘導的高血壓、心肌缺血大鼠應用阿替洛爾或硝苯地平,使血壓降至正常,同時可使NO缺乏的心肌細胞中上調的AM、IMD及二者的受體成分恢復正常,說明壓力負荷和缺血都參與了刺激心肌肥厚,并誘導了這些相關調節(jié)肽及受體的上調。但另有研究卻有相反的結論:IMD的作用與心肌壓力超負荷無關。Bell和Zhao又在另一個一氧化氮合酶抑制劑誘導的壓力超負荷模型的左室心肌細胞中發(fā)現(xiàn),IMD及其受體成分表達均明顯上調,應用肼屈嗪和或氫氯噻嗪使收縮壓恢復正常后,但IMD仍然高表達,同時心肌厚度也未恢復正常,與本研究不同點是利尿劑不能完全逆轉壓力超負荷模型的左室心肌細胞的心肌肥厚,并且也不能下調左室心肌細胞中IMD,即IMD的上調不因高血壓降低而恢復